Trong nền nông nghiệp, năng suất cây trồng luôn luôn là vấn đề được quan tâm hàng đầu. Đã có nhiều phương pháp được sử dụng nhằm cải thiện năng suất cũng như tăng cường đề kháng của cây trồng với mầm bệnh trong đó phổ biến nhất là sử dụng thuốc trừ sâu và phân hóa học. Tuy nhiên các biện pháp này còn rất hạn chế như: gây ô nhiễm môi trường, thoái hóa đất và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người 17. Cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật, các biện pháp và xu hướng mới đã ra đời với mục tiêu xây dựng một nền nông nghiệp bền vững, thân thiện với môi trường mà vẫn đạt năng suất cao. Ngày nay nhiều công bố khoa học đã cho thấy tiềm năng sử dụng tương tác có lợi giữa vi sinh vật với cây trồng để kích thích sinh trưởng ở thực vật, trong đó có các vi khuẩn có khả năng cố định Nitơ đang được quan tâm nhiều nhất.
Trang 1ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI H ỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG
SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
ĐỀ TÀI : NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TUYỂNCHỌN
MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN RHIZOBIUM SP TỪ
RỄ CÂY LẠC (ARACHIS HYPOGAEA L) TRÊN ĐỊA
BÀN TỈNH QUẢNG NAM.
Ngành: Công nghệ sinh học Người hướng đẫn: TS Phạm Thị Mỹ Sinh viên thực hiện: Cao thị Vân Lâu, Trần Thị Thúy Hương, Võ Thị Như
Huỳnh
Đà Nẵng, 04/2019
Trang 2LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong bài nghiên cứu khoa học này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong
bất kỳ công trình nào khác
Đà Nẵng, tháng 04 năm 2019
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Bằng tấm lòng sâu sắc, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới cô TS Phạm Thị Mỹngười đã trực tiếp chỉ bảo, hướng đẫn, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu vàđộng viên tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành bài nghiên cứu khoahọc này
Xin cảm ơn thầy ThS Vũ Đức Hoàng, cô ThS Lê Thị Mai đã nhiệt tìnhhướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả thầy cô Khoa Sinh - Môi trường - Đạihọc Sư Phạm - Đại học Đà Nẵng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức vàtạo những điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong 4 năm học
Xin chân thành cảm ơn!
Trang 4MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Khái quát chung về Rhizobium sp 3
1.1.1 Lịch sử phát hiện và phân loại vi khuẩn Rhizobium sp 3
1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lý của vi khuẩn Rhizobium sp 3
1.2 Một số ứng dụng của vi khuẩn Rhizobium sp 5
1.3 Một số nghiên cứu về vi khuẩn Rhizobium sp trong nước và trên thế giới 5
1.3.1 Một số nghiên cứu trên thế giới 5
1.3.2 Một số nghiên cứu trong nước 7
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .9 2.1 Đối tượng nghiên cứu 9
2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 9
2.2.1 Địa điểm thu mẫu 9
2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 9
2.2.3 Thời gian nghiên cứu 9
2.3 Hóa chất, thiết bị 9
2.3.1 Hóa chất 9
2.3.2 Thiết bị 9
2.4 Nội dung nghiên cứu 9
2.5 Phương pháp nghiên cứu 10
2.5.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 10
2.5.2 Phương pháp thu mẫu 10
2.5.3 Phương pháp phân lập 11
Trang 52.5.4 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào và các test hóa sinh
