ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TUYỂNCHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN RHIZOBIUM SP. TỪ RỄ CÂY LẠC (ARACHIS HYPOGAEA. L) TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH QUẢNG NAM.

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI H ỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TUYỂNCHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN RHIZOBIUM SP TỪ RỄ CÂY LẠC (ARACHIS HYPOGAEA L) TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH QUẢNG NAM Ngành: Công nghệ sinh học Người hướng đẫn: TS Phạm Thị Mỹ Sinh viên thực hiện: Cao thị Vân Lâu, Trần Thị Thúy Hương, Võ Thị Như Huỳnh Đà Nẵng, 01/2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu nghiên cứu khoa học trung thực chưa công bố cơng trình khác Đà Nẵng, tháng 04 năm 2019 LỜI CẢM ƠN Bằng lòng sâu sắc, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS Phạm Thị Mỹ người trực tiếp bảo, hướng đẫn, truyền đạt kinh nghiệm quý báu động viên suốt q trình thực hồn thành nghiên cứu khoa học Xin cảm ơn thầy ThS Vũ Đức Hồng, ThS Lê Thị Mai nhiệt tình hướng dẫn giúp đỡ tơi q trình thực Tôi xin chân thành cảm ơn tất thầy cô Khoa Sinh - Môi trường - Đại học Sư Phạm - Đại học Đà Nẵng tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức tạo điều kiện thuận lợi cho năm học Xin chân thành cảm ơn! MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát chung Rhizobium sp 1.1.1 Lịch sử phát phân loại vi khuẩn Rhizobium sp 1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lý vi khuẩn Rhizobium sp 1.2 Một số ứng dụng vi khuẩn Rhizobium sp 1.3 Một số nghiên cứu vi khuẩn Rhizobium sp nước giới 1.3.1 Một số nghiên cứu giới 1.3.2 Một số nghiên cứu nước CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 2.2.1 Địa điểm thu mẫu 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 2.2.3 Thời gian nghiên cứu 2.3 Hóa chất, thiết bị 2.3.1 Hóa chất 2.3.2 Thiết bị 2.4 Nội dung nghiên cứu 2.5 Phương pháp nghiên cứu 10 2.5.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 10 2.5.2 Phương pháp thu mẫu 10 2.5.3 Phương pháp phân lập 11 2.5.4 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào test hóa sinh chủng vi khuẩn tuyển chọn 11 2.5.1 Phương pháp định danh chủng VK kỹ thuật sinh học phân tử15 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 18 3.1 Phân lập vi khuẩn Rhizobium sp 18 3.2 Kết nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào, sinh hóa chủng vi khuẩn tuyển chọn 19 3.2.1 Kết quan sát hình thái tế bào kính hiển vi 19 3.2.2 Thử nghiệm khả di động 20 3.2.3 Thử nghiệm catalase 20 3.2.4 Thử nghiệm khả chịu mặn 21 3.2.5 Kết xác định khả cố định nitơ chủng VK tuyển chọn 21 3.2.6 Kết định danh phương pháp khuếch đại vùng gen 16S rRNA 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO 26 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VSV : Vi sinh vật MT : Môi trường VK : Vi khuẩn KL : Khuẩn lạc ĐC : Đối chứng PTN : Phòng thí nghiệm DD Dung dịch : NCBI : UV : AND : ARN : National Center for Biotechnology Information Ultraviolet Acid deoxyribonucleic Acid ribonucleic DANH MỤC CÁC BẢNG Kí hiệu Tên bả ng bảng Trang 2.