NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP NANO BẠC CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS LICHENIFORMIS PHÂN LẬP TỪ PHÂN CHIM CÚT

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG PHAN PHƯỚC THANH THUẬN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP NANO BẠC CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS LICHENIFORMIS PHÂN LẬP TỪ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

PHAN PHƯỚC THANH THUẬN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP NANO BẠC CỦA

CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS LICHENIFORMIS PHÂN LẬP TỪ

PHÂN CHIM CÚT

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS ĐOÀN THỊ VÂN

Đà Nẵng, Tháng 04 năm 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác

Đà Nẵng, tháng 4 năm 2018

Tác giả luận văn

PHAN PHƯỚC THANH THUẬN

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến TS Đoàn Thị Vân đã tận tình hướng dẫn,

trực tiếp truyền đạt những kinh nghiệm quý báu để em hoàn thiện được khóa luận tốt nghiệp,

cũng như cô đã luôn tìm kiếm cơ hội để nhóm nghiên cứu vi sinh chúng em nâng cao được kiến

thức và kỹ năng nghề nghiệp sau này Cảm ơn cô đã động viên em trong suốt quá trình thực hiện

khóa luận

Xin cảm ơn TS Phạm Thị Mỹ (giáo viên chủ nhiệm), ThS Lê Thị Mai (cán bộ quản lý

phòng thí nghiệm vi sinh) cùng các thầy cô ở Khoa Sinh – Môi Trường, Đại học Sư Phạm – Đại

học Đà Nẵng đã giúp đỡ em trong quá trình thực nghiệm đề tài nghiên cứu

Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn đến các bạn trong nhóm nghiên cứu vi sinh ứng dụng, đã

hỗ trợ nhiệt tình trong suốt thời gian qua Cảm ơn tập thể lớp 15CNSH, bạn bè và gia đình đã

động viên tôi trong suốt thời gian làm khóa luận

Xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên thực hiện

Phan Phước Thanh Thuận

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 9

1 Đặt vấn đề 9

2 Mục tiêu đề tài 10

3 Ý nghĩa của đề tài 10

3.1 Ý nghĩa khoa học 10

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 10

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ NANO VÀ NANO BẠC 11

1.1.1 Vật liệu nano 11

1.1.2 Hạt nano bạc 12

1.1.3 Một số ứng dụng của nano bạc 15

1.1.4 Các phương pháp chế tạo nano bạc 16

1.2 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ BACILLUS LICHENIFORMIS 19

1.2.1 Phân loại khoa học vi khuẩn Bacillus licheniformis 19

1.2.2 Đặc điểm phân bố 20

1.2.3 Đặc điểm hình thái, sinh hóa 20

1.2.4 Đặc điểm nuôi cấy 20

1.2.5 Cơ chế tổng hợp nano bạc và nhận diện nano bạc 21

1.3 Một số nghiên cứu sinh tổng hợp nano bạc từ vi sinh vật ở trong nước và trên thế giới 24

1.3.1 Một số nghiên cứu trên thế giới 24

1.3.2 Một số nghiên cứu trong nước 24

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 25

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 25

2.2 Nội dung nghiên cứu 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 26

2.3.2 Phương pháp thu mẫu và phân lập 27

2.3.3 Phương pháp định danh chủng vi khuẩn bằng kĩ thuật sinh học phân tử 27

2.3.4 Phương pháp phá vỡ tế bào vi khuẩn 27

2.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ AgNO 3 đến quá trình sinh tổng hợp nano bạc của Bacillus licheniformis 28

2.3.6 Khảo sát thời gian sinh tổng hợp nano bạc của Bacillus licheniformis 28

2.3.7 Phân tích phổ tử ngoại và phổ khả kiến (UV – Vis) 28

2.3.8 Phân tích giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) 28

2.3.9 Phân tích kích thước hạt và hình dạng hạt nano bạc tạo thành thông qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 28

2.3.10 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch nano bạc 29

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 30

3.1 Phân lập, định danh vi sinh vật 30

3.1.1 Phân lập, định danh chủng vi khuẩn trong phân chim cút đã ủ hoai 30

3.2 Khảo sát thời gian đến quá trình sinh tổng hợp nano bạc 35

3.2.1 Phân tích phổ tử ngoại và phổ khả kiến (UV – Vis) 35

3.3 Kết quả phân tích nhiễu xạ tia X (XRD) 38

3.4 Kết quả phân tích kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 38

3.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ AgNO 3 đến quá trình sinh tổng hợp nano bạc 32