của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn 11
2.5.1 Phương pháp định danh các chủng VK bằng kỹ thuật sinh học phân tử15 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 18
3.1 Phân lập vi khuẩn Rhizobium sp 18
3.2 Kết quả nghiên cứu các đặc điểm hình thái tế bào, sinh hóa của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn 19
3.2.1 Kết quả quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi 19
3.2.2 Thử nghiệm khả năng di động 20
3.2.3 Thử nghiệm catalase 20
3.2.4 Thử nghiệm khả năng chịu mặn 21
3.2.5 Kết quả xác định khả năng cố định nitơ của chủng VK tuyển chọn 21
3.2.6 Kết quả định danh bằng phương pháp khuếch đại vùng gen 16S rRNA 23
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 25
TÀI LIỆU THAM KHẢO 26
Trang 6AND : Acid deoxyribonucleic
ARN : Acid ribonucleic
Trang 7DANH MỤC CÁC BẢNG
Kí hiệu
2.3 Trình tự cặp mồi được sử dụng để khuếch đại vùng
Trang 9MỞ ĐẦU
1 Đặt vấn đề
Trong nền nông nghiệp, năng suất cây trồng luôn luôn là vấn đề được quan tâmhàng đầu Đã có nhiều phương pháp được sử dụng nhằm cải thiện năng suất cũng nhưtăng cường đề kháng của cây trồng với mầm bệnh trong đó phổ biến nhất là sử dụngthuốc trừ sâu và phân hóa học Tuy nhiên các biện pháp này còn rất hạn chế như: gây ônhiễm môi trường, thoái hóa đất và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người [17] Cùngvới sự phát triển của khoa học kĩ thuật, các biện pháp và xu hướng mới đã ra đời vớimục tiêu xây dựng một nền nông nghiệp bền vững, thân thiện với môi trường mà vẫnđạt năng suất cao Ngày nay nhiều công bố khoa học đã cho thấy tiềm năng sử dụngtương tác có lợi giữa vi sinh vật với cây trồng để kích thích sinh trưởng ở thực vật,trong đó có các vi khuẩn có khả năng cố định Nitơ đang được quan tâm nhiều nhất
Nitơ (N) là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng không chỉ với cây trồng mà ngay
cả đối với vi sinh vật Nguồn dự trữ Nitơ trong tự nhiên rất lớn chỉ tính riêng trongkhông khí Nitơ chiếm khoảng 78,16% thể tích [9] Người ta ước tính trong bầu khôngkhí bao trùm lên 1ha đất đai chứa khoảng 8 triệu tấn Nitơ, lượng Nitơ này có thể cungcấp dinh dưỡng cho cây trồng hàng chục triệu năm nếu như cây trồng đồng hóa đượcchúng Trong cơ thể các loại vi sinh vật chứa khoảng 4,1015 tỷ tấn Nitơ Cây trồngcũng như các loại động vật và người không có khả năng đồng hóa trực tiếp nguồn N2
tự do từ không khí Nhưng tất cả nguồn Nitơ trên cây trồng đều không tự đồng hóađược mà phải nhờ vi sinh vật Hàng năm cây trồng lấy đi từ đất hàng trăm triệu tấnNitơ Bằng cách bón phân con người đã trả lại cho đất khoảng hơn 40%, lượng thiếuhụt còn lại cơ bản được bổ sung bằng Nitơ do hoạt động sống của vi sinh vật Vì vậyviệc nghiên cứu sử dụng loại đạm sinh học này được xem là một giải pháp quan trọngtrong nông nghiệp, đặc biệt trong sự phát triển để hướng tới một nền nông nghiệp sinhthái bền vững Tuy nhiên tồn tại một số vi sinh vật có khả năng biến N2 trong khíquyển thành NH3 cung cấp đạm cho cây mà chỉ cần một lượng năng lượng rất ít (3-
5kcal/M) như Rhizobium, Azotobacter, Beijerinckia [9] Những vi sinh vật này thường
tồn tại nhiều trong rễ của các loại cây trồng như cây lúa, cây mồng tơi, cây thuộc họđậu,…
Trang 10Xuất phát từ những lý luận và thực tiễn trên cho nên chúng tôi tiến hành thực hiện
đề tài: “Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Rhizobium sp từ
