Đề tài Tìm và phân loại các ncRNA có trong vi khuẩn Bacillus Subtilis

GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ Đề tài: Tìm phân loại ncRNA có vi khuẩn Bacillus Subtilis SVTH: Trang GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ Lý chọn đề tài Từ năm 60, khái niệm ncRNA (non coding RNA) lần biết đến Trong năm năm gần đây, với phát triển vượt bậc công nghệ sinh học, việc nghiên cứu ncRNA đạt nhiều thành tựu đáng kể Hơn nữa, đời tin sinh học trở thành công cụ đắc lực để hỗ trợ Tuy nhiên, lĩnh vực mẻ, cần đầu tư nghiên cứu Do chọn đề tài:” Tìm phân loại ncRNA có vi khuẩn Bacillus Subtilis” SVTH: Trang GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ Mục lục CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ NON-CODING RNA CÓ TRONG VI KHUẨN 1.1 Khái niệm non-coding RNA có vi khuẩn: 1.1.1 Khái niệm: 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu: 1.1.3 Chức năng: 1.2 Một số loại non-coding RNA điển hình chức sinh học: 1.2.1 Long non-coding RNA (long ncRNA): 1.2.1.1 Khái niệm: 1.2.1.2 Chức năng: 1.2.2 Small interfering RNA: 10 1.2.2.1 Khái niệm trình sinh tổng hợp: 10 1.2.2.2 Cấu trúc chế hoạt động siRNA: 11 1.2.2.3 Chức năng: 11 1.2.3 Small ncRNA: 12 1.2.3.1 Khái niệm: 12 1.2.3.2 Một số loại small RNA chức chúng: 12 CHƯƠNG 2: PHÂN LOẠI, CHỨC NĂNG SINH HỌC CỦA CÁC ncRNA CÓ TRONG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 17 2.1 SVTH: Tổng quan vi khuẩn Bacillus Subtilis: 17 2.1.1 Lịch sử phát triển: 17 2.1.2 Đặc điểm phân loại: 17 2.1.3 Đặc điểm phân bố: 17 Trang GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ 2.1.4 Đặc điểm hình thái: 18 2.1.5 Đặc điểm sinh hóa: 18 2.1.6 Vai trò vi khuẩn B.Subtilis 19 Phân loại chức số small RNA vi khuẩn 2.2 Bacillus.Subtilis: 20 2.2.1 RNA 6S: 21 2.2.1.1 bsrA: 22 2.2.1.2 bsrB: 23 2.2.2 tmRNA (ssrA): 25 2.2.3 RNA tế bào chất (small cytoplasmatic RNA): 28 2.2.4 RNA điều hòa: 29 2.2.4.1 FsrA: 29 2.2.4.2 RatA: 32 2.2.4.3 sr1: 33 2.2.5 2.3 Các small RNA chưa rõ chức năng: 35 Phương pháp phát ncRNA: 37 2.3.1 Phương pháp thực nghiệm: 37 2.3.2 Phương pháp tin sinh học: 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO: 39 CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 3.1 3.1.1 Trên giới: 40 3.1.2 Ở Việt Nam: 40 3.1 SVTH: Tình hình phát triển: 40 Hướng nghiên cứu tương lai: 40 Trang GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ NON-CODING RNA CÓ TRONG VI KHUẨN 1.1 Khái niệm non-coding RNA có vi khuẩn: 1.1.1 Khái niệm: Non-coding RNA (ncRNA) phân tử RNA chức năng, mà không mã hóa protein Nó còn gọi RNA không mã hóa protein ( non-protein-coding RNA, npcRNA), non-messenger RNA(nmRNA), RNA chức (fucntional- RNA, fRNA) Giới hạn small RNA(sRNAs) thường sử dụng cho ncRNA ngắn vi khuẩn Trình tự DNA mà từ ncRNA phiên mã thường gọi gen RNA - Non-coding RNA bao gồm RNA có tính phổ biến cao quan trọng, RNA thông tin (tRNA), RNA ribosome (rRNA), snoRNA, miRNA, siRNA, piRNA long ncRNA, bao gồm ví dụ gen Xist( X- inactive specific transcript)gen X bất hoạt phiên mã đặc biệt Hotair Số ncRNA mã hóa hệ gen người chưa biết rõ Tuy nhiên nghiên cứu gần lĩnh vực transcriptomic tin sinh học cho thấy tồn hàng ngàn ncRNA Kể từ nhiều ncRNA phát nhiên chưa kiểm chứng chức năng, chức 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu: RNA lần phát Friedrich Miescher vào năm 1868, đến năm 1939, RNA cho có liên quan đến tổng hợp protein Hai thập kỉ sau đó, Francis Crick phát RNA thành phần trung gian dịch mã Ông ta lí luận rằng, RNA thích hợp cho cặp base với phiên mã mRNA polypeptide tinh khiết Các ncRNA mô tả tRNA alanine tìm thấy nấm men bánh mì, cấu trúc công bố vào năm 1965 Để sản xuất mẫu tinh khiết SVTH: Trang GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ alanine tRNA, Robert W