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn 14 2.2 Kết xác định đường chuẩn NH4+ 14 2.3 Trình tự cặp mồi sử dụng để khuếch đại vùng gen 16 16S rRNA 3.3 Tổng hợp đặc điểm tế bào, sinh lý, sinh hóa chủng VK L1 23 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Số hiệu Tên hình ảnh Trang 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 10 2.2 Chu trình nhiệt phản ứng khuếch đại PCR 17 3.1 Hình chủng VK phân lập từ rễ lạc 18 3.2 Hình thái khuẩn lạc chủng VK tuyển chọn 18 3.3 Tế bào kính hiển vi chủng VK L1 19 3.4 Khả di động chủng VK L1 20 3.5 Thử nghiệm catalase chủng VK L1 21 3.6 Sự sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn nồng độ muối NaCl từ – 4% 21 3.7 Hình ảnh phản ứng màu chủng VK tuyển chọn với thuốc thử Nessler 22 3.8 Sản phẩm PCR (Số1: mẫu L1, M: marker phân tử) 24 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Trong nông nghiệp, suất trồng luôn vấn đề quan tâm hàng đầu Đã có nhiều phương pháp sử dụng nhằm cải thiện suất tăng cường đề kháng trồng với mầm bệnh phổ biến sử dụng thuốc trừ sâu phân hóa học Tuy nhiên biện pháp hạn chế như: gây nhiễm mơi trường, thối hóa đất ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người [17] Cùng với phát triển khoa học kĩ thuật, biện pháp xu hướng đời với mục tiêu xây dựng nông nghiệp bền vững, thân thiện với môi trường mà đạt suất cao Ngày nhiều công bố khoa học cho thấy tiềm sử dụng tương tác có lợi vi sinh vật với trồng để kích thích sinh trưởng thực vật, có vi khuẩn có khả cố định Nitơ quan tâm nhiều Nitơ (N) nguyên tố dinh dưỡng quan trọng không với trồng mà vi sinh vật Nguồn dự trữ Nitơ tự nhiên lớn tính riêng khơng khí Nitơ chiếm khoảng 78,16% thể tích [9] Người ta ước tính bầu khơng khí bao trùm lên 1ha đất đai chứa khoảng triệu Nitơ, lượng Nitơ cung cấp dinh dưỡng cho trồng hàng chục triệu năm trồng đồng hóa chúng Trong thể loại vi sinh vật chứa khoảng 4,1015 tỷ Nitơ Cây trồng loại động vật người khơng có khả đồng hóa trực tiếp nguồn N2 tự từ khơng khí Nhưng tất nguồn Nitơ trồng khơng tự đồng hóa mà phải nhờ vi sinh vật Hàng năm trồng lấy từ đất hàng trăm triệu Nitơ Bằng cách bón phân người trả lại cho đất khoảng 40%, lượng thiếu hụt lại bổ sung Nitơ hoạt động sống vi sinh vật Vì việc nghiên cứu sử dụng loại đạm sinh học xem giải pháp quan trọng nông nghiệp, đặc biệt phát triển để hướng tới nông nghiệp sinh thái bền vững Tuy nhiên tồn số vi sinh vật có khả biến N2 khí thành NH3 cung cấp đạm cho mà cần lượng lượng (3-5kcal/M) Rhizobium, Azotobacter, Beijerinckia [9] Những vi sinh vật thường tồn nhiều rễ loại trồng lúa, mồng tơi, thuộc họ đậu,… Xuất phát từ lý luận thực tiễn tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn số chủng vi khuẩn Rhizobium sp từ rễ lạc (Arachis hypogaea L) địa bàn tỉnh Quảng Nam” Mục tiêu đề tài Phân lập, tuyển chọn số chủng vi khuẩn Rhizobium sp từ rễ lạc (Arachis hypogaea L) địa bàn tỉnh Quảng Nam Ý nghĩa khoa học thực tiễn • Ý nghĩa khoa học Phân lập lưu trữ số chủng vi khuẩn Rhizobium sp Đây nguồn gen cung cấp cho hướng nghiên cứu chuyên sâu sinh lý, sinh hóa, di truyền… • Ý nghĩa thực tiễn Kết đề tài sở cho việc lựa chọn chủng vi khuẩn sống nội sinh rễ họ đậu có hoạt tính cố định đạm cao để sản xuất phân vi sinh có hiệu quả, nâng cao độ phì nhiêu đất, hạn chế bón phân hóa học, tăng suất trồng góp phần phát triển nơng nghiệp sinh thái bền vững Hình 