rễ cây lạc (Arachis hypogaea L) trên địa bàn tỉnh Quảng Nam”
2 Mục tiêu của đề tài
Phân lập, tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn Rhizobium sp từ rễ cây lạc (Arachis hypogaea L) trên địa bàn tỉnh Quảng Nam
3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
• Ý nghĩa khoa học
Phân lập và lưu trữ được một số chủng vi khuẩn Rhizobium sp Đây là nguồn
gen cung cấp cho các hướng nghiên cứu chuyên sâu hơn về sinh lý, sinh hóa, di
truyền…
• Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng vi khuẩn sống nội sinhtrong rễ cây họ đậu có hoạt tính cố định đạm cao để sản xuất phân vi sinh có hiệu quả,nâng cao độ phì nhiêu của đất, hạn chế bón phân hóa học, tăng năng suất cây trồng vàgóp phần phát triển một nền nông nghiệp sinh thái bền vững
Trang 11
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Khái quát chung về Rhizobium sp
1.1.1 Lịch sử phát hiện và phân loại vi khuẩn Rhizobium sp
a Lịch sử phát hiện
Năm 1886, Hellriegel và Uynfac đã khám phá ra bản chất của quá trình cố địnhnitơ phân tử Các nhà khoa học đã chứng minh được khả năng của cây họ đậu lấy đượcnitơ khí quyển là nhờ vi khuẩn nốt sần sống ở vùng rễ cây họ đậu và đặt tên cho loài
này là Bacterium radicicola Cuối năm 1889 Frank đề nghị đổi tên là Rhizobium [24]
b Vị trí phân loại chi Rhizobium trong giới vi sinh vật như sau:
Giới: Bacteria, ngành: Proteobacteria, lớp: Alphaproteobacteria, bộ: Rhizobiales,
họ: Rhizobiaceae, chi: Rhizobium
1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lý của vi khuẩn Rhizobium sp
Rhizobium là loại trực khuẩn hình que, kích thước tế bào 0,5-0,9 x 1,2-3
micromet háo khí, gram âm, không sinh nha bào, có tiêm mao mọc theo kiểu đơn hoặcchu mao, có khả năng di động được, khuẩn lạc có màu đục, nhày, lồi, sống trong đất
có vai trò cố định đạm Rhizobium hình thành một nhóm vi khuẩn cộng sinh cố định
đạm sống trong rễ của các cây họ Đậu và Parasponia [6], [24]
Người ta chia vi khuẩn này thành hai nhóm, nhóm sinh trưởng nhanh và nhómsinh trưởng chậm dựa vào thời gian xuất hiện khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy Nhóm sinh trưởng nhanh khuẩn lạc xuất hiện sau 3 5 ngày, có đường kính 2 -
4mm thuộc chi Rhizobium Nhóm sinh trưởng chậm khuẩn lạc xuất hiện sau 5 - 7 ngày nuôi cấy, có đường kính không quá 1mm thuộc chi Bradirhizobium [6], [12]
Trong quá trình phát triển vi khuẩn nốt sần thường có sự thay đổi hình thái Lúc còn non, đa số các loài có hình que, có khả năng di động bằng đơn mao, chùmmao hoặc chu mao tuỳ từng loài Sau đó trở thành dạng giả khuẩn để có hình que phânnhánh, mất khả năng di động Ở dạng này, vi khuẩn nốt sần có khả năng cố định nitơcao nhất Khi già dạng hình que phân nhánh phân cắt tạo thành dạng hình cầu nhỏ[12]
Vi khuẩn nốt sần thuộc loại háo khí, ưa pH trung tính hoặc hơi kiềm, thích hợpvới nhiệt độ 28 - 300C, độ ẩm 60 - 80% Chúng có khả năng đồng hoá các nguồn
Trang 12cacbon khác nhau như các loại đường đơn, đường kép, axit hữu cơ, glyxerin, Đối vớinguồn nitơ, khi cộng sinh với cây đậu, vi khuẩn nốt sần có khả năng sử dụng nitơkhông khí Khi sống tiềm sinh trong đất hoặc được nuôi cấy trên môi trường, chúngmất khả năng cố định nitơ Lúc đó chúng đồng hoá các nguồn nitơ sẵn có, nhất là cácnguồn amôn và nitrat Chúng có thể đồng hoá tốt các loại axit amin, một số có thểđồng hoá pepton Ngoài nguồn dinh dưỡng cacbon và nitơ, vi khuẩn nốt sần còn cầncác loại chất khoáng, trong đó quan trọng nhất là photpho Khi nuôi vi khuẩn nốt sần ởmôi trường có sẵn nguồn đạm lâu ngày, chúng sẽ mất khả năng xâm nhiễm và hìnhthành nốt sần [6], [12]