Holley sử dụng 140kg nấm men bánh mì thương mại để cung cấp cho 1g tinh khiết tRNA để phân tích - Tiếp theo ribosome RNA khám phá, URNA đầu năm 1980 Tiếp theo phát ncRNA với snoRNAs, Xist, CRISPR, nhiều Những bổ sung gần đáng ý bao gồm riboswitches miRNA Việc phát chế can thiệp có liên quan đến RNA giúp Craig C Mello Andrew Fire sau giành giải Nobel sinh lý học hay y học năm 2006 1.1.3 Chức năng: Non-coding RNA thuộc vài nhóm có liên quan đến nhiều trình tế bào Những ncRNA có vai trò quan trọng trung tâm, bảo tồn tất hầu hết sống tế bào ncRNA đặc biệt một vài loài có quan hệ chặt chẽ với Nhiều ncRNA bảo tồn cho hóa thạch phân tử di tích từ kỉ Luka giới RNA Các vai trò ncRNA: Vai trò ncRNA trình dịch mã:  Nhiều ncRNA số ncRNA bảo tồn cần thiết có liên quan phức tạp đến trình dịch mã  Ribosome có hạt ribonucleoprotein( rRNA liên kết với protein gọi tiền ribosome) Qua trình trưởng thành ribonucleoprotein chuyển từ nhân tế bào chất tạo thành ribosome đó) nơi diễn dịch mã tế bào  Ribosome bao gồm 60% rRNA Trong sinh vật nhân sơ chúng tạo thành từ ncRNA sinh vật nhân thực ncRNA Các rRNA đóng vai trò chất xúc tác cho trình dịch mã  Một tập hợp khác ncRNA, tRNA từ phân tử trung gian mRNA protein snoRNA hộp H/ACA hộp C/D ncRNA tìm thấy vi khuẩn cổ sinh vật nhân thực SVTH: Trang GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ  Enzyme Rnase MPN(là enzyme hoạt hóa ribonucleoprotein với vai trò khác sinh vật nhân thực) bị hạn chế sinh vật nhân thực Cả nhóm ncRNA liên quan đến phát triển rRNA  Ở vi khuẩn, RNA-vận chuyển-thông tin (transfer-messenger-RNA,tmRNA) RNP có liên quan đến giải cứu ribosome bị trì trệ (rescuing stalled ribosomes) ncRNA việc cắt intron nối exon (RNA splicing): xảy sinh vật nhân thực ncRNA việc điều hòa gen: Sự biểu hàng ngàn gen điều hòa ncRNAs Sự điều hòa xảy (cis) (trans):  Tác động ngoại sinh (trans-acting):  Ở sinh vật nhân thực: mức độ điều hòa biểu gen cao Một microRNA làm giảm mức độ biểu hàng trăm gen Cơ chế mà phân tử miRNA trưởng thành hoạt động thông qua phần bổ sung cho nhiều phân tử mRNA Chức miRNA giảm điều hòa biểu gen ncRNA Rnase P chứng minh ảnh hưởng đến biểu gen  Trong thể người, Rnase P cần thiết cho chép bình thường hiệu ncRNAs khác RNA polymeraseIII Chúng bao gồm gen tRNA, rRNA 5S , RNA SRP , U6 snRNA  ncRNAs vi khuẩn, RNA 6S liên kết đặc biệt với RNA polymerase holoenzyme chứa yếu tố đặc trưng sigma70 Sự tương tác ức chế biểu từ promoter phụ thuộc vào sigma70 pha tĩnh  Một ncRNAs khác vi khuẩn, OxyS RNA kiềm hãm cách liên kết với chuỗi Shine-Dalgarno OxyS RNA tạo để đáp ứng với stress oxy hóa Escherichia coli  Một nghiên cứu gần cho thấy có hoạt động phiên mã trình tự ncRNA có ảnh hưởng đến biểu gen Enzyme dịch mã RNA SVTH: Trang GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ polymerase II ncRNA cần thiết để tái tạo nhiễm sắc chất Schizosaccharomyces pombe(nấm)  Tác động nội sinh (cis-acting):  Một số ncRNA gắn vào đầu 5’UTRs gen mã hóa protein (protein coding gen) ảnh hưởng tới biểu chúng theo đường khác Chẳng hạn riboswitches ràng buộc trực tiếp lên phân tử mục tiêu nhỏ, ràng buộc mục tiêu ảnh hưởng đến hoạt động gen  Trình tự RNA dẫn đầu (RNA leader) tìm thấy đầu nguồn gen operons sinh tổng hợp amino acid Những nguyên tố RNA hình thành từ hai cấu trúc có vùng mã hóa chuỗi peptide ngắn giàu acid amino- sản phẩm cuối operon Một cấu trúc kết thúc (terminator) hình thành có dư thừa acid amin điều hòa di chuyển ribosome lên dẫn đầu phiên mã không bị cản trở Khi có thiếu hụt tRNA charged acid amin điều hòa, ribosome translating peptide dẫn đầu cấu trúc antitermination hình thành Điều cho phép RNA polymerase chép lại (transcribe) operon Các RNA dẫn đầu biết đến operon histidine, operon Leucine, operon Threonine operon Tryptophan