Cao chiết thu được ở trên được chuyển vào bình cầu dung tích 100 ml, sau đó được hòa tan trong 2 ml aceton, rồi thêm từ từ 1 ml acid acetic (tỉ lệ
acid acetic : aceton = 1:2). Bọc kin bình, rồi tiến hành kết tũủi ở điều kiện trên trong ứiời gian 24 giờ. Sau đó, đem lọc hút chân không, rửa tinh thể G-AA bằng ether dầu (30”C- 60^C) cho đến khi dung dịch rửa hết màu. Tinh thể G- AA được sấy trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ phòng, rồi được cân bàng cân phân tích, tíiu được 0,2514 g. Sản phẩm G-AA thô này còn lẫn nhiều dầu và các chất màu khác nên vẫn có màu vàng nâu và dễ bị oxy hóa trong quá
trình bảo quản, vi vậy kết tinh lại 1 lần nữa ừong hệ dung môi aceton : acid
acetic để thu được sản phẩm G-AA sạch hon có màu vàng tươi, khối lượng là 0,2301 g. Hiệu suất của quá trình kết tinh lại là 91,5%.
Hình 3.1: SKLM của cao chiết so sảnh với gossypoỉ đổi
chiếu
(l):Gossypol đổi chiếu; (2): Cao chiết.
Sản phẩm được bảo quản trong lọ kín, tránh ánh sáng, ở nhiệt độ -10°c. Trong quá ừình kết tinh tôi nhận thấy rằng sản phẩm kết tinh lần 1 ở tất cả các mẫu đều có màu vàng nâu do còn lẫn nhiều tạp là dầu béo mà kết tinh một lần chưa thể loại hết được. Do đó sản phẩm thô này không dùng để xác định hàm lượng G-AA cũng như túih hiệu suất của quá trình. Vì vậy tất cả các
1 để loại bớt tạp chất. Sản phẩm G-AA thu được sau khi kết tinh lại lần 2 được coi là sản phẩm cuối cùng của quá trình chiết tách. Tất cả các số liệu liên
quan đều được đo và phân tích trên sản phẩm kết tinh lần 2 này.
3A.4. Kiểm tra cẩu trúc gossypol acid acetìct tách được
Sản phẩm G-AA thu được đem tiến hành SKLM với chất chuẩn đối chiếu, hệ dung môi khai ữiển: n-hexan/etìiyl acetate/acid acetic = 9/l/0,4 ;
thuốc thử hiện màu: H2SO4 20% trong EtOH. Cho thấy có một vết duy nhất
(Rf = 0,21) tương ứng với vết của gossypol đối chiếu (Rf = 0,22). (Hình 3.2)
Sản phẩm G-AA thu được đem đo độ quay cực, đo điểm chảy, đo phổ hấp thụ tử ngoại, phổ hồng ngoại và phổ k h ố i, thu được kết quả như sau;
Hình 3,2: SKLM của sản phẩm chiết tách được so sánh
với gossypoỉ đổi chiếu
(1). Gossypol đối chiếu; (3): G-AA thu được
[a ]o - 0°
Điểm chảy (Mp): 189- 191®c. (G-AA kết tinh trong MEK có điểm chảy Mp=187*^C[16]).
u v (Ằ„,ax , CHCI3) : 2 4 2 , 2 8 8 , 3 6 4 nm. (Hình 3.3)
IR (KBr, cm'’): V = 3426 (-OH), 2930 (-COOH), 1711 (C=0). 1614,
1579 (C=C). 1444. 1341 (CatiQ), 1176, 1052, 846. (Phụ lục 2)
Trên phổ MS, chỉ ra pic [M-H]^ M = 517. Khối lượng phân tử của
gossypol (CsoHsoOs) là 518. (Phụ lục 3)
Kết quả này phù hợp với các dữ liệu đã công bố của G-AA [16 Từ đó, kết luận rằng chất tách được chính là gossypol.
2.0-1 <ỉ> < 1.5 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 800 W a v e le n g th (n m )
Hình 3.3: Phổ u v của sản phẩm G-AA thu được
3.1.5, Định lượng hàm lượng gossypol trong sản phẩm thu được
* Xây dựng đường chuẩn: Cân chính xác 0,0523 g G-AA chuẩn đối
chiếu, định mức bằng CHCI3 vừa đủ trong bình định mức 100 ml, lắc kĩ, thu
được dung dịch gốc có nồng độ 0,0523 mg/ml (m/v) . Dùng micropipette hút chính xác lần lượt 100, 200, 300, 400, 500 |il dung dịch gốc, cho vào các bình
dịch chuẩn có nồng độ tương ứng lần lượt là 5, 10, 15, 20, 25 I^g/ml. Sau đó đo độ hấp thụ của từng dung dịch chuẩn ở bước sóng 365 mn. Mỗi dung dịch chuẩn đo lặp lại 3 lần, tính giá trị trung bình.