Sự hình thành nốt sần và quan hệ cộng sinh của vi khuẩn nốt sần với cây bộ đậu.Quan hệ cộng sinh giữa vi khuẩn nốt sần và cây đậu tạo thành một thể sinh lý hoànchỉnh Chỉ trong quan hệ cộng sinh này, chúng mới có khả năng sử dụng nitơ củakhông khí Khi tách ra, cả cây đậu và vi khuẩn đều không thể sử dụng nitơ tự do,không phải tất cả các cây thuộc bộ đậu đều có khả năng cộng sinh với vi khuẩn nốt sần
mà chỉ khoảng 9% trong chúng
Khả năng hình thành nốt sần ở cây đậu không những phụ thuộc vào vi khuẩn cótrong đất mà còn phụ thuộc vào các điều kiện ngoại cảnh khác nhau Về độ ẩm, đa sốcây đậu có thể hình thành nốt sần trong phạm vi độ ẩm từ 40-80%, trong đó độ ẩm tốithích là 60-70% Tuy nhiên, cũng có những trường hợp ngoại lệ, ví dụ như cây điềnthanh có thể hình thành nốt sần trong điều kiện đất ngập nước
Độ thoáng khí của đất cũng ảnh hưởng đến sự hình thành và chất lượng nốt sần.Thường nốt sần chỉ hình thành ở phần rễ nông, phần rễ sâu rất ít nốt sần Nguyên nhân
là do tính háo khí của vi khuẩn nốt sần, thiếu Oxy sẽ làm giảm cường độ trao đổi nănglượng và khả năng xâm nhập vào rễ cây Đối với cây, thiếu Oxy cũng làm giảm sựhình thành sắc tố Leghemoglobin Những nốt sần hữu hiệu có màu hồng chính là màucủa sắc tố này Nhiệt độ thích hợp nhất với hoạt động của vi khuẩn nốt sần là 240C,dưới 100C nốt sần vẫn có thể hình thành nhưng hiệu quả cố định nitơ giảm Ở nhiệt độ
360C cây đậu phát triển tốt nhưng cường độ cố định nitơ lại kém [12]
PH môi trường cũng ảnh hưởng đến sự hình thành và chất lượng nốt sần Có loạichỉ hình thành nốt sần ở pH từ 6,8 đến 7,4 có loại có khả năng hình thành nốt sần, ở
pH rộng hơn từ 4,6 đến 7,5 [6], [12], [16]
Trang 131.2 Một số ứng dụng của vi khuẩn Rhizobium sp
Đa số các vi khuẩn Rhizobium đều có khả năng cố định đạm Cây trồng không
có khả năng sử dụng nitơ hữu cơ mà phải nhờ các VSV phân hủy và chuyển hóa thànhcác dạng nitơ dễ tiêu (NH3 hoặc NH4+), cung cấp nguồn nitơ dinh dưỡng cho cây trồng
Nhờ khả năng cố định đạm này mà VK Rhizobium được ứng dụng vào việc sản xuất
phân phón vi sinh nhằm nâng cao năng suất cây trồng, phát triển một nền nông nghiệpsinh học bền vững [6]
Công nghệ ứng dụng các chế phẩm phân bón sinh học cho thực tiễn sản xuất là
sử dụng các loại chế phẩm hỗn loài , nhiều chủng nhằm làm tăng và ổn định hiệu lực
của chế phẩm Một nghiên cứu cho thấy sự kết hợp hai chủng vi khuẩn Rhizobium và
Agrobacterium trên cây đậu Faba làm cho năng suất cây trồng tăng lên, giảm lượng
phân bón hóa học mỗi năm, cải thiện đất trồng, giảm ô nhiễm môi trường [26]
Theo một số nghiên cứu cho thấy các loài vi khuẩn trong chi Rhizobium có khả
năng tổng hợp nhựa PHB (Poly-β-hydroxybutyrate), một loại nhựa polymer chịu nhiệt,
là nguồn carbon dự trữ ở VSV PHB được coi như là một loại nhựa sạch, không gây ônhiễm môi trường, được áp dụng trong lĩnh vực y dược, nông nghiệp hay công nghiệpthực phẩm PHB được điều chế thành các sản phẩm có giá trị cao như chỉ khâu dùngtrong phẫu thuật, vật liệu gắn kết xương bị gãy, nhựa chịu nhiệt,… [10]
Ngoài ra, vi khuẩn Rhizobium sp có thể tự sản sinh ra được vitamin và các chất