3.5.1 Kết quả kháng khuẩn theo phương pháp khuếch tán qua giếng thạch 32

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

1 Kết luận 40

2 Kiến nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

UV – Vis Ultraviolet – Visible

TEM Transmission Electron Microscopy

XRD X-ray diffraction

ở nồng độ 2mM AgNO3 (Đơn vị: mm) 3.3 Vị trí đỉnh hấp thu và cường độ hấp thu của dung dịch nano

bạc tổng hợp từ CT3 3.4 Vị trí đỉnh hấp thu và cường độ hấp thu của dung dịch nano

bạc tổng hợp từ CT2

DANH MỤC HÌNH ẢNH

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, khoa học và công nghệ nano đang phát triển mạnh mẽ, đó là một trong những công nghệ tiên tiến hiện nay với rất nhiều lĩnh vực được ứng dụng trong y học, điện tử, nông nghiệp, xử lý môi trường, Với kích thước nano mét các loại vật liệu nano có thể can thiệp điến từng phân tử - nguyên tử, điều này đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu ứng dụng công nghệ nano trong Y – Sinh học

Bạc là một trong những kim loại có tính sát khuẩn mạnh, từ lâu con người đã biết ứng dụng nó, và hiện nay thì công nghệ nano bạc đóng vai trò khá quan trọng trong các nghiên cứu

về vật liệu nano Nghiên cứu chỉ ra rằng khi ở kích thước nano (từ 1 đến 100 nm), hoạt tính sát khuẩn của bạc tăng lên khoảng 50000 lần so với bạc dạng khối, như vậy 1 gam bạc nano có thể sát khuẩn cho hàng trăm mét vuông chất nền [4] Điều này sẽ làm cho khối lượng bạc sử dụng trong các sản phẩm sẽ giảm mạnh, nên tỷ trọng của bạc trong giá thành trở nên không đáng kể Nano bạc có tính kháng khuẩn mạnh, vô hiệu hóa hầu như tất cả các enzyme cần thiết cho sự trao đổi oxy của vi khuẩn và tiêu diệt chúng trong vài phút, ngoài ra các hạt bạc với kích thước nhỏ chui vào trong tế bào, kết hợp với các enzyme hay DNA có chứa nhóm sunfua hoặc photphate gây bất hoạt enzyme hay DNA dẫn đến gây chết tế bào Nano bạc không gây tác dụng phụ, không gây độc cho con người và vật nuôi khi nhiễm lượng bạc bằng nồng độ diệt khuẩn (khoảng nồng độ nhỏ hơn 100ppm), không gây ô nhiễm môi trường Vì vậy nano bạc đang được ứng dụng rộng rãi Trong nông nghiệp, ứng dụng công nghệ nano bạc đang được nhiều quốc gia xem là một hướng để phát triển một nên nông nghiệp hiệu quả, kinh tế và an toàn hơn, phòng trị các bệnh do vi khuẩn, vi rút, nấm, gây ra trên cây trồng, vật nuôi, bảo quản nông sản Trong ngành may mặc, nano bạc có thể ứng dụng để tạo ra các loại quần áo có khả năng diệt khuẩn, vi khuẩn gây mùi hôi, mốc Đặc biệt, nghiên cứu tổng hợp nano bạc để phục vụ cho các ứng dụng trong y học, nhất là hiện tượng vi khuẩn kháng kháng sinh ngày càng phổ biến như hiện nay

Có nhiều phương pháp để tổng hợp nano bạc, trong đó các phương pháp hóa học, vật lý, hóa lý kết hợp thường gây nhiều tác động xấu đến môi trường, chi phí đầu tư tốn kém, giá thành cao lại khó sản xuất rộng rãi Vì vậy, tổng hợp nano bạc bằng con đường sinh học đang là một

xu hướng mạng tính tất yếu Phương pháp tổng hợp này tạo ra các hạt nano bạc tiêu chuẩn về kích thước và phân bố tốt hơn so với các phương pháp khác đồng thời mở ra triển vọng sản xuất với qui mô lớn Các hạt nano cũng có thể được ổn định ngay trong quá trình sản xuất bởi các polymer sinh học Ở Phương pháp sinh học thì tác nhân chính sinh tổng hợp nano bạc chính là các vi nấm, vi khuẩn Với thời gian sinh trưởng ngắn, quá trình sinh tổng hợp tạo ra kích thước hạt nhỏ và đồng đều, không tốn dung môi hóa học và không gây ảnh hưởng môi trường nên các