2.2 Chu trình nhiệt phản ứng khuếch đại PCR Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1%, điện áp 90V, 120mA, 45 phút (sử dụng maker phân tử có kích thước khoảng 1Kb cơng ty TNHH MTV Phù Sa) nhuộm EtBr 0.05% Hình ảnh điện di quan sát ánh sáng tử ngoại (UV transilluminator, Wealtec) c Đọc trình tự đoạn gen 16S – rRNA định danh loài Rhizobium sp Sản phẩm PCR gửi đến “Công ty TNHH MTV Sinh Hóa Phù Sa” để đọc trình tự đoạn gen 16S – rRNA Kết đọc trình tự 16S – rRNA so sánh ngân hàng gen NCBI để định danh loài vi khuẩn 17 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Phân lập vi khuẩn Rhizobium sp Từ mẫu rễ lạc khu vực xã Quế Châu, huyện Quế Sơn, Tỉnh Quảng Nam nhóm nghiên cứu phân lập chủng VK (kí hiệu L1) có khả sống sót mơi trường YMA (có chứa công gô đỏ) không bắt màu công gô đỏ Sau đó, nhóm tiến hành cấy sang mơi trường khơng có cơng gơ đỏ để làm quan sát màu sắc khuẩn lạc Hình ảnh chủng VK mơ tả hình 3.1 Hình 3.1 Hình chủng VK phân lập từ rễ họ đậu Nhóm nghiên cứu tiếp tục tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc chủng VK phân lập nhận thấy chủng VK L1 có khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, nhày, màu trắng đục, có viền suốt đường kính khoảng từ ­ 2,2mm (hình 3.2) Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc chủng VK L1 18 Vì sử dụng mơi trường phân lập đặc trưng nên nhóm nghiên cứu nhận định chủng VK phân lập có xác suất cao thuộc chi Rhizobium Nhằm khẳng định điều này, chúng tên tiến hành định danh đến tên chi chủng VK chọn lọc, sử dụng phối hợp phương pháp nhuộm Gram, quan sát hình thái tế bào kính hiển vi, kiểm tra khả di động, test catalase, khả chịu mặn khả cố định nitơ 3.2 Kết nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào, sinh hóa chủng vi khuẩn tuyển chọn 3.2.1 Kết quan sát hình thái tế bào kính hiển vi Khi quan sát kính hiển vi vật kính 100X cho thấy chủng bắt màu hồng nhuộm Gram Điều chứng tỏ chủng VK L1này thuộc nhóm Gram âm (hình 3.3) VK Gram âm ngồi lớp màng bao bọc tế bào chất có thêm lớp màng khác cấu tạo phospholipid lipopolysaccharide Màng ngồi có chức lọc để chặn lại phân tử có kích thước lớn từ 600 đến 1000 Da Màng ngồi có tính chọn lọc cao các hợp chất kỵ nước màng có phân tử lipophilic [8] Quan sát hình thái tế bào kính hiển vi cho thấy chủng L1 thuộc Gram âm có hình que ngắn, nằm riêng rẽ nhau, khơng sinh bào tử (hình 3.3) Căn vào mô tả chi VK Rhizobium xác suất cao chủng vi khuẩn L1[6] Hình 3.2 Tế bào kính hiển vi chủng VK L1 19 Nhóm nghiên cứu tiếp tục tiến hành thử nghiệm khả di động, test catalase, test khả chịu mặn khả cố đinh nitơ chủng VK tuyển chọn 3.2.2 Thử nghiệm khả di động Nhóm nghiên cứu tiến hành thí nghiệm khả di dộng chủng VK L1 Sau ngày nuôi cấy, quan sát tượng ống nghiệm chủng VK mẫu đối chứng nhận thấy: - Đối với mẫu chủng VK phân lập (VK L1): VK làm đục môi trường, VK phát triển lan khỏi đường cấy - Đối với mẫu đối chứng VK Lactobacillus: Môi trường không bị đục, VK phát triển quanh đường cấy Hình 3.4 Khả di động chủng VK L1 Những đặc điểm mô tả chứng minh chủng VK phân lập có khả di động nhờ sử dụng tiêm mao Kết hồn tồn phù hợp với mơ tả khả di động VK Rhizobium sp công bố [6], [19], [23] 3.2.3 Thử nghiệm catalase Nhóm nghiên cứu tiến hành thử nghiệm