kích thích sinh trưởng , một số nòi khác lấy vitamin từ môi trường sống [6]
1.3 Một số nghiên cứu về vi khuẩn Rhizobium sp trong nước và trên thế giới 1.3.1 Một số nghiên cứu trên thế giới
Năm 2013, Diange E.A, Lee S.S chỉ định AB21T được phân lập từ đất nhiễmchloroethylenes là vi khuẩn gram âm, không hình thành bào tử, và có khả năng dichuyển Phân tích dựa trên trình tự gen 16S rRNA cho thấy nó thuộc về chi
Rhizobium, và có liên quan chặt chẽ đến Rhizobium sullae IS 123T (97,4%), Rhizobium yanglingense SH 22623T (97,2%), Rhizobium gallicum R 602spT (97,1%),
Rhizobium alamii GBV 016T (97,0%) và Rhizobium monogolense USDA 1844T
(97,0%) Quá trình phân lập này tăng trưởng tối ưu ở nhiệt độ 25-370C (tối ưu, 300C)
và pH 6–9 (tối ưu, pH 8,0) Nó phát triển khi có mặt của 0–4% (w/v) NaCl, dung nạp
Trang 144% (w/v) NaCl Dựa trên phân tích đa diện, chủng AB21T được gọi là một loài mới
thuộc giống Rhizobium có tên Rhizobium halotolerans sp nov.[19]
Năm 2015, Lin S.Y phân lập được một loại vi khuẩn Gram âm, hình que, hiếukhí và có khả năng di chuyển, được chỉ định chủng CC-SKC2 (T), được phân lập từ
khối u gốc của cây ớt chuông xanh (Capsicum annuum var Grossum) ở Đài Loan
Các tế bào dương tính với các hoạt động oxidase và catalase và biểu hiện tăngtrưởng ở 25-370C, pH 4,0-9,0 và dung nạp NaCl lên tới 4,0% (w / v) Phân tích dựa
trên trình tự gen 16S rRNA tương tự Rhizobium rhizoryzae KCTC 23652 (T) và
Rhizobium straminoryzae CC-LY845 (T) (97,5%) tiếp theo là Rhizobium lemnae
L6-16 (T) (97,3%), Rhizobium pseudoryzae KCTC 23294 (T) (97,1%) và Rhizobium
paknamense NBRC 109338 (T) (97,0%), trong khi các loài Rhizobium khác có độ
tương đồng nhỏ hơn 96,7% Trên cơ sở các bằng chứng phân loại đa diện của nghiêncứu, chủng CC-SKC2 (T) được đề xuất để đại diện cho một loài mới trong chi
Rhizobium, có tên là Rhizobium capsici sp nov [23]
Năm 2017, Jun-lian Gao, Xu-ming Wang, Fan-uang Lv, Xiao-jie Mao, JianguangSun , phân lập từ mô rễ khử trùng bề mặt của ngô được trồng ở quận Fang Sơn, BắcKinh, Trung Quốc được một chủng vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, hình que mới đượcchỉ định 166T Phân tích trình tự gen 16S rRNA chỉ ra rằng chủng 166T thuộc chi
Rhizobium và có liên quan chặt chẽ với Rhizobium cellulilyticum ALA10B2T và Rhizobium yiltense H66T với độ tương tự trình tự lần lượt là 98,8 và 98,3% Kết quả
của các xét nghiệm sinh lý, sinh hóa của chủng 166T từ các chủng loại của các loài có
liên quan chặt chẽ với R cellasilyticum DSM 18291T và R yantense CCTCC AB
2014007T Chủng 166T được đề xuất để đại diện cho một loài mới thuộc trong chi
Rhizobium, với tên Rhizobium wenxiniae sp nov [22]
Năm 2017, Sameh H Youseif, Fayrouz H Abd El-Megeed, Saleh A Saleh, cácthí nghiệm thực địa được thực hiện qua hai mùa sinh trưởng liên tiếp đã chứng minhrằng nốt sần, tổng lượng nitơ hấp thụ, năng suất, thành phần của đậu faba có thể đượccải thiện đáng kể thông qua việc sử dụng kết hợp chế phẩm Rhizobium và
Agrobacterium từ hai chủng vi khuẩn Rhizobium và Agrobacterium Kết quả của
nghiên cứu còn cho thấy khả năng sử dụng chủng này để phát triển chế phẩm đậu faba
Trang 15thương mại và để đạt năng suất cây trồng tốt hơn, giảm lượng phân bón hóa học mỗinăm, cải thiện đất trồng, giảm ô nhiễm môi trường [26]
1.3.2 Một số nghiên cứu trong nước