ncRNA cấu trục nhiễm sắc thể: có sinh vật nhân thực ncRNA hệ gen phòng thủ (defense): CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) lặp lại tìm thấy DNA nhiều vi khuẩn vi khuẩn cổ Sự lặp lặp lại ngăn cách miếng đệm (spacers) có chiều dài tương tự Nó chứng minh miếng đệm bắt nguồn từ thể thực khuẩn sau giúp bảo vệ tế bào khỏi bị nhiễm trùng SVTH: Trang GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ 1.2 Một số loại non-coding RNA điển hình chức sinh học: 1.2.1 Long non-coding RNA (long ncRNA): 1.2.1.1 Khái niệm: Long non-coding RNA nhóm rộng lớn bao gồm RNA không mã hóa protein có kích thước lớn 200nucleotide Chức long non-coding RNA phân tử scaffold điều hòa sửa đổi histone ảnh hưởng đến chương trình ngoại di truyền (epigenetic) sản phẩm trình phiên mã (transcriptome) Biểu rối loạn điều hòa (dysregulated) long non-coding RNA cho thấy có liên quan đến loạt khuyết tật (defect) phát triển bệnh (diseases) Nghiên cứu mô hình biểu long non-coding RNA phương pháp quan trọng hiểu biết vai trò chúng nhiều nhiều hệ thống mô hình (Epigenetic hiểu thay đổi có tính hợp tác di truyền mặt kiểu hình trình không liên quan đến thay đổi trình tự DNA.) 1.2.1.2 Chức năng: Chưa có thông tin cụ thể (trong vi khuẩn) Sự điều hòa mã S cerevisiae, vi khuẩn thực vật thực lnc RNA antisense Như thế, nấm men, vi khuẩn, thực vật người chung chế điều khiển mã lncRNA không phụ thuộc siRNA Ngày nay, nhiều chức long non-coding RNA tìm thấy truyền tín hiệu(signaling), phục vụ mồi nhử phân tử (molecullar decoys), dẫn hướng (guiding) phức hợp ribonucleoproein đến vùng nhiễm sắc đặc biệt tham gia scaffolds việc tái tạo (formation) phức hợp Truyền tín hiệu: phiên mã vài lnRNA định nhanh khoảng thời gian cụ thể Sự biểu chúng có phản ứng với kích SVTH: Trang GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ thích (stimuli), chẳng hạn căng thẳng tế bào nhiệt độ Vì vậy, lncRNA dùng tín hiệu phân tử hoạt động phân tử đánh dấu (markers) of functionally significant biological events Các loại mồi phân tử hoạt động diễn lncRNA cụ thể chép, sau gắn vào yếu tố protein Mồi nhử lncRNA yếu tố protein “sponge”như yếu tố phiên mã điều chỉnh (modifiers) nhiễm sắc chất Điều dẫn đến thay đổi lớn sản phẩm sau phiên mã tế bào Các lncRNA dẫn hướng phân tử localizing phức hợp ribonucleoprotein đặc biệt tới ác mục tiêu nhiễm sắc chất cụ thể Hoạt động gây thay đổi biểu gen cis (các gen lân cận) trans (các gen nằm xa gen) mà dự đoán dễ dàng trình tự lncRNA Lắp ráp phức hợp protein phức tạp hỗ trợ lnRNA, yếu tố liên kết với để hình thành chức Một số lncRNA sở hữu domain khác liên kết yếu tố protein khác hoàn toàn, ảnh hưởng đến kích hoạt kìm hãm phiên mã 1.2.2 Small interfering RNA: 1.2.2.1 Khái niệm trình sinh tổng hợp: Small interfering RNA (RNA can thiệp kích thước nhỏ) RNA nhỏ hình thành từ RNA sợi đôi Là lớp phân tử RNA sợi đôi, chiều dài khoảng 2025 nucleotide siRNA đóng nhiều vai trò, đáng ý đường can thiệp RNA (RNAi), nơi mà can thiệp với biểu gen cụ thể với trình tự nucleotide bổ sung Ở sinh vật nhân thực: Hiện tượng RNAi lần khám phá giun tròn Caenorhabditis Elegans câm lặng gen RNA sợi đôi Theo sau nghiên cứu Guo Kemphues phát RNA sợi đối mã (antisense) sợi mã hóa (sense) có hiệu ức chế biểu gen Sau Fire cộng tập trung dùng antisenseRNA để ức chế biểu gen Hiệu tác động hỗn hợp sense hay antisense gấp 10 lần so với dùng antisense hay sense.Các siRNA chuyển vào SVTH: Trang 10 GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ Gen mã hóa cho tmRNA tìm thấy tất gen vi khuẩn biết có số lục lạp Cho đến sinh vật nhân thực gen này, nhiên gen ty thể lại tìm thấy gen mã hóa cho dạng tmRNA thoái hóa Chức năng: tmRNA cho phép giải phóng tái sinh ribosome bị kẹt lại đầu 3’ mRNA bị lỗi, bị cắt ngắn nguyên