loài vi nấm hay vi khuẩn là đối tượng đang được nghiên cứu Trong đó, Bacillus licheniformis

là vi khuẩn có khả năng sinh trưởng ở phổ nhiệt cao và môi trường nuôi cấy thông thường, nó

là vi khuẩn được ứng dụng trong công nghiệp khi sản sinh ra nhiều enzyme ngoại bào chịu nhiệt

như protease, amylase, lipase v.v Như vậy B licheniformis có

Nhằm tiếp cận với phương pháp và xuất phát từ những lý luận, thực tiễn nêu trên, tôi tiến

hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp nano bạc của chủng vi khuẩn

Bacillus licheniformis phân lập từ phân chim cút”

2 Mục tiêu đề tài

Phân lập được chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis từ phân chim cút

Đánh giá khả năng sinh tổng hợp nano bạc của vi khuẩn Bacillus licheniformis phân lập được

3 Ý nghĩa của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả của nghiên cứu sẽ cung cấp dẫn liệu khoa học có giá trị tham khảo cho sinh viên,

kĩ thuật viên về loài Bacillus licheniformis được định danh, cũng như khả năng tổng hợp nano bạc từ loài Bacillus licheniformis

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Thành công của khóa luận sẽ xác định được một số điều kiện sinh tổng hợp nano bạc từ

vi khuẩn Bacillus licheniformis có ý nghĩa trong việc ứng dụng tạo nên các vật liệu, sản phẩm

nano bạc phục vụ trong các ngành y học, nông nghiệp, điện tử, môi trường, v.v

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ NANO VÀ NANO BẠC

1.1.1 Vật liệu nano

Khoa học nano là khoa học nghiên cứu vật chất ở kích thước cực kì nhỏ bé – kích thước nanomet (nm), một nanomet bằng một phần tỉ của mét (m) hay bằng một phần triệu của milimet (mm) Công nghệ nano là các công nghệ liên quan đến việc thiết kế, phân tích, chế tạo, ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điều khiển hình dáng, kích thước ở quy mô nanomet (từ 1 – 100nm) Vật liệu nano là đối tượng của hai lĩnh vực khoa học nano và công nghệ nano

Năm 1959, khái niệm về công nghệ nano được nhà vật lý người Mỹ Richard Feynman nhắc đến khi ông đề cập đến khả năng chế tạo vật chất ở kích thước siêu nhỏ đi từ quá trình tập hợp các nguyên tử, phân tử Những năm 1980, nhờ sự ra đời của hàng loạt các thiết bị phân tích, trong đó có kính hiển vi đầu dò quét (SEM hay TEM) có khả năng quan sát đến kích thước vài nguyên tử hay phân tử, con người có thể quan sát và hiểu rõ hơn về lĩnh vực nano

Phân loại vật liệu nano

Vật liệu nano không chiều (cả ba chiều đều có kích thước nano), ví dụ đám nano, hạt nano

Vật kiệu nano một chiều là vật liệu trong đó có một chiều tự do, hai chiều có kích thước nano, ví dụ dây nano, ống nano

Vật liệu nano hai chiều là vật liệu trong đó hai chiều tự do, một chiều có kích thước nano,

ví dụ màng mỏng (có chiều dày kích thước nano)

Ngoài ra còn có vật liệu có cấu trúc nano hay nanocomposite trong đó chỉ có một phần của vật liệu có kích thước nm, hoặc cấu trúc của nó có nano không chiều, một chiều, hai chiều đan xen lẫn nhau

Hạt nano kim loại

Hạt nano kim loại là một khái niệm để chỉ các hạt có kích thước nano được tạo thành từ các kim loại Khi nghiên cứu, các nhà khoa học đã thiết lập các phương pháp chế tạo và hiểu được các tính chất thú vị của hạt nano Một trong những tính chất đó là màu sắc của hạt nano phụ thuộc rất nhiều vào kích thước và hình dạng của chúng [3]

Ví dụ, ánh sáng phản xạ lên bề mặt vàng ở dạng khối có màu vàng Tuy nhiên, ánh sáng truyền qua lại có màu xanh nước biển hoặc chuyển sâng màu da cam khi kích thước hạt thay đổi Hiện tượng thay đổi màu sắc như vậy là do một hiệu ứng gọi là cộng hưởng plasmon bề mặt Chỉ có các hạt nano kim loại, trong đó các điện tử tự do mới có hấp thụ ở vùng ánh sáng khả kiến làm cho chúng có hiện tượng quang học trên [13]