Năm 2012, Lai Chí Quốc, Nguyễn Thị Dơn và Cao Ngọc Diệp đã phân lập đượchai mươi tám dòng VK được phân lập trên môi trường Aleksandrov từ hai mươi mẫuvật liệu phong hóa của đá hoa cương đều có khả năng tổng hợp ammonium trong môitrường Burk‘s Trong đó, có 5/28 dòng tổng hợp NH4+ cao Giải trình tự 3/5 dòng VK
đã tuyển chọn và sử dụng phần mềm BLAST N để so sánh với trình tự các dòng vikhuẩn có trong GenBank của NCBI Kết quả cho thấy, dòng vi khuẩn CA10 có tỉ lệ
đồng hình cao với dòng AY117623.1 Rhizobium tropici PRF34 tỉ lệ 99%, dòng CA18
có tỉ lệ đồng hình cao với dòng JF496331.1 Bacillus subtilis A2-9 với tỉ lệ 99%, dòng CA29 có tỉ lệ đồng hình cao với dòng JN896359.1 Rhizobium multihospitium CC-13H
với tỉ lệ 99% Đánh giá khả năng cố định đạm của hỗn hợp ba dòng vi khuẩn này trên
Hành lá (Allium fistulosum sp.) và Mồng tơi (Basella alba L.) cho thấy các dòng vi
khuẩn này giúp cây phát triển chiều cao, trọng lượng và năng suất [3]
Năm 2016, Nguyễn Thi Minh và Nguyễn Thanh Nhàn tuyển chọn được tổ hợpgiống vi sinh vật gồm 5 chủng giống có đặc tính sinh học tốt và có khả năng cộng sinh
cao với rễ cây, trong đó có 3 chủng Rhizobium (Shinorhizobium fredii M1,
Bradyrhizobium japonicum và Bradyrhizobium vigna) và 2 chủng Arbuscular mycorrhizae (Gigaspara sp1, Acaulospora sp1) để làm giống sản xuất vật liệu sinh
học Vật liệu sinh học từ Arbuscular mycorrhizae và Rhizobium phát huy được hiệu
quả hiệp đồng của nấm rễ và vi khuẩn nốt sần, khi sử dụng tái tạo thảm cỏ có tác dụnglàm tăng cường khả năng sinh trưởng phát triển của cây trồng, góp phần cải thiện tínhchất đất, đặc biệt tỉ lệ che phủ ở công thức sử dụng VLSH đạt 95,63% cao hơn hẳn sovới đối chứng (chỉ đạt 54,6%) nên có tiềm năng ứng dụng để tạo tiểu cảnh cho cáckhuôn viên nhỏ hẹp mà đất nghèo dinh dưỡng [11]
Năm 2017, Nguyễn Thành Luân, Nguyễn Thị Liên Thương, Nguyễn Thị QuỳnhMai, Nguyễn Minh Chánh, khi khảo sát hàm lượng và thời gian thu nhận nhựa PHB ở
3 chủng CR2, RB3, RC3 cho thấy chủng VK CR2 hoang dại có khả năng sinh tổnghợp PHB cao nhất đạt 39,84% trong thời gian 48 giờ và đạt giá trị màu sắc tốt nhất khi
Trang 16hòa tan bằng H2SO4 đậm đặc Kết quả định danh cho thấy chủng CR2 là loài
Rhizobium gallicum, RB3 là loài Agrobacterium tuminfaciens
Cấu trúc PHB thu nhận được giống với cấu trúc của PHB thương phẩm Nghiêncứu chuyên sâu về PHB là tiềm năng phát triển cho một nền công nghiệp và nôngnghiệp xanh, cải tiến các phương pháp sản xuất nhựa PHB ở quy mô công nghiệptrong vật liệu mới thay thế [10]
Trang 17CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu rễ cây lạc thu nhận ở xã Quế Châu, huyện Quế Sơn, tỉnh Quảng Nam
- Các chủng vi khuẩn Rhizobium sp được phân lập từ các mẫu rễ cây trên
2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.2.1 Địa điểm thu mẫu
Một số mẫu rễ cây lạc được lấy từ các địa điểm khác nhau thuộc xã Quế Châu,huyện Quế Sơn, tỉnh Quảng Nam
2.2.2 Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm (PTN) Vi sinh - sinh lý thực vật - hóa sinh, PTN Công nghệsinh học, PTN Sinh học phân tử thuộc khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học SưPhạm, Đại học Đà Nẵng
2.2.3 Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 8/2018 đến tháng 4/2019
2.3 Hóa chất, thiết bị
2.3.1 Hóa chất
- Các loại đường chuẩn: Glucoza, Fructoza, Saccaroza, Mannitol