nhân bắt cặp ngẫu nhiên đầu 3’ với Rnase Đôi tmRNA cò sử dụng trình dịch mã tiến đến codon mà acid amin mã hóa chuỗi codon hay có tế bào cho trình dịch mã bị trì hoãn Ngoài ra, chuỗi peptide mà tmRNA thêm vào đầu C chuỗi polypeptide sinh đóng vai trò dấu hiệu cho phân hủy polypeptide proteasome Tóm lại tmRNA đóng vai trò quan trọng phát triển acsvi khuẩn điều kiện stress tình trạng bệnh lí Cơ chế:  Đầu tiên, tmRNA phiên mã, sau xử lí tRNA ribonuclease đặc hiệu Rnase E, Rnase P, sau hai biến đổi sau dịch mã thêm vào nhờ enzyme methyl tranferase, pseudouridine synthase  Tiếp đến tmRNA gắn Alanin nhờ enzym Alanyl-tRNA synthase (AlaRS) nhân tố EF-Tu gắn vào nhằm ngăn chặn trình deaminoayl hóa Tuy nhiên, trước tmRNA gắn với SmpB nhân tố cần thiết cho gắn tmRNA vào ribosome Sau tmRNA tiếp tục gắn với protein S1, nhân tố khác khác góp phần hỗ trợ gắn tmRNA với ribosome  Alanin-tmRNA sau hình thành chuyển đến gắn vào vị trí A ribosome bị trì hoãn chuỗi polypeptide tổng hợp dang dở nhận thêm acid amin alanin Phân tử mRNA hỏng giải phóng có lẽ phân hủy nhờ Rnase R Phần tRNA chuyển sang vị trí P vùng đọc mở ngắn thay cho phân tử mRNA giải phóng Hiện tượng gọi transtranslation (sự chuyển dịch mã) Và trình dịch mã kết thúc bình thường khung đọc mở ngắn có codon kết thúc Như thế, ribosome bị SVTH: Trang 26 GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ trì hoãn giải thoát polypeptide sinh gắn vào đuôi giống nhau, mà đuôi tín hiệu nhận diện polypeptide nhanh chóng bị phân hủy proteasome (vì chúng polypeptide lỗi) Hình 2.5: Quá trình trans-translation a) Sự gắn kết Alanin vào tmRNA xúc tác enzyme alanine tRNA synthase (AlaRS) (b,c) Phức hệ EF-Tu, PrsA, SAF, Rnase (cofactor) phức hệ tmRNA-ala gắn vào vị trí P ribosome bị trì hoãn (d) tmRNA thay đoạn mẫu cho dịch mã (trans-translation) SVTH: Trang 27 GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ (e) Phức hệ sau dịch mã bị cắt protease, ClpXP 2.2.3 RNA tế bào chất (small cytoplasmatic RNA): 2.2.3.1 Scr: Là RNA nhỏ tế bào chất small cytoplasmatic RNA vi khuẩn Bacillus Subtilis thành phần điểm nhận biết tín hiệu scRNA phiên mã tiền thân 354nt, xử lí để trở thành scRNA 271nt trưởng thành Quá trình sinh tổng hợp:  Các nghiên cứu trước chứng minh tham gia Rnase III endoribonuclease, Bs-Rnase III xử lí scRNA Bs-Rnase III tìm thấy để tách scRNA tiền thân (precursor) hai điểm(5’ 3’) nằm hai phía đối diện thân cấu trúc thân-vòng lớn (stem-loop), tạo thành RNA 275nt, sau tiếp tục cắt 3’-exoribonuclease để trở thành scRNA trưởng thành Bs-scRNA III phân cắt chủ yếu vị trí phân cắt 5’ hiệu vị trí 3’ Hình 2.6: Quá trình tạo thành scRNA trưởng thành SVTH: Trang 28 GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ (A) - Sơ đồ scRNA với trình tự nucleotide 5’ 3’ kết thúc Vòng lặp nội (internal loop) lớn không vẽ theo tỉ lệ Mũi tên màu đen vị trí Bs-Rnase III chia tách vùng A b Mũi tên đứt nét vùng X đề xuất phân cắt Dấu hoa thị biểu thị đầu 3’ kết thúc scRNA trưởng thành Nucleotide A va C vẽ đậm đầu 3’ kết thúc nucleotide 279 nucleotide 283 Nucleotide khung nhỏ đánh dấu kết thúc chuỗi (B) - Sơ đồ sản phẩm RNA phát thăm dò khác Dòng màu đen toàn chiều dài scRNA (354nt), hai mũi tên đậm phía vùng vị BsRnase III phân cắt Mũi tên hình viên kim cương phía đường vị trí vùng X đề xuất phân cắt Các số đầu cuối đường cho biết đầu 5’ 3’ kết thúc RNA Phía dòng dường nguồn gốc RNA, với kích thước dấu ngoặc đơn (các kích thước dự đoán từ tính toán trước đó) Chức năng: scRNA RNA kích thước nhỏ tìm thấy dạng dạng tự tế bào chất RNA liên kết với phân tử protein sản xuất hạt nhìn nhận tín hiệu (signal recognition particles) hay SRP, để giúp đỡ việc nhận ràng buộc ribosome vào lưới nội chất để sản xuất protein tiết 2.2.4 RNA điều hòa: 2.2.4.1 FsrA: Phản ứng iron-sparing Bacillus Subtilis điều hòa chủ yếu sRNA FsrA điều hòa-Fur Các hoạt động fsrA độc lập với Hqf mã hóa Bacillus Subtilis lại phụ thuộc phần vào ba protein nhỏ, FbpA, FbpB, FbpC FsrA hoạt động sợi đối mã RNA cho mục tiêu gen, Sdh, mục tiêu chung ác phản ứng iron-sparing vài sinh vật sRNA phù hợp mạnh mẽ với khu vực dẫn đầu operon - ID: SRNAT00103 - Loại (Type): trans-encoded - Strand: forward SVTH: Trang 29 GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ - Vị trí (Position): 1483560 1483605 - Chiều dài: 46bp - Trình tự: gagagaagct actctctgtt ccccaacccc tctatcagat caagat - Mục tiêu: sdhC - Type: mRNA - Vị trí: 2908129 2908737 - Strand: reverse - Chiều dài: 609bp - Trình tự: ATGTCTGGGA GTCGGCATCT GCATTCAATA TTTATTATCT GCGAAAAATA GTAACCGGTA GCACAAATGG ATGCTTGGTT TGGTCTTTCG TACGTTACGC TTTGTTTAA ACAGAGAGTT TTCTTATTCA GCGCTGCTCA TCTTACCATT ACGCCGGTCA TCATCACCCT GTGCTGAGGT TTTACATTGT CTGTTACATG TGATTATTTT - Vị trí mục tiêu gắn vào: -23 28 - Vị trí sRNA gắn vào: 44 - Sự tương tác: TTATTTTCGA GCATTTAGTC TTTTATGGAT AATTTATCAT ATACAGCTAC CATTTTCGTC CAATTTCGAC CGGTGTTTTA GGGCATCACG TGTTGCACTG AGATTGCATT GTCAACCAGT AGCCTGCCTT GCAGTTTATG ATGAGAAACT AGCTGGCACG ATGATGGCGA TCAACAATTT GTAACGCCTC TCATACGTAG CCTTGCTTGG TTGCCGCAAG TCAGGTATGC GTGTGTACAT GGCTATTCGT TGTGGGAAAC ATATTTTGAG TCCACTTCTC GTTCTCAAAG GCTTAAAAGC CGTCATACCG GGGCGCTGAA CTTGGAAATT AGCGTTTACT CCTGCAGCGT CCGCATTGCC CTCTCCGGCT GAACGGTTTA AATTTCGACA GATTTTTGCA - Target 5'-CUU-AUCAAACAG-GGGGUAAAGUAAUGUCUGGGAACAGAGAGUUUUAUUUUC-3' ||| ||| | || ||||| ||||||||||||| ||.|| - sRNA 3'-GAACUAGACUAUCUCCCCA ACCCCUUGUCUCUCA-UCGAAGAG-5' - Cơ chế: FsrA mã hóa sản phẩm protein thiếu codon bắt đầu sRNA FsrA điều hòa tăng mạnh mẽ (up-regulated) chủng đột biến Fur tế bào hoang dại thiếu sắt Như dự đoán, Fur liên kết với vùng điều hòa FsrA với lực cao Những kết cho thấy FsrA sRNA điều hòa- Fur (Furnhân tố điều hòa hấp thu Fe (III)) SVTH: Trang 30 GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ Hình 2.7: Thành phần phân tử phản ứng iron-sparing (A) - Tổ chức đơn vị phiên mã fbpAB FsrA fbpC (B) - Phương pháp Northern phân tích biểu FsrA chủng khác rRNA 23S sử dụng internal loading control (C) - Gắn Fur tinh với vùng promoter FsrA (0.1nM) phát phương pháp điện di dịch chuyển di động (electrophoretic mobility shift assay) (D) - Phát FLAG đánh dấu FbpA, FbpB, and FbpC phương pháp Western bot với kháng thể kháng FLAG (E) - Trình tự acid amin pI tương ứng Người ta giả thuyết rằng, ba protein nhỏ hoạt động với FsrA để ức chế trực tiếp gen mục tiêu chọn Tuy nhiên, FsrA hoạt động số mục tiêu độc lập protein Hơn các operon fbpAB fbpCcungx có chức độc lập với FsrA peptide mã hóa dịch mã RNA hai SVTH: Trang 31 GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ Chức năng:  FsrA protein FbpAB có chức đường xác định hàm lượng sắt FbpC có tác động đối lập FsrA rõ ràng đóng vai trò quan trọng việc ưu tiên sử dụng sắt ảnh hưởng protein FbpABC phức tạp khác protein mục tiêu khác  FsrA ức chế biểu succinate dehydrogenase: Người ta đưa giả thiết FsrA hoạt động RNA antisense cho số hoặ tất gen mục tiêu Thật vậy, người ta xác định số mục tiêu cho FsrA cách nghiên cứu hệ gen vi khuẩn Bacillus Subtilis, sử dụng mục tiêu RNA  Trình tự bổ sung FsrA Sdhc cho phép dự đoán FsrA giảm điều hòa dịch mã (down-regulated) sdh  FsrA Srna ức chế biểu Aconitase: Tóm lại: sRNA FsrA có liên quan đến phản ứng iron-sparing FsrA hoạt động để giảm điều hòa (down-regulated) tổng hợp nhiều enzyme chứa sắt đường sinh tổng hợp tiêu tốn sắt Như theo dõi proteomics, hiệu ứng phức tạp FsrA xuất effector quan trọng cho nhiều mục tiêu protein 2.2.4.2 RatA: RatA thành phần hệ thống độc tố-kháng độc tố TxpA-RatA phát vi khuẩn Bacillus Subtilis Hệ thống bao gồm