1.1.2 Hạt nano bạc

Bạc nano là những hạt bạc có kích thước nằm trong khoảng 0,1 đến 100nm Bạc nano thường ở dưới dạng các dung dịch keo với các chất bảo vệ là các polymer (polyvinylalcol PVA, polyethylenglycol PEG, polyvinyl pyrolidone PVP) để các hạt nano bạc không bị kết tụ Bạc ở kích thước nano có những đặc trưng rất khác so với bạc bình thường Đó là một kháng sinh tự nhiên và rất mạnh, có khả năng phòng ngừa nhiều bệnh truyền nhiễm Tính chất kháng khuẩn của dung dịch keo nano bạc đã được tìm hiểu một cách khoa học vào đầu thế kỉ 20, Nhưng sự phát minh ra thuốc kháng sinh đã ngăn cản những nghiên cứu sâu trong lĩnh vực này Những năm gần đây, do công nghệ nano phát triển và do các kháng sinh càng ngày càng bị lờn với vi khuẩn, nên việc nghiên cứu ứng dụng nano bạc trrong lĩnh vực Y sinh học được quan tâm nghiên cứu và phát triển mạnh mẽ [13]

Nhìn chung, nano bạc có những đặc điểm đáng quan tâm sau đây:

Diệt trên 650 loại vi khuẩn

Hiệu quả cao

Tác dụng nhanh

Không độc

Không kích thích

Không gây dị ứng

Tính kháng khuẩn của nano bạc được giải thích theo một số cơ chế sau:

Với tính chất xúc tác, nano bạc vô hiệu hóa các enzyme mà vi khuẩn và nấm cần cho quá trình trao đổi chất của tế bào dẫn đến rối loạn quá trình biến dưỡng của vi khuẩn Tác động này làm cho vi khuẩn bị tiêu diệt nhanh chóng [9]

Hạt nano bạc liên kết với các nhóm chứa phospho trong phân tử DNA làm rối loạn quá trình sao chép DNA làm chết vi khuẩn [11]

Các hạt nano bạc tương tác với nhóm –SH của các protein, enzyme trên màng tế bào dẫn đến sự thay đổi hình thái và gia tăng tính thấm của màng Sự vận chuyển vật chất qua màng tăng làm vỡ màng tế bào của vi khuẩn [11]

Nano bạc giúp tạo ra các oxygen hoạt tính từ trong nước hoặc không khí tương tác với các lipid màng làm tổn thương màng [11]

Hình 1.1 Cơ chế diệt khuẩn của nano bạc

Nhờ có kích thước rất nhỏ (0,1nm – 100nm), Diện tích bề mặt tổng cộng của nano bạc rất lớn và hiệu quả hoạt động của nano bạc tăng đáng kể so với hạt bạc có kích thước lớn hơn (micro) Đây là ưu điểm của hạt nano bạc so với hạt bạc có kích thước lớn và với ion Theo tính toán lý thuyết nano bạc có hoạt tính mạnh hơn ít nhất 40 lần trên mỗi đơn vị bạc so những dung dịch keo bạc thông thường Vì vậy, người ta có thể sử dụng ít bạc hơn để đạt được hiệu quả tương đương Điều này rất có ý nghĩa vì theo EPA (Environmental Protection Agency), một người chỉ có thể dùng tối đa 350 µg/ liều dùng mỗi ngày, nếu nhiều hơn sẽ bị hiện tượng Argyria hay còn gọi là trúng độc bạc Nếu dùng 1 đến 2 muỗng cà phê/ngày (20ppm) tương đương 100 – 200 μg/ngày (thấp hơn so với khuyến cáo của EPA về hàm lượng bạc trong nguồn nước cung cấp ở Mỹ), ta sẽ có hiệu quả phòng bệnh rất tốt Điều này đảm bảo cho người dùng có thể sử dụng nano bạc như một chất bổ sung trong bữa ăn hay trong nước uống mà không bị hiện tượng Argyria [13]