catalase chủng VK L1 Theo kết thí nghiệm cho thấy chủng VK L1 cho kết dương tính (có tượng sủi bọt khí nhỏ H2O2 3% lên khuẩn lạc VK) 20 Hình 3.5 Thử nghiệm catalase chủng VK L1 3.2.4 Thử nghiệm khả chịu mặn Để quan sát tính tăng trưởng chủng vi khuẩn cố định đạm quan sát khả tăng trưởng mơi trường YMA có bổ sung muối NaCl 14% Sau ngày cấy hai chủng vi khuẩn vào mơi trường lỏng nhận thấy có khác biệt nghiệm thức: nồng độ muối đối chứng khơng cấy vi khuẩn khơng có phát triển môi trường Ở nồng độ muối 1- 2%, chủng phát triển tốt làm đục môi trường, bắt đầu phát triển yếu nồng độ 3% nồng độ từ 4% khả sống sót thấp (Hình 3.6) Kết quan sát cho thấy chủng VK phân lập chống chịu mặn tốt nồng độ muối 2% hy vọng chủng đáp ứng với loại đất có nồng độ cation anion cao Hình 3.6 Sự sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn nồng độ muối NaCl từ – 4% 3.2.5 Kết xác định khả cố định nitơ chủng VK tuyển chọn 21 Từ chủng VK tiến hành nuôi cấy lên môi trường Ashby lỏng (không nitơ), lắc ngày để đo hình thành amonium phương pháp so màu (thuốc thử Nessler) (hình 3.7) Hình 3.7 Hình ảnh phản ứng màu chủng VK tuyển chọn với thuốc thử Nessler Kết thể hình 3.7 cho thấy chủng VK L1 có khả cố định đạm hàm lượng NH4+ VK L1 – 4,99mg/l Kết phù hợp với nghiên cứu nhà khoa học khác chi Rhizobium có khả cố định đạm cao như: Rhizobium multihospitium 6,390mg/l , Rhizobium tropici 15,398mg/l,…[9] Từ kết nghiên cứu đây, nhóm nghiên cứu tổng hợp đặc điểm hai chủng VK L1 (bảng 3.3) 22 Bảng 3.3 Tổng hợp đặc điểm tế bào, sinh lý, sinh hóa chủng VK L1 Chủng VK L1 Đặc điểm Hình thái khuẩn lạc Kích thước khuẩn lạc (mm) Tròn, lồi, bóng, nhày, màu trắng đục, có đường viền suốt - 2,2 Gram Hình dạng tế bào Khả di động Catalase Khả chịu mặn cáo Hàm lượng NH4+ (mg/l) Chú thích: _ (+): dương tính Trực khuẩn, que ngắn + + 2% NaCl 4,99 (-):âm tính Với đặc điểm trên, dựa vào khóa phân loại Bergey nghiên cứu nhà khoa học khác VK Rhizobium sp sơ nhận định chủng VK L1 phân lập từ rễ lạc địa bàn tỉnh Quảng Nam thuộc chi Rhizobium Với mục đích để khẳng định chắn chủng VK L1 thuộc chi Rhizobium đồng thời xác định tên lồi nó, nhóm nghiên cứu tiến hành định danh đến loài chủng L1 kỹ thuật sinh học phân tử 3.2.6 Kết định danh phương pháp khuếch đại vùng gen 16S rRNA DNA tổng số chủng VK L1 sau tách chiết thành công đem chạy phản ứng PCR Sản phẩm PCR điện di gel xuất băng nhất, có kích thước khoảng 1500 bp Kết khuếch đại PCR gen 16S – rRNA từ DNA chủng VK L1 thể hình 3.8 23 Hình 3.8: Sản phẩm PCR (Số1: mẫu L1, M: marker phân tử) Tiến hành giải trình tự dòng vi khuẩn, sử dụng chương trình BLAST N để so sánh mức độ đồng hình trình tự dòng vi khuẩn tuyển chọ với trình tự dòng vi khuẩn ngân hàng gen trang wed: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov Trình tự tương đồng 99,47% với loài Rhizobium multhospitium, cho phép kết luận chủng L1 loài Rhizobium multhospitium (Phụ lục 2) 24 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua kết nghiên cứu trên, nhóm nghiên cứu rút kết luận sau: Từ mẫu rễ lạc địa bàn thành xã Quế Châu, huyện Quế Sơn, tỉnh Quảng Nam tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả tổng hợp ammonium môi trường Ashby Đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm khuẩn lạc, hình thái tế bào, đặc điểm sinh lý, sinh hóa định danh cách giải trình tự 16S rRNA, kết cho thấy chủng vi khuẩn tuyển chọn thuộc loài Rhizobium multhospitiu Kiến nghị Trong nghiên cứu nhóm nghiên cứu định hướng số hướng nghiên cứu sau: 2.1 Quan sát khả hình thành nốt sần với đậu phộng trồng thử nghiệm điều kiện tự nhiên có bổ sung lượng phân bón thích hợp 2.2 Dựa vào chủng vi khuẩn phân lập tiếp tục nghiên cứu chế phẩm phân bón vi khuẩn nốt sần dạng rắn, lỏng hay bán rắn cho đậu phộng 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Bùi Văn Lệ, Lê Thị Mỹ Phước, Nguyễn Thị Mỹ Lan, Vũ Hồng Liên (1999), Giáo trình thực tập sinh hóa, ngành công nghệ sinh học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia TP.HCM [2] Đăng Thị Nguyệt Sương (2006), “Bước đầu phân lập nghiên cứu số chủng VSV có khả chuyển hóa photphat khó tan từ mẫu đất TP Đà Nẵng”, Luận văn tốt nghiệp [3] Lai Chí Quốc, Nguyễn Thị Dơn, Cao Ngọc Diệp (2012), “Tuyển chọn nhận diện vi khuẩn cố định đạm (có khả hòa tan lân kali) phân lập từ vật liệu phong hóa vùng núi đá hoa cương núi Cấm, tỉnh An Giang”, Tạp chí Khoa học 2012:24a 60-69 [4] Lê Duy Linh, Trần Thị Hường, Trịnh Thị Hồng, Lê Duy Thắng (2001), Thực tập vi sinh sở, NXB Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh [5] Lê Văn Khoa (1996), Phương pháp phân tích đất, nước, phân bón, trồng, NXB Giáo dục [6] Ngô Thế Dân (chủ biên) - Nguyễn Ngọc Quyên – Nguyễn Kim Vũ, Phân vi khuẩn nốt sần cách sử dụng cho đậu đỗ, Cục khuyến nông - NXB Nông nghiệp [7] Nguyễn Đức Lượng (2002), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học, tập 2, Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh [8] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục [9] Nguyễn Thành Đạt (Tỏng chủ biên), Lê Đình Tuấn (Chủ biên), Nguyễn Như Khanh, Sinh học 11, NXB Giáo dục Việt Nam [10] Nguyễn Thành Luân, Nguyễn Thị Liên Thương, Nguyễn Thị Quỳnh Mai, Nguyễn Minh Chánh (2017), “Phân lập định danh chủng vi khuẩn có khả tổng hợp Poly- β- Hydroxybutyrate (PHB) từ đất thực vật tỉnh Bình Dương”, Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM, trường Đại học Thủ Dầu Một, Tạp chí Khoa học cơng nghệ Thực phẩm 26 [11] Nguyễn Thị Minh, Nguyễn Thanh Nhàn (2016), “tuyển chon giống Arbuscular Mycorrhizae Rhizobium để sản xuất vật liệu sinh học nhằm tái tạo thảm thực vật làm tiêu cảnh khn viên”, Tạp chí KH Nông nghiệp Việt Nam [12] Nguyễn Xuân Thành (1993),“ Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Rhizobium cộng sinh đậu xanh ( phaseolus Aureus) hiệu lực chế phẩm vi khuẩn đậu xanh số loại đất mien Bắc Việt Nam”, NXB Bộ giáo dục đạo tạo, Đại học Nông nghệp I - Hà Nội TCVN 2662: 1978 - Nước uống – Phương pháp xác định hàm lượng amoni [14] [13] TCVN 8551: 2010 - Tiêu chuẩn Việt Nam trồng – phương pháp lấy mẫu chuẩn bị mẫu [15] Trần Ánh Nguyệt, Trần Minh Trí, Hà Thanh Đạt, Trần Thu Thảo, Hồ Viết Thế, “Phân lập, tuyển chọn đánh giá khả cố định đạm số chủng vi khuẩn nốt sần rễ đậu phộng ( Arachis Hypogaea L)”, Trường Đại học Công nghệ Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh [16] Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, NXB Giáo dục [17] Vũ Hữu Yêm, Phùng Quốc Tuấn, Ngô Thị Đào (2001), Trồng trọt (tập 1), NXB Giáo dục Tài liệu tiếng anh [18] Bergey D.H.; Noel R.K.; John G.H (1989), “Bergey’s manual of sytematic bacteriology”, Publisher: Baltimore, MD: Williams & Wilins [19] Diange EA; Lee SS (2013) "Rhizobium halotolerans sp nov., Isolated from Chloroethylenes Contaminated Soil" [20] Fred E.B., Baldwin I.L; McMoy E “Root nodule bacteria and leguminous plants”, Univ of Wisconsin Studies in Science (1932) 343-356 [21] Holland M A., Polacco J C (1994) “PPFMs and other coveư contaminants: is there more to plant physiology than just plant?”, Plant Physiology, Vol 45, pp 197209 [22] Jun-lian Gao, Pengbo Sun, Xu-ming Wang, Fan-yang Lv, Xiao-jie Mao, Jian- guang Sun (2017), “Rhizobium wenxiniae sp nov., an endophytic bacterium isolated 27 from maize roo”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 67: 2798-2803 [23] Lin SY, Hung MH, Hameed A, Liu YC, Hsu YH, Wen CZ, Arun AB, Busse HJ, Glaeser SP, Kämpfer P, et (2015) “Rhizobium capsici sp nov., Isolated from root tumor of a green bell pepper (Capsicum annuum var grossum) plant” [24] Martha Helena Ramírez-Bahena , Paula García-Fraile , Alvaro Peix , Angel Valverde , Raúl Rivas , José M Igual , Pedro F Mateos , Eustoquio MartínezMolina , Encarna Velázquez (2008), “Revision of the taxonomic status of the species Rhizobium leguminosarum (Frank 1879) Frank 1889AL, Rhizobium phaseoli Dangeard 1926AL and Rhizobium trifolii Dangeard 1926AL R trifolii is a later synonym of R leguminosarum Reclassification of the strain R leguminosarumDSM 30132 (=NCIMB 11478) as Rhizobium pisi sp nov.”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 58: 2484-2490 [25] Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K., Horn G., Erlich H., Arnheim N., (1985), "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia” Science 230 (4732): pp.13501354 [26] Sameh H Youseif, Fayrouz H Abd El-Megeed, Saleh A Saleh (2017), “Improvement of Faba Bean Yield Using Rhizobium/Agrobacterium Inoculant in LowFertility Sandy Soil”, National Gene Bank and Genetic Resources, Agricultural Research Center, Giza 12619, Egypt, Agronomy 2017, 7(1), 28 PHỤ LỤC Phụ lục 1: thành phần môi trường - Thành phần môi trường YMA K2HPO4 0,5g MgSO4.7H2O 0,2g NaCl 0,1g Mannitol 10,0g Cao nấm men 0,5g CaCO3 0,5g Dung dịch công gô đỏ 1% 2,5ml Agar 20,0g Nước cất vừa đủ 1000ml pH 6,8 đến 7,0 - Thành phần môi trường LB Cao nấm men 5,0g Peptone 10,0g NaCl 10,0g Agar 20,0g Nước cất vừa đủ 1000ml pH 6,8 đến 7,0 29 - Thành phần môi trường Ashby Glucoza 20g K2HPO4 0,2g MgSO4 0,2g NaCl 0,2g K2SO4 0,1g CaCO3 5,0g Agar 20g Nước cất vừa đủ 1000ml pH 6,8 đến 7,0 30 Phụ lục 2: Kết giải trình tự vùng gen 16S rRNA 31 ... phát từ lý luận thực tiễn tiến hành thực đề tài: Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn số chủng vi khuẩn Rhizobium sp từ rễ lạc (Arachis hypogaea L) địa bàn tỉnh Quảng Nam” Mục tiêu đề tài Phân lập,. .. lập, tuyển chọn số chủng vi khuẩn Rhizobium sp từ rễ lạc (Arachis hypogaea L) địa bàn tỉnh Quảng Nam Ý nghĩa khoa học thực tiễn • Ý nghĩa khoa học Phân lập lưu trữ số chủng vi khuẩn Rhizobium sp.. . ra, vi khuẩn Rhizobium sp tự sản sinh vitamin chất kích thích sinh trưởng , số nòi khác lấy vitamin từ mơi trường sống [6] 1.3 Một số nghiên cứu vi khuẩn Rhizobium sp nước giới 1.3.1 Một số nghiên