sRNA 222nt không mã hóa gọi RatA protein độc tên TxpA RatA khám phá vùng intergenic hệ gen Bacillus Subtilis, vùng 728nt gen yqdB (sau đổi tên thành TxpA) yqbM Ban đầu, Affymetrix microarrays sử dụng để phát phiên mã khu vực Sau phương pháp Northern blot phân tích đột biến điểm sử dụng để mô tả phiên mã RNA Trình tự chế: SVTH: Trang 32 GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ Hình 2.8: RNA RatA Hình 2.9: Sơ đồ vùng RatA Chức năng: chưa rõ 2.2.4.3 sr1: - ID: SRNAT00392 - Sự điều hòa: Hoạt hóa - Type: trans-encoded SVTH: Trang 33 GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ - Vị trí: 1534070 1534274 - Chiều dài: 205bp - Trình tự: AACAAAAGAA TTGTTTGCCA TATATGGAAC GCGGCTTAAA ATTAAGCGTT AGATTGCAAC TTGCTGCGGA GCCGCATGCT - Mục tiêu: GapA - Type: mRNA - Strand:reserve - Vị trí: 3481698 3482705 - Chiều dài:1087 - Trình tự: ATGGCAGTAA GCATTAAACA CTGGCTCACC GACGGTAACA GCTAAACTTA ACAAAACGCG GCTCCTGCTA GCGGCTAACC GCAAAAGTAC TACACAAACG GCAGCTGAAA CCTGAACTAA CTAGTTGACT CTTAAAGAAG GTTTCTGGCG GTTATGGAAG AACCGCGTTG AAGTCGGTAT ATCCTGAAGT TTTTACAATA ACCTTGTTGT GCTGGGGCAA CAGACGCTGC ACGAAGAAGA ACGATGTTAT TTAACGATAA ATCAGCAAAT ACATCATCCC AAGGCAAACT TGGTTGCTGA CGGCTGAAGG ACTACAACGG GCAGCATGGT TTGACCTTGC - Vị trí sRNA gắn vào: 54…86 - Vị trí mục tiêu gắn vào: -5…24 - Tương tác: TTCAAATTTC AAAGAAATGG GGAATAAGAG ATGGGTACGA GAAGCCATTC ATTACTTTGA AGATGAGAAA GTGACAACAT CAATGTCAAT GTCCTGTTGA TGAAGAGTAA AAAAAAGCAT TTTTA TAACGGTTTT TGAGGTAGTA TGATTCTGTA TAACGGCAAA ACAAGGCGTT GAAACACTTA TATCACAATC CTCTAACGCA ATTCGGCATC CCTTGATCTT AACATCAACT GAACGGTGGA ACTGAACCAA CGACCTTAAA AAACAAAAAC AAAAGTAATC AGCTTACATC GGTCGTATTG GCGGTTAACG CACGGAAAAT ACAATTGAAG GAAATCGTAG GAAGCTGGCG GTTATGGGTG TCTTGCACAA AAACGCGGTA CCGCACAAAG GGTGCTGCTA GCAATGCGTG GAAGTAACAG GGAATCCTTG TCTTCTACAA TCTTGGTACG GCAAAAAAAG GACGTAACGT ATTTAACAGA TAGACGCTGA TTTCTGCAGA TTGAATCTAC CGAAAAAAGT TTAACGAAGA CAAACTGCCT TGATGACAAC ACTACCGTCG AAGCAGTTTC TTCCAACTCC CTGAAGAAGT GCTACAGCGA TCGATGCTCT ATAACGAAAG GTCTTTAA ATTCCGCGCA TGCTAACATG AGTTTCAGTT ACGCGATCCT TGGTTTCTTC AATCATCTCT TAAATACGAT TGCGCCGTTT TGTTCACTCT TGCGCGTGCA TCTAGTTCTT AAACGTTTCT AAACGCAGCT AGAGCCATTA TTCTACAATG CGGCTACTCT - Target 5'-caatcatggcagtaaaagtcggtatt-3' ||||| ||||| |.||| || - sRNA 3'-gttagaaccgtttg ttagc-atgg-5' - Cơ chế: sr1 hoạt động peptide mã hóa mRNA operon gapA SVTH: Trang 34 GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ Hình 2.10: Cơ chế sr1 Chức năng: Các small ncRNA tìm thấy điều hòa biểu gen ba giới sống Cho đến small RNA từ vi khuẩn Gram dương biết đến nhiều SR1 small RNA nhiễm sắc chất Bacillus Subtilis, ức chế cách bắt đầu dịch mã cặp base mRNA ahrC mã hóa nhân tố kích hoạt phiên mã operon catabolic arginine Cả hai phương pháp microarray Northern blot cho thấy số lượng operon GapA tăng lên đáng kể tế bào nuôi cấy môi trường phức tạp có diện SR1 Dịch mã LacZ phân tích toeprinting chứng minh SR1 không thúc đẩy dịch mã mRNA GapA Ngược lại, halflife operon GapA mRNA giảm mạnh chủng SR1 knockout strain SR1 không hoạt động base sRNA operon GapA mRNA Thay vào đó, chứng minh 39aa peptide mã hóa SR1, SR1P chịu trách nhiệm hiệu SR1 operon GapA SR1P liên kết với GapA tạo ổn định cho operon GapA mRNA chế chưa biết SR1 sRNA có chức kép tìm thấy Bacillus Subtilis 2.2.5 Các small RNA chưa rõ chức năng: Gồm sRNA bsrC, bsrD, bsrE, bsrF, bsrH, bsrG, bsrL, csfG, surA, surC SVTH: Trang 35 GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ Hình 2.11: Cấu trúc bậc hai BsrC Hình 2.12: Cấu trúc bậc hai BsrF SVTH: Trang 36 GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ Hình 2.13: Cấu trúc bậc hai BsrG Phương pháp phát ncRNA: 2.3 2.3.1 Phương pháp thực nghiệm: Northern blot: phương pháp cho phép phát có mặt, kích thước trọng lượng phân tử