Về ảnh hưởng của nano bạc đến sức khỏe con người, các nhà khoa học cho rằng nano bạc có khả năng diệt vi khuẩn, mà tiêu hóa của con người có được là do các vi khuẩn có lợi cho

cơ thể và vì thế, họ vẫn nghi ngờ rằng các hạt nano bạc cũng có thể diệt các vi khuẩn này và ảnh hưởng đến sức khỏe Tuy nhiên cho đến nay chưa thấy công trình nào công bố sự tác hại của nano bạc Các nghiên cứu tại Odense Universitets Hospital [13] cũng đã chứng minh rằng các hạt nano bạc được hấp thu vào trong cơ thể mà không hề gây ra một tác dụng phụ nào cúng như gây độc cho cơ thể Các nhà khoa học còn chứng minh các hạt nano bạc sẽ được giải phóng ra

cơ thể theo thời gian [13] Các hãng sản xuất những sản phẩm chức nano bạc chẳng hạn như Samsung phát biểu rằng các sản phẩm của họ đều được thử nghiệm và cho đến nay họ vẫn khẳng định tính an toàn của nó đói với sức khỏe của người sử dụng [3]

1.1.3 Một số ứng dụng của nano bạc

Trong y học

Một số sản phẩm chứa nano bạc như khăn ăn, khăn vệ sinh khô cho cả bé lẫn người lớn, băng đắp bỏng, đắp vết thương, găng tay, quần áo dùng trong y tế với khả năng diệt khuẩn cao tới 99%

Hãng dược phẩm Nucryst ở Fort Saskachevan, Alberta (Canada) đã đưa bạc nano vào miếng băng gạc để băng những vết loét do bỏng vì chúng có tác dụng diệt khuẩn mạnh hơn so với hạt bạc bình thường

Trong công nghiệp

Bạc nano được đưa vào các polymer như polyethylene (PE), polypropylene (PP) có khả

năng giết chết nhiều loại vi khuẩn: tụ cầu khuẩn vàng, Bacillus pneumoniae, E.coli Ứng dụng

của việc phân bố nano trong các chất dẻo, polymer, hiện nay người ta đã sản xuất các mặt hàng tiêu dùng có tính kháng khuẩn chứ các hạt nano bạc như tủ lạnh; máy điều hòa; máy giặt, trong máy giặt công nghệ nano bạc tạo thành hệ thống diệt khuẩn của máy mà không cần phải đun sôi nước, cách làm trên vừa ít hao tốn điện năng những vẫn đảm bảo hiệu quả; ngoài ra còn ứng dụng vào bình sữa cho trẻ sơ sinh; hộp đựng thực phẩm v.v

Hãng Mummybear (Hàn Quốc) gần đây đã giới thiệu công nghệ Nano Silver được ứng dụng vào sản xuất bình sữa và dụng cụ đựng thức ăn cho trẻ Những sản phẩm này đã được bộ

y tế, Viện dinh dưỡng, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm, Vinacontrol cấp chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm và chất lượng

Ngoài ra, ngày nay người ta còn ứng dụng nano bạc trong các sản phẩm như nước rửa rau, các loại sơn, mỹ phẩm, v.v

Trong nông nghiệp

Sản phẩm thuốc trừ bệnh cây MIFUM 0,6 DD được sản xuất với nồng độ hạt nano bạc 1000ppm và chitosan 5000ppm MIFUM 0,6 DD được khảo nghiệm trừ bệnh đạo ôn, lem lép hạt trên lúa thuộc địa bàn tỉnh Lâm Đồng và đã được chứng tỏ ưu việt của mình, cả 2 liều lượng 0,5 lít MIFUM 0,6 DD và 1 lít MIFUM 0,6 DD/ha đều cho hiệu quả cao trong việt phòng trừ bệnh đạo ôn cổ bông, lem lép hạt trên lúa, nhất là trong giai đoạn 3 – 7 ngày sau khi phun

Trong công nghệ xử lý nước

Việc sử dụng nano bạc trong công nghệ xử lý nước khá mới mẻ Do bề mặt riêng khá lớn, hạt nano bạc có hoạt tính khá cao trong vấn đề xử lý nước nhiễm khuẩn và đã được khá nhiều nhà khoa học nghiên cứu [10] Phòng thí nghiệm Công nghệ Nano đã sử dụng vật liệu

polyurethane mút xốp tẩm nano bạc (PU/Ag) để xử lý nước uống nhiễm khuẩn E.coli Nước qua

hệ thống lọc PU/Ag không còn vi khuẩn và uống được theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) [5]

