3. Vector biểu hiện gen trong vi khuẩn
3.4.2.Các kiểu cài nhập vào B subtilis
Có hai phƣơng pháp cài nhập gen ngoại lai vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn
B. subtilis:
o Phƣơng pháp trao đổi chéo đơn (single crossover)
Giữa plasmid và nhiễm sắc thể chỉ có một trình tự tƣơng đồng thì plasmid và nhiễm sắc thể của B. subtilis có thể xảy ra trao đổi chéo đơn theo cơ chế Campell nhƣ hình 1.10 [11, 33, 35].
Hình 1.10. Mô hình trao đổi chéo đơn (single crossover) minh họa việc sử dụng một vector cài nhập cơ bản để xây dựng một đột biến knockout trong một
khung đọc mở (orfA) [11]
o Phƣơng pháp trao đổi chéo kép (double crossover)
Giữa plasmid và nhiễm sắc thể của B. subtilis có hai trình tự tƣơng đồng thì có thể xảy ra trao đổi chéo kép tạo ra một cassette cài nhập trên nhiễm sắc thể của
25
Hình 1.11. Mô hình trao đổi chéo kép (double crossover) minh họa việc sử dụng một vector cài nhập (ectopic integration vector) để chèn một khung đọc mở (orfA) vào
trong vị trí đích trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn B. subtilis [11]
Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu về tách dòng và bƣớc đầu biểu hiện enzyme ngoại bào trong B. subtilis. Báo cáo của Quyền Đình Thi và cộng sự năm 2008 về “Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa β-galactosidase từ chủng B. subtilis G1” trong hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV đã dùng vector pJET 1 nhân dòng thành công gen mã hóa cho β-galactosidase [6]. Nguyễn Thị Vân Anh và cộng sự (năm 2011) đã biểu hiện streptavidin trên bề mặt bào tử B. subtilis với mục đích sử dụng nó nhƣ một chất mang “đa dụng” nhờ khả năng gắn vào phân tử đƣợc biotinyl hóa để hy vọng bào tử này sẽ có khả năng “chuyên chở” các kháng nguyên của vi sinh vật, các enzyme, các kháng thể để phục vụ cho các mục đích phân tích hay ứng dụng khác nhau. Đó là một hƣớng nghiên cứu mới tại Việt Nam [14]. Nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Ân và cộng sự (2009) tạo chế phẩm B. subtilis tái tổ hợp biểu hiện α-inteferon của gà. Đoạn chèn có mang đoạn promoter và đoạn DNA mã hóa cho protein cotB (59 kDa) nằm trên lớp vỏ bào tử. Sau đó đoạn chèn đƣợc ghép với đoạn chlFNa trong vector pGemT tạo nên đoạn cotB13-chlFNa. Tiếp theo đoạn cotB13-chlFNa đƣợc đƣa vào vector pDG364 và cài nhập vào B. subtilis. Kết
26
quả là chủng B. subtilis tái tổ hợp đƣợc tạo ra có đoạn cotB13-chlFNa tại vị trí gen
amyE, kháng chloramphenicol và không sản xuất amylase [1]. Nghiên cứu của Trần Linh Thƣớc và cộng sự (năm 2008) tạo insulin từ mini-proinsulin (MPI) tái tổ hợp đƣợc biểu hiện dạng tiết ở B. subtilis. Đoạn DNA đƣợc khuếch đại bằng PCR mang gen mã hóa decahistidine-miniproinsulin (10xHis-MPI) với peptide tín hiệu tiết của gen amyQ trong plasmid pHT43 tạo plasmid tái tổ hợp pHAI. Các chủng B. subtilis
B1012/pHAI, DB104/pHAI và WB800N/pHAI đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng Luria-Bertani (LB) và cảm ứng với 1 mM IPTG. Kết quả cho thấy chủng B. subtilis
B1012/pHAI có hiệu quả tiết cao nhất với tốc độ tổng hợp 10xHis-MPI khoảng 2,31 µg/ml/giờ và chiếm 38,5% tổng protein đƣợc tiết ra môi trƣờng. Nhƣng các nghiên cứu này tại Việt Nam mới chỉ dừng lại ở việc nghiên cứu biểu hiện một số protein ngoại lai trên bề mặt của bào tử B. subtilis hoặc biểu hiện gen trong vi khuẩn này bằng cách sử dụng chất cảm ứng IPTG và vẫn chƣa có công trình nào công bố về việc biểu hiện gen trong tế bào sinh dƣỡng của vi khuẩn B. subtilis mà không sử dụng chất cảm ứng. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu: “Biểu hiện β-galactosidase trong vi khuẩn B. subtilis” nhằm mở rộng phạm vi ứng dụng của vi sinh vật an toàn này trong cả lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu ứng dụng tại Việt Nam.
27
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP