Tiến hành khảo sát với 4 loại acid sẵn có là HCl, H2SO4, H3PO4 và acid
citric. Các mẫu nguyên liệu đều được thủy phân với 100 ml dung dịch acid có nồng độ IM trong 60 phút. Quá trình chiết và kết tinh đều được tiến hành trong những điều kiện giống nhau. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3:
STT Loại acid Khối lượng sản
phẩm (g)
Hàm lượng G-AA (%)
Khối lượng G-AA thực (g)
1 H3PO4 0,2910 ±0,02 85,82 0,2497
2 H2SO4 0,3015 ±0,01 74,54 0,2247
3 HCl 0,1992 ±0,02 82,66 0,1647
4 Acid citric 0,2645 ±0,01 89,15 0,2358
Bảng 3.3- Khảo sát ảnh hưởng của loại acid dùng thủy phân
Kết quả cho thấy, thủy phân bằng H2SO4 cho khối lượng sản phẩm cao
nhất nhưng hàm lượng G-AA trong sản phẩm thấp nhất, vì vậy khối lượng G- AA thực thu được không cao. Nguyên nhân có thể do trong quá trình thủy
phân kéo dài ở nhiệt độ cao (60°C), H2SO4 đã làm phân hủy một phần
gossypol. Hơn nữa, H2SO4 là acid rất mạnh, nếu sử dụng trong sản xuất ở qui
mô lớn sẽ không an toàn. Mặt khác, khi thủy phân bằng HCl và H2SO4, do là
khó khăn cho quá trình lọc thu dịch chiết. Điều này cũng có thể làm giảm số lượng cũng như chất lượng sản phẩm. Cụ thể là, bã nguyên liệu vụn bít kín màng lọc, dẫn đến thời gian lọc tăng đáng kể, tức là tăng thời gian dịch chiết bị tiếp xúc với oxy không khí, làm tăng khả năng gossypol bị oxy hóa. Vì vậy,
k h ô n g c h ọ n HCl và H 2S O 4 c h o b ư ớ c th ủ y p h â n n g u y ê n liệ u .
Thủy phân bằng acid citric và H3PO4 thì khối lượng G-AA thực thu
được nhiều hon khi dùng 2 acid còn lại. Trong đó, dùng H3PO4 để thủy phân
cho kết quả cao nhất. Hofĩi nữa, với mục đích có thể tận dụng được những phụ
phẩm trong quá trình chiết xuất, H3PO4 được lựa chọn. Vì bã nguyên liệu sau
khi thủy phân bằng H3PO4 có thể ché biến thêm thành phân bón cho cây trồng.
Vậy lựa chọn H3PO4 cho bước thủy phân.
3.1.6.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch H3PO4 dùng thủy phân
Trong nghiên cứu của Michael Dowd và cộng sự trên nguyên liệu là soapstock đã trình bày ở chương I, nồng độ acid và thời gian thủy phân đã
được khảo sát. Theo đó, thủy phân bằng H3PO4 nồng độ 0,6 M thì khối lượng
G-AA thực thu được ít hơn hẳn so với các nồng độ khác. Thời gian thủy phân có ý nghĩa quan trọng khi dùng acid ở nồng độ 1 M, nhưng lại ít ảnh hưởng hơn khi dùng các nồng độ acid cao 1,4 M và 1,8 M. Nghiên cứu trên cũng cho thấy khối lượng sản phẩm thu được cao nhất khi thủy phân bằng acid 1,8 M
trong 1 giờ, và khi tăng thời gian thủy phân cũng cho kết quả với sự khác biệt
không đáng kể. Tương tự, khi thủy phân bằng acid 1,4 M, khi thời gian thủy
phân lớn hơn hoặc bằng 2 giờ thì kết quả thu được khác nhau không đáng kể
[27].
Vì vậy, để khảo sát nồng độ acid phosphoric dùng thủy phân, tôi tiến
IM/ 2 giờ; 1,4 M/ 1 giờ; 1,4 M/ 2 giờ và 1,8 M/ 1 giờ. Quá trình chiết và kết tinh tiến hành trong điều kiện như nhau. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4;
STT Nồng độ acid H3PO4 Khối lượng sản phẩm (g) Hàm lượng G-AA (%) Khối lượng G- AA thực (g) 1 1 M/ 1 giờ 0,2910 ±0,02 85,82 0,2497 2 1,4 M/ 1 giờ 0,2934 ± 0,02 96,97 0,2836 3 1,8 M/ 1 giờ 0,3318 ±0,01 93,35 0,3097 4 lM /2 g iờ 0,4716 ±0,01 81,83 0,3859 5 l,4 M /2 g iờ 0,5176 ±0,02 82,89 0,4290
Bảng 3.4- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acỉd và thời gian thủy phân
Kết quả cho thấy, thủy phân bằng acid nồng độ 1,4 M cho sản phẩm có hàm lượng G-AA cao hon so với các nồng độ còn lại, và dùng acid 1,4 M trong 2 giờ khối lượng G-AA thực thu được là cao nhất. Nguyên nhân là acid nồng độ IM không đủ mạnh để thủy phân hoàn toàn gossypol ở dạng liên kết, trong khi đó acid 1,8M mạnh hơn nhiều nên không chỉ thủy phân gossypol liên kết mà còn phân cắt nhiều hợp chất khác gây ra nhiều tạp. Quá trình lọc bã nguyên liệu để thu dịch lọc khó khăn hơn khi dùng nồng độ acid cao hơn, hoặc thời gian thủy phân dài hơn, do khi thủy phân lâu hoặc acid mạnh hơn mức cần thiết đều làm nguyên liệu vụn nát, điều này cũng góp phần tăng thêm tạp trong dịch chiết.
Vì vậy, chọn dung dịch H3PO4 1,4 M cho bước thủy phân, và thời gian
3.1.7. Tóm lại
Sau khi khảo sát 4 yếu tố trên, tôi đưa ra điều kiện tối ưu để chiết
gossypol từ hạt cây bông G. hirsutum (giống D I6-2) là:
- 50 g nguyên liệu được thủy phân bằng 100 ml dung dịch acid H3PO4,
nồng độ 1,4 M, thời gian thủy phân 2 giờ, nhiệt độ 60°c.
- Chiết nguyên liệu bằng hỗn hợp dung môi aceton : n ư ớ c : lần chiết đầu
230 ml aceton (tương đương với 330 ml hỗn hợp aceton : nước = 7:3), lần 2 với 200 ml hỗn hợp aceton : nước = 9:1, lần 3 với 150 ml hỗn hợp aceton : nước = 9:1. Thực hiện ở 60^c, mỗi lần chiết 30 phút.
Với điều kiện chiết này, từ 50 g nguyên liệu ban đầu cho 0,5176 g sản phẩm có hàm lượng gossypol là 82,89% —^ hiệu suất của cả quá trình là
0,8 6% so với nguyên liệu nhân hạt bông ban đầu.
Qui trình xây dựng ở trên có hiệu suất cao vì chúng tôi không chỉ chiết được gossypol ở dạng tự do mà còn chiết được gossypol ở dạng liên kết với protein hoặc phospholipid. Để kiểm chứng điều này, chúng tôi tiến hành chiết soxhlet theo phương pháp của tác giả Lê Thị Xoan [2] với 50 g nguyên liệu (là qui trình chiết được toàn lượng gossypol tự do trong nhân hạt bông). Cao chiết DEE thu được đem định lượng để tính ra hàm lượng gossypol tự do có trong
50 g nguyên liệu. Toàn lượng cao được hòa tan trong CHCI3, rồi định mức
vừa đủ đến 500 ml. Lấy 1 ml dung dịch trên vào bình định mức 50 ml rồi định
mức bằng CHCI3 thu được dung dịch có nồng độ gossypol khoảng 2 0 I^g/ml.
Dung dịch này được đo độ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 365 nm thu được độ hấp thụ trung bình là 0,431. Thay vào đường chuẩn đã xây dựng, thu được nồng độ gossypol thực trong dung dịch là c = y= 12,11 ^g/ml. Tính ra lượng gossypol tự do có trong 50 g nguyên liệu là 0,3028 g tương ứng chiếm 0,61% khối lượng nhân hạt bông ban đầu.
*Ảp duns điều kiên chiết xuất trên,chúng tôi tiến hành trên mẻ lớn với
300 g nguyên liệu là bột nhân hạt bông G. hirsutum giống VN-36P.
300 g nguyên liệu được thủy phân trong 600 ml dung dịch H3PO4 1,4 M
trong thời gian 2 giờ. Sau đó chiết 3 lần với lượng dung môi như sau: lần một; 1,4 1 aceton (tương đương với 2 lít hỗn họp dung aceton : nước = 7:3); lần hai: 1,2 1 hỗn họp aceton : nước = 9:1; lần ba: 0,9 1 hỗn họp aceton : nước = 9:1.
Cuối giai đoạn chiết thu được 32,50 g cao.
Kết tinh: Hòa tan lượng cao trên trong 12 ml aceton, sau đó thêm từ từ
6 ml acid acetic rồi để kết tinh trong 24 giờ. Sản phẩm kết tinh lần 1 (G-AA
thô) có khối lượng là 2,4338 g. Kết tinh lại một lần nữa với lượng aceton và acid acetic như trên thu được 1,8658 g. Sản phẩm thu được đem tiến hành SKLM với gossypol đối chiếu, hệ dung môi khai triển: n-hexan/ethyl acetate/acid acetic = 9/ 1 / 0 ,4 ; t h u ố c thử hiện màu: H2SO4 20% trong EtOH . Cho thấy có một vết duy nhất tương ứng với vết của gossypol đối chiếu, kết quả như hình 3.5. Sản phẩm có độ tinh khiết là 81,23%.
Hiệu suất của mẻ lớn này là 0, 51%.
Nhận xét: khi áp dụng qui trình vào mẻ lớn hơn (gấp 6 lần mẻ thí
nghiệm) thì hiệu suất thu được giảm so với khi tiến hành ở mẻ nhỏ (0,8 6%). Có thể do 2 nguyên nhân sau: thứ nhất là nguyên liệu sử dụng ở mẻ thí
nghiệm và mẻ lón là 2 giống khác nhau, thứ hai điều kiện chiết trên tuy đã
được chuẩn hóa ở mẻ nhỏ, nhưng khi nâng qui mô lên thì không thể chính xác hoàn toàn theo như vậy mà cần phải tiếp tục điều chỉnh cho phù hợp với máy móc thiết bị và điều kiện sản xuất, từ đó mới có được qui trình chuẩn.
Tuy nhiên hiệu suất thu được 0,51% vẫn cao hơn hiệu suất qui trình của tác giả Nguyễn Kim Phi Phụng (0,28%) [30], và tác giả Lê Thị Xoan (0,32%)
[2]. Mặt khác, qui trình của tác giả Nguyễn Kim Phi Phụng khi chiết 1 kg
ml acid acetic băng để kết tinh. Trong khi đó, áp dụng qui trình chúng tôi đưa
ra chỉ cần dùng 2 lít dung dịch H3PO4 1,4 M; 11 lít aceton và 40 ml acid acetic
để kết tinh.
Hình 3.5: SKLM của sản phẩm chiết được ở mẻ lớn so sảnh
với gossypoỉ đối chiểu
(1). Gossypol đổi chiếu; (4). G-AA thu được
Điều đó cho thấy qui trình được chúng tôi xây dựng có nhiều ưu điểm, không chỉ tiết kiệm dung môi, cho hiệu suất cao hơn các phương pháp tìirớc đây. Đặc biệt qui trinh không sử dụng dung môi đắt tiền và dễ cháy nổ là DEE. Qui trình đcm giản và có thể áp dụng ở qui mô pylot.
KẾT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT
Kết luận:
Trong quá trình thực hiện luận văn, chúng tôi đã thu được một số kết quả như sau:
- Nghiên cứu thành công qui trình chiết xuất và t i n h chế gossypol từ
nhân hạt cây bông Gossypium hỉrsutum giống D 16-2. Qui trình này không chỉ
chiết được gossypol dạng tự do mà còn chiết được gossypol liên kết trong nhân hạt bông. Qui trình đơn giản, dễ thực hiện, có khả năng áp dụng ra qui mô lớn.
- Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng trong qui trình chiết tách gossypol, từ đó rút ra qui trình đơn giản, ổn định, tiết kiệm dung môi, cho sản phẩm có
hàm lượng gossypol cao và đạt hiệu suất 0,8 6%.