1.1.4 Các phương pháp chế tạo nano bạc

Có hai phương pháp để tạo vật liệu nano, phương pháp từ dưới lên và phương pháp từ trên xuống Phương pháp từ dưới lên là tạo hạt nano từ các ion hoặc các nguyên tử kết hợp lại với nhau Phương pháp từ trên xuống là phương pháp tạo vật liệu nano từ vật liệu khối ban đầu

Đối với hạt nano kim loại như hạt nano vàng, bạc, bạch kim, thì phương pháp thường được áp dụng là phương pháp từ dưới lên Nguyên tắc là khử các ion kim loại như Ag+, Au+ để tạo thành các nguyên tử Ag và Au Các nguyên tử sẽ liên kết với nhau tạo ra hạt nano Các phương pháp từ trên xuống ít được dùng hơn nhưng thời gian gần đây đã có những bước tiến trong việc nghiên cứu theo phương pháp này

Ag, Au, Pt, Pd, Rh với kích thước từ 10 đến 100 nm có thể được chế tạo từ phương pháp này

vào dung dịch[2]

Phương pháp khử sinh học

Phương pháp sinh học sử dụng các tác nhân như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm có khả năng khử ion bạc tạo nguyên tử bạc kim loại

Từ lâu người ta đã biết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc giữ vai trò quan trọng trong việc xử lý các độc tố kim loại nhờ khả năng khử các ion kim loại Sastry và cộng sự [10] đã nhận thấy có sự hình thành các hạt nano vàng khi cho loài nấm Verticillum sp tiếp xúc với ion vàng Klaus và cộng sự [7] cũng đã chứng minh được có sự hiện của nano bạc trong vùng chu chất của Pseudomonas stutzeri AG259 khi cho vi khuẩn này tiếp xúc với dung dịch bạc nitrate Tuy nhiên việc áp dụng đặc tính khử kim loại để biến vi sinh vật thành các nhà máy sản xuất các hạt nano kim loại chỉ mới được quan tâm đến trong thời gian gần đây [8]

Phương pháp này có nhiều ưu điểm như: thiết bị nuôi cấy đơn giản, môi trường nuôi cấy

rẻ tiền, không phụ thuộc nhiều vào hóa chất và thiết bị đắt tiền, dễ thực hiện, thân thiện với môi trường do không sử dụng các hóa chất độc hại Ngoài ra nó có thể áp dụng với quy mô sản xuất lớn mà chi phí đầu tư ban đầu lại rất thấp Vì vậy, các nhà nghiên cứu ngày càng quan tâm đến các phương pháp sinh tổng hợp Phương pháp sinh tổng hợp tạo ra các hạt nano bạc có độ phân

bố khá đồng đều và có khả năng sản xuất với qui mô lớn do các hạt được ổn định ngay trong quy trình sản xuất bởi các protein

Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp nano bạc:

Nấm: Fusarium oxysporum, Fusarium semitectum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus

flavus, Phaenerochaete chrysosporium, Penicillium fellutanum, Verticillium sp…v.v

Vi khuẩn: Pseudomonas stutzeri,, Lactobacillus sp, Bacillus licheniformis, Bacillus

subtilis, Klebsiella pneumonia…v.v

Xạ khuẩn: Rhodococcus sp, Thermomonospora…v.v

Cơ chế của quá trình tổng hợp nano bạc ở vi sinh vật vẫn chưa được tìm hiểu tường tận nhưng đa số giả thuyết cho rằng quá trình này liên quan đến hoạt động của enzyme khử nitrate (nitrate reductase) do vi sinh vật tiết ra Quá trình khử bắt đầu bởi sự vận chuyển electron từ các chất cho electron đến Ag+ để khử các ion Ag+ tạo thành các nguyên tử Ag Các enzyme phụ

thuộc NADH như nitrate reductase đóng vai trò chất vận chuyển điện tử Bên cạnh các enzyme này, một số naphthoquinone và anthraquinone tìm thấy ở nấm Fusarium oxysporum cũng có thể đóng vai trò chất truyền điện tử trong quá trình khử kim loại bởi tính chất oxi hóa khử đặc trưng của chúng [7], [17]

Dựa vào vị trí của các đám nguyên tử nano bạc được tổng hợp mà người ta chia quá trình tổng hợp sinh học thành hai dạng:

Tổng hợp nội bào: sản phẩm nano bạc tạo ra nằm bên trong tế bào Các chủng vi sinh vật

có khả năng tổng hợp nano bạc nội bào là Psedomonas stutzeri [8], Rhodococcus sp, Verticillium

sp, Bacillus licheniformis [19]