- Các hóa chất khác: K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, Na2SO4, CaCO3, NaCl,Cao nấm men, Công gô đỏ, Peptone, FeCl3.6H2O, NaMoO4.2H2O, CaCl2, FeSO4.7H2O,NaOH, KOH, NH4Cl, KI, HgCl2, ZnSO4, KNaC4H4O6, Agar, …
2.3.2 Thiết bị
Tủ cấy thổi khí vô trùng, tủ ấm, tủ sấy, nồi hấp, máy lắc ổn nhiệt, kính hiển vi,cân điện tử, dụng cụ thủy tinh, máy so màu,…
2.4 Nội dung nghiên cứu
Đề tài tập trung nghiên cứu các nội dung sau:
- Nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn Rhizobium sp từ rễ cây lạc (Arachis
hypogaea L) cố định đạm trong trên địa bàn tỉnh Quảng Nam
- Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, nuôi cấy của chủng vi khuẩn được tuyểnchọn
- Nghiên cứu các đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn được tuyển chọn
Trang 18- Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng kĩ thuật sinh học phân tử
2.5 Phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Sơ đồ bố trí thí nghiệm thể hiện ở hình 2.1
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.5.2 Phương pháp thu mẫu
Lấy các mẫu rễ cây lạc phải tốt, rễ phải có nốt sần to, nhiều kẻ sọc trắng, màuhồng ở thời kì cây đang ra hoa và phải đảm bảo các mẫu không bị biến đổi trong thờigian từ khi lấy mẫu tới khi phân tích
Trang 19Tiến hành: dùng kéo, dao mổ vô trùng cắt khoảng 2g mẫu cho vào túi ziplock vôtrùng, đậy kín, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu, ngày tháng, bảo quản trong thùng nước
đá và được vận chuyển về phòng thí nghiệm, giữ ở 4oC Các mẫu được phân lập ngaykhông quá 24h [7], [14]
2.5.3 Phương pháp phân lập
Cách tiến hành:
- Cân 1-2g mẫu rễ Nốt sần có nhiều tạp khuẩn, phải tiệt trùng trước khi phân lập.Rửa sạch nốt sần, lấy kéo cắt nốt sần ra khỏi rễ Chú ý không làm nốt sần xây xát Chonốt sần vào nước trong rửa sạch, cho cồn 95º vào trong 3 phút rửa sạch, cho tiếp vàodung dịch HgCl2 0.1% trong 5 phút, rửa bằng nước vô trùng 5 đến 6 lần Sau đó dùngcối nghiền nát nốt sần, cho vào cốc thêm 2ml nước cất [3], [20]
- Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch trên cho vào ống nghiệm chứa sẵn 9mlnước cất vô trùng, lắc đều ta được độ pha loãng 10-1 Tiếp tục pha loãng như vậy đến
độ pH loãng 10-4, 10-5 Dùng pipet vô trùng hút ở mỗi độ pha loãng 100µl dịch mẫu vànhỏ vào đĩa petri có chứa môi trường YMA đã được hấp khử trùng ở
121oC trong vòng 15 phút Sau đó dùng que trang trải đều giọt dung dịch khắp mặtthạch Mỗi nồng độ pha loãng cấy trên 3 đĩa petri, bao gói cẩn thận và nuôi cấy trong
tủ ấm ở nhiệt độ 28 - 30oC trong 3 -7 ngày để tạo thành các khuẩn lạc riêng lẽ [16]
- Làm thuần giống: Cấy ria các khuẩn lạc được lựa chọn lên các đĩa petri chứamôi trường đặc để thu khuẩn lạc đơn Quá trình làm thuần được tiến hành 2 đến 3 lần.Chọn khuẩn lạc đơn đã được làm thuần cấy chuyền vào ống thạch nghiêng để giữgiống [7], [16]
2.5.4 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào và các test hóa sinh của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn
a Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào
Nhuộm Gram
Nguyên tắc: Do sự khác biệt về cấu trúc vách tế bào nên trong quá trình nhuộmGram, vi khuẩn Gram (+) sẽ giữ được phức hợp tím không bị tẩy màu bởi alcoholtrong khi Gram (-) không giữ được phức hợp màu này Do vậy, sau khi nhuộm, vikhuẩn Gram (+) vẫn giữ được màu tím còn vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng củafuchsin [4], [7], [11]