- Sản phẩm thu được có hàm lượng gossypol cao, mẻ cho kết quả cao nhất đạt 96,97%, chứng tỏ giai đoạn kết tinh khá hoàn thiện.
- Thử nghiệm qui trình đã chọn trên hạt cây bông G. hỉrsutum giống
VN-36P ở qui mô lớn (gấp 6 lần qui mô thí nghiệm) thu được sản phẩm có
hàm lượng gossypol đạt 81,23%, hiệu suất đạt 0,51%.
Đề xuất:
- Nâng cấp qui trình lên qui mô pylot.
- Tiến hành nghiên cứu qui trình tách đồng phân (-)-gossypol ra khỏi hỗn hợp racemic, và tối ưu hóa qui trình này.
TIÉNG VIỆT
1. Võ Văn Chi (2007), Sách tra cứu tên cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản giáo
dục, Hà Nội.
2. Lê Thị Xoan, (2009), Nghiên cứu phân lập và tác dụng gây độc của
gossypol từ hạt bông {Gossypỉum barbadense) trên một số dòng tế bào
ung thư, Luận văn Thạc sĩ khoa học, Trường Đại học khoa học tự nhiên.
TIẾNG ANH
3. Adlakha, R.c, C.L. Ashom, D. Chan and L.A. Zwelling, (1989), Modulation of 4'-(9-acridinylamino) methanesul-fon-m-anisidide-induced,
topoisomerase Il-mediated DNA cleavage by gossypol, Mutation Res.,
49, pp. 2052-2058.
4. Anonymous, National Coordinating Group on Male Fertility, (1978), A
new Male Contraceptive Drug, Cotton Phenol (gossypol), Chin. Med.
J.(Engl), 4, pp. 417- 428 .
5. Benz c .c , Keniry, M.A., Ford J. M, Townsend A.J., Cox, s. w , Palayoor,
S.. Martlin, s. A., Hait, w . N et al., (1990), “Biochemical coưlerates of antitumor and antimitochrondrial properties of gossypol enantiomer”,
Mol.Pharmacol., 37, pp. 840- 847.
6. Burgos c , Gerez De Burgos NM, Rovaile, Blanco A., (1986), “In vitro
inhibition by gossypol of oxidireductases from human tissues”., Biochem.
8. Coutinho E. M., (2002), Gossypol: a contraceptive for men,
Contraception., 65, pp. 259-263.
9. E. F. Carruth. J, (1918), Contribution to the Chemistry of gossypol, the
toxic principle of cottonseed, JAOCS, 40, pp. 647- 663.
10. Edwards JD, (1958), Total synthesis of gossypol, J. Am. Chem. Soc, 80,
pp. 3798-3799.
11. Flack MR, Pyle RG, Mullen NM et al., (1993), Oral gossypol in the
treatment of metastatic adrenal cancer, J. Clin. Endocrinol. Metab., 76(4),
pp. 1019-1024.
12. Flack MR, Pyle RG, Sullen NM et al., (1993)., Oral gossypol in the
treatment of metastatic adrenal cancer, J Clin Endocrinol Metab., 76, pp.
1019-1024.
13. Floridi A, S D'Atri, R. Menichini, M.L. Marcante, A. Nista, B. Silvestrini, A. Caputo and C. De Martino., (1983), The effect of the association of gossypol and lonidamine on the energy metabolism of Ehrlich ascites
tumor cells, Exp Mol. Pathol, 38, pp. 322-335.
14. Ford, J.M, W.N.Hait, S.A.Matlin and C.C. Benz., (1991), “Modulation of resistance to alkylating agents in cancer cell by gossypol enantiomers”,
Cancer Lett., 56, pp. 85-94.
15. Gonzalez- Garza MT, Matlin SA, Mata- Cardenas B, Said- Fernandez S., (1993), Differential effects of the (+) and (-) gossypol enantiomers upon
(2009), An improved Ultrasound- assisted extraction process of G-AA
from cottonseed soapstock, American Institute o f Chemical engineers
Journal, 55(3), pp. 797- 806.
17. Guoping Wang, Zaneta Nikolovska- Coleska, Chao- Yie Yang, Renxiao Wang, Guozhi Tang, Jie Guo, Sanjeev Shangary, Su Qiu, Wei Gao, Dajun Yang, Jennifer Meagher, Jeanne Stuckey, Krzysztof Krajewski, Sheng Jiang, Peter p. Roller, Hatice Ozel Abaan, York Tomita, Shaomeng Wang, (2006), Structure-Based design of potent small molecule inhibitors of anti-
apoptotic Bcl-2 proteins, Med, Chem., 49(21), pp. 6139-6142.