Vì sản phẩm nano bạc tạo ra nằm trong tế bào nên để nhận được sản phẩm cần phải phá

vỡ màng tế bào bằng hóa chất hoặc sóng siêu âm, sau đó ly tâm tách bỏ các mãnh vỡ tế bào Theo S.Basavaraja [18] ưu điểm của quá trình này là có thể kiểm soát được kích thước hạt nano bạc

Tổng hợp ngoại bào: sản phẩm được tạo ra nằm bên ngoài tế bào vi sinh vật Các chủng

Fusarium oxysporum [7], Fusarium semitectum [18], Aspergillus fumigatus [8], Aspergillus flavus [15], Phaenerochaete chrysosporium [18], Lactobacillus sp [22], Penicillium fellutanum [23],… tổng hợp nano bạc theo kiểu này

Để thu sản phẩm nano bạc ngoại bào cần dùng các phương pháp tách tế bào ra khỏi dịch nuôi cấy như ly tâm, lọc… sau đó thu lấy phần dịch nổi

Theo tài liệu [18], ưu điểm của quá trình này là không cần đến các phương pháp phá màng tế bào để thu nhận sản phẩm

1.2 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ BACILLUS LICHENIFORMIS

1.2.1 Phân loại khoa học vi khuẩn Bacillus licheniformis

Giới: Bacteria

Ngành: Firmicutes

Bacillus licheniformis là vi khuẩn thường được tìm thấy trong đất Nó được tìm thấy trên

lông chim, đặc biệt là ngực và lưng bộ lông, và thường xuyên nhất trong các loài chim ở trên

mặt đất và các loài chim thủy sinh B licheniformis còn được tìm thấy và phân lập ở các suối

nước nóng [18]

1.2.3 Đặc điểm hình thái, sinh hóa

Hình thái: Là vi khuẩn Gram dương, hình que, có khả năng di động và khả năng

Tạo nội bào tử (endospore) [18] gần như hình cầu giúp nó tồn tại trong thời gian dài khi gặp điều kiện sống khắc nghiệt

Bộ gen: Có chiều dài là 4,22Mb chứa khoảng 4200 gen mã hóa cho 4192 protein [17]

Đặc điểm sinh hóa: B licheniformis cho phản ứng catalase dương tính, sử dụng khí oxy

làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất Có thể tổng hợp một lượng lớn enzyme amylase và protease [1] Có khả năng gây ngộ độc thực phẩm với các triệu chứng như: đau bụng, tiêu chảy, nôn mữa [7]

1.2.4 Đặc điểm nuôi cấy

Là vi khuẩn chịu nhiệt có thể sống ở nhiệt độ 55oC, pH thích hợp cho sự phát triển là pH=7

Không giống với các thành viên khác trong chi Bacillus là các vi sinh vật hiếu khí,

Bacillus licheniformis là vi sinh vật kị khí tùy ý

Sau 18 – 20 giờ nuôi cấy, vi khuẩn mọc thành váng trên bề mặt môi trường Bacillus

licheniformis dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường, khuẩn lạc có màu trắng đục,

lồi, bề mặt sần sùi

Vi khuẩn này thường được sử dụng trong công nghiệp chất tẩy, bột giặt, xử lý nước thải

do có khả năng tiết enzyme protease, amylase ngoại bào, ngoài ra còn được dùng làm thuốc trừ nấm bệnh trên cây trồng

1.2.5 Cơ chế tổng hợp nano bạc và nhận diện nano bạc

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy vi khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp

nano bạc nội bào khi cho nó tiếp xúc với dung dịch muối nitrate bạc [19]

Cơ chế của quá trình tổng hợp nano bạc ở loài này vẫn chưa được xác định cụ

thể Nhưng theo nhóm tác giả [19] thì B licheniformis có khả năng tổng hợp NADH

và các enzyme phụ thuộc vào NADH ở bên trong tế bào của nó, trong đó quan trọng

nhất là enzyme nitrate reductase (enzyme khử nitrate) Enzyme này có vai trò khử

gốc NO3- và vận chuyển electron từ chất cho electron là NADH đến chất nhận là Ag+

để khử Ag+ thành Ag0

Hình 1.2 Cơ chế tổng hợp nano bạc ở vi khuẩn Bacillus licheniformis