RNA mẫu khác Hầu hết ncRNA đề cập đến phát phương pháp Northern Blot Northern Blot công cụ mạnh mẽ sử dụng phân tích biểu gen Đây phương pháp tin cậy sử dụng rộng rãi mô tả đặc tính ổn định RNA Phân tích RNA phương pháp mạnh mẽ để theo dõi hoạt động gen nội sinh giới thiệu gen dòng tế bào đặc biệt mô Northern blot có số lợi Sự biểu gen thường phức tạp, nhiều phân tử RNA thể từ gen đơn lẻ hàng ngàn RNA tạo từ tế bào vi sinh vật Northern Blot phân tích đồng thời cung cấp thông tin loài, kích cỡ mức độ biểu đa dạng RNA SVTH: Trang 37 GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ Sự phát liên tục small RNA cách sử dụng trình tự high-throughput đặt cần thiết cho phương pháp đáng tin cậy để phát theo dõi mức độ biểu small RNA Hiện Northern blot phương pháp sử dụng rộng rãi để xác nhận small RNA high-throughput sequencing Phương pháp dựa protocol (LED) cho RNA , phát cách sử dụng đầu dò nhãn DIG, có chứa khóa axit nucleic (LNA) 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl) carbodiimide cho qua RNA liên kết với màng tế bào LED tạo tín hiệu hiển thị cho small RNA nồng độ thấp Phương pháp đòi hỏi phải có vài giây tiếp xúc với màng, tiếp xúc lâu tốt Ngược lại phương pháp sử dụng đồng vị phóng xạ độc hại, nguy hiểm, đầu dò LED lưu trữ tháng, tạo điều kiện thuận lợi hơn, nhanh hơn, chi phí rẻ thân thiện với môi trường 2.3.2 Phương pháp tin sinh học: Tìm cấu trúc ncRNA từ trình phân tích thực nghiệm đòi hỏi nhiều thời gian công sức Do vậy, nhiệm vụ tin sinh học dự đoán cấu trúc ncRNA, từ kiểm tra lại phương pháp thực nghiệm Tin sinh học: lĩnh vực khoa học kết hợp hoàn hảo nghành toán học ứng dụng, tin học, thống kê, khoa học máy tính, trí tuệ, hóa học đặc biệt sinh học Với trợ giúp tin sinh học, sinh học phân tử có thêm công cụ mạnh mẽ Nhiều vấn đề sinh học giải thông qua kiến thức tin học SVTH: Trang 38 GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ TÀI LIỆU THAM KHẢO: 1) http://menvisinh.org/content/bacillus-subtilis 2) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12177353 3) http://ccb.bmi.ac.cn/srnatarbase/details.php?id=103 4) http://www.pnas.org/content/105/33/11927.full 5) http://bsubcyc.org/BSUB/NEW-IMAGE?type=GENERICRNA&object=RNA8J2-5 6) http://ccb.bmi.ac.cn/srnatarbase/details.php?id=392 7) http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2958.2010.07158.x/full 8) http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=680 9) http://en.wikipedia.org/wiki/TmRNA#Discovery_of_tmRNA_and_early_wor k 10) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1935012/ 11) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1370762/ 12) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12177353 13) http://mic.sgmjournals.org/content/148/8/2591.long 14) http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1574-6968.2002.tb11023.x/full 15) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1251590/ SVTH: Trang 39 GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 3.1 Tình hình phát triển: 3.1.1 Trên giới: Trong số RNA biết đến, có khoảng 2-3% gen mã hóa protein, số lại ncRNA ncRNA có vai trò trung tâm điều hòa, biểu gen đáp ứng lại thay đổi môi trường số chúng liên quan đến lây nhiễm vi khuẩn Chính vai trò quan trọng chúng mà gần ncRNA trở thành đối tượng nghiên cứu ý nhiều Các nghiên cứu ncRNA thời gian gần tăng lên đáng kể Đặc biệt vi khuẩn E.Coli Còn vi khuẩn B.Subtilis, ncRNA nghiên cứu 3.1.2 Ở Việt Nam: Ở nước ta chưa có công bố khoa học ncRNA B.Subtilis 3.1 Hướng nghiên cứu tương lai: Kết hợp tin sinh học với phương pháp thực nghiệm để tạo công cụ mạnh mẽ Phát triển phương pháp thực nghiệm SVTH: Trang 40 [...]... thể bằng cách tạo ra (Producing), phóng thích (Releasing) và dò tìm (Detecting) các phân tử tín hiệu; là tiến trình các tế bào vi khuẩn thông tin liên lạc với nhau bằng các phân tử tín hiệu Nhờ Quorum Sensing, vi khuẩn có thể kích hoạt sự hoạt động của các gen mã hóa các tiến trình như: tạo màng sinh học, tạo bào tử, phát sáng, sản xuất kháng sinh, tiết ra các độc tố v.v…  Ở các loài vi khuẩn Vibrio,... CỦA CÁC ncRNA CÓ TRONG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS Tổng quan về vi khuẩn Bacillus Subtilis: 2.1 2.1.1 Lịch sử phát triển: Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức y học Nazi của Đức Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi Vi c điều trị phải đợi đến những năm 1949 -1957, khi Henrry và các cộng sự tách được ch subtilis. .. đó subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng vi m ruột, vi m đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi, thực phẩm 2.1.2 Đặc điểm phân loại: Theo khóa phân loại của Bergey, vi khuẩn Bacillus Subtilis thuộc: - Bộ: Eubacteriales - Họ: Bacillaceae - Giống: Bacillus - Loài: Bacillus. .. các độc tố vào tế bào vi khuẩn, và đóng một vai trò quan trọng trong sự tồn tại của tế bào vi khuẩn trong môi trường đa dạng các protein màng bên ngoài (OMPs) bao gồm Porins và adhesins Nhiều sRNAs điều hoà biểu hiện của OMPs OmpC Porins và OmpF là chịu trách nhiệm cho vi c vận chuyển các chất chuyển hóa và các chất độc Các biểu hiện của OmpC và OmpF được điều hòa bởi MicC sRNAs và MicF để đáp ứng với... học, trong thực phẩm, đồ uống, khử trùng:  B .Subtilis có khả năng sinh nhiều enzyme, trong đó, quan trọng nhất là amylase và protease – 2 loại enzyme thuộc hệ thống men tiêu hóa  B .Subtilis có khả năng sinh tổng hợp một số chất kháng sinh có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, tác dụng lên cả vi khuẩn Gram(+) và cả Gram(-) và nấm gây bệnh  B .Subtilis thường tồn tại trong. .. nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996) 2.1.4 Đặc điểm hình thái: Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, G+,kích thước 0,5 - 0,8m x 1,5 – 3 m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động ,có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 m Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do... nghiệm hướng vào phát hiện các tính chất cơ bản và đặc điểm của vi khuẩn Gram dương hình thành bào tử Trong đó, các nguyên tắc và cơ chế cơ bản hình thành endospore bền (durable endospore) đã được suy luận từ các nghiên cứu hình thành bào tử trong B .Subtilis Tính ổn định cao của B .Subtilis trong điều kiện khắc nghiệt của môi trường làm cho nó trở thành một trong những đại diện hoàn hảo cho các ứng dụng... Loài: Bacillus Subtilis 2.1.3 Đặc điểm phân bố: Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc, chúng được phân bố hầu hết trong tự nhiên Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g SVTH: Trang 17 GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ 1 Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm Nước và bùn cửa sông... Chủ yếu là tin sinh học 2.2.1 RNA 6S: Trong quá trình nghiên cứu chủ đề về các RNA mới trong vi khuẩn Bacillus Subtilis bằng phương pháp so sánh bộ gen của vùng intergenic, các nhà khoa học đã khám phá ra 2 small RNA không mã hóa mới là BsrA và BsrB SVTH: Trang 21 GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ 1 2.2.1.1 bsrA: RNA BS190 là RNA được phân lập từ vi khuẩn Bacillus Subtilis RNA này được gọi là BS190... trực tiếp các gen mục tiêu được chọn Tuy nhiên, hình như ở đây FsrA có thể hoạt động tại một số mục tiêu độc lập của những protein này Hơn nữa các các operon fbpAB và fbpCcungx có các chức năng độc lập với FsrA và đây có thể là do các peptide được mã hóa hoặc dịch mã RNA hoặc cả hai SVTH: Trang 31 GVHD: Đặng Đức Long Đồ án công nghệ 1 Chức năng:  FsrA và các protein FbpAB có thể có chức năng trong cùng