18. Hron R J, Koltun p.s, Pominski J, Abraham G, (1987), The potential
commercial aspects of gossypol, JAOCS, 64(9), pp. 1315- 1319.
19. Hron R. J, Kim L.H, Calhoun C.M, Fisher S.G, (1999), Determination of
(+)- (-)- and total gossypol in cottonseed by HPLC, JAOCS, 76(11), pp.
1351- 1355.
20. James A, Kenar, (2006), Reaction chemistry of gossypol and its
derivatives, JAOCS, 83(4), pp. 269- 302.
21. Jaroszewski JW, Strom- Hansen T, Hansen SH, Thastrup o, Kofod H,
(1992), On the botanical distribution of chiral forms of gossypol, Planta
Med., 58, pp. 454-458.
22. Jaroszewski JW, Kaplan o, Cohen JS, (1990), “Action of gossypol and
Wang, Kenneth J. Pienta, Cheryl T. Lee, (2008), (-)-gossypol promotes the
apoptosis of bladder cancer cells in vitro, Pharmacol Res., 58, pp. 323-
331.
24. King TJ, DE Silva LB, (1968), Optically active gossypol from Thespesia
Populnea, Tet. Lett, 3, pp. 261-263.
25. Lin TS, Schinari R, Griffith BP et al, (1989), Selective inhibition of
human immunodeficiency virus type 1 by the (-) but not the (+)
enantiomer of gossypol, Antimicrob. Agents Chemother, 3(12), pp. 2149-
2151.
26. Me Clarty GA, Chan AK, Creasy DC, Wright JA, (1985), Ribonucleotide reductase; an intracellular target for the male antifertility agent, gossypol,
Biochem, Biophys. Res. Commun., 133(1), pp. 300-305.
27. Michael K. Dowd, Scott M. Pelitire, (2001), Recovery of gossypol acetic
acid from cottonseed soapstock, Industrial Crops and Products, 14, pp.
113-123.
28. Michael K. Dowd, Scott M. Pelitire, (2008), HPLC preparation of the
chiral form of 6-methoxy-gossypol and 6,6’-dimethoxy-gossypol, Journal
o f Chromatography B, 867, pp. 68-77.
29. Montamat EE, Burgos c, Gerez De Burgos NM, Rovai LE, Balanco A,
Segura EL, (1982), Inhibitory action of gossypol on enzymes and growth
31.Radloff RJ, Deck LM, Royer RE, Vander Jagt DL, (1986), Antiviral activities of gossypol and its derivatives against herpes simplex vims type
Pharmacol Res. Commun, 18(11), pp. 1063- 1073.
32. Razakantoanina V, Phung NKP, Jaureguiberry G, (2000), Antimalarial
activity of new gossypol derivatives, Parasit. Res, 8 6, pp.665- 6 6 8.
33. Rosenberg, L.J., R.c. Adlakha, D.M.Desia and P.N. Rao., (1986),
“Inhibition of DNA polymerase by gossypol”, Biochim. Biophys. Acta.,
866:258-267.
34. Shelley M.D., Hartley L., Groundwater PW et al., (2000)., “ Structure
activity studies on gossypol in tumor cell lines”, Anticancer Drugs., 11(3),
pp. 209-216.
35. Shelley M.D., Hartley L., Fish R.G., Groundwater p., Morgan JJ.G., Mort D., Mason M., Evans A. (1999), “Stereo-specific cytotoxic effect of
gossypol enantiomers and gossypolone in tumor cell lines”. Cancer Lett.,
135, pp.
36. Stein RC, Joseph AEA, Matlin SA et al., (1992), “A preliminary clinical
study of gossypol in advanced human cancer”, Cancer Chemother.
Pharmacol, 30, pp. 480-482.
37. Vainio p, Thuren T, Wichman K, Luukkainen T, Kinnunen PK, (1985), Hydrolysis of phospholipids monolayers by human spermatozoa.
Inhibition by male contraceptive gossypol, Biochim. Biophys. Acta,