Thu được đường chuẩn có phương trình là; y = 27,127x + 0,4138
(R^ = 0,9957) (Hình 3.4)
trong đó: X là độ hấp thụ trung bình tại bước sóng 365 nm
y là nồng độ G-AA (|xg/ml)
* Định lượng sản phẩm chiết tách được:
Cân chính xác 0,0038 g sản phẩm tách được vào bình định mức 10 ml
và định mức bằng CHCI3. Lắc kĩ. Lấy chính xác 0,5 ml dung dịch vừa thu
được cho vào bình định mức 10 ml khác rồi tiếp tục định mức bằng CHCI3,
thu được dung dịch mẫu thử có nồng độ 19 ng/ml. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 365 nm, đo lặp lại 3 lần. Kết quả, độ hấp thụ trung bình là 0,417. Thay vào đường chuẩn ở trên, thu được nồng độ thực của dung dịch
mẫu thử là c = y= 11,726 |xg/ml.
Vậy hàm lượng G-AA trong sản phẩm = (Cthực / Cií thuyết) X 100% =
3.1.6. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng trong qui trình chiết xuất
Nghiên cứu của của Michael Dowd và cộng sự cho thấy các yếu tố trong quá trình chiết tách như nồng độ acid dùng thủy phân nguyên liệu, lượng dung môi... đều ảnh hưởng đến hàm lượng G-AA trong sản phẩm và hiệu suất của quá trình. Vì vậy, chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát một số yểu tố ảnh hưởng đến qui trình đã được chọn, từ đó từng bước hoàn thiện để qui trình đạt hiệu suất cao hơn. Các yểu tố chúng tôi khảo sát bao gồm: tỉ lệ hỗn hợp dung môi aceton : nước, lượng dung môi chiết, loại acid dùng để thủy phân, nồng độ acid dùng để thủy phân.
3.1.6.1. Khảo sát ảnh hưỏng của tỉ lệ hỗn họp dung môi aceton : nước
Tiến hành khảo sát các tỉ lệ hỗn hợp dung môi aceton : nước lần lượt là 7:3, 8:2, 9:1 và 10:0. Nguyên liệu sau khi thủy phân với 100 ml dung dịch acid phosphoric IM sẽ được chiết 3 lần nữa với hỗn hợp dung môi có tỉ lệ tương ứng như trên. Do trong dung dịch acid đã có xấp xỉ 100 ml nước, nên lần chiết thứ nhất chỉ thêm aceton sao cho đạt được hỗn hợp dung môi có tỉ lệ cần khảo sát. Đối với tỉ lệ 7:3 chỉ cần 233,33 ml aceton, nhưng khi khảo sát tỉ lệ 8:2 thì cần 400 ml aceton, và tỉ lệ 9:1 thì cần đến 900 ml aceton. Nếu lần chiết thứ nhất này dùng hỗn hợp aceton : nước tỉ lệ 8:2 hoặc 9:1 thì lượng dung môi cần dùng khá lớn. Điều này gây khó khăn khi áp dụng qui trình vào qui mô lớn hơn, vì sẽ tốn rất nhiều dung môi và thiết bị chiết có thể không đáp ứng được dung tích. Hơn nữa, aceton là dung môi rất dễ bay hơi, như vậy lượng dung môi hao phí sẽ rất lớn, và dẫn đến tăng giá thành sản phẩm. Do đó, khi tiến hành khảo sát để tìm ra tỉ lệ hồn họp aceton : nước họp lí (vừa chiết được tối đa có thể gossypol ra khỏi nguyên liệu, vừa tiết kiệm dung môi) tôi quyết định chọn lượng dung môi cho lần chiết đầu cố định là 230 ml aceton (tương đương với 330 ml hỗn hợp aceton/nước = 7/3).
Các bước chiết với DCM, cô thành cao, kết tinh và tinh chế tiến hành như mô tả ở mục 3.1.2 và 3.1.3. Sản phẩm G-AA sạch sau khi kết tinh lần 2 được đem đo độ hấp thụ tại bước sóng 365 nm để xác định độ tinh khiết.
Khối lượng sản phẩm thu được, hàm lượng G-AA trong sản phẩm, và khối lượng G-AA thực có trong sản phẩm trong quá trình khảo sát được tóm tắt ở bảng 3.1. STT Tỉ lệ aceton : nước Khối lượng sản phẩm (g) Hàm lượng G- AA (%) Khối lượng G- AA thực (g) 1 7:3 0 ,2 2 1 1 ± 0 ,0 1 61,71 0,1364 2 8 :2 0,2716 ±0,01 69,49 0,1887 3 9:1 0,2828 ± 0,0 1 76,75 0,2170 4 1 0 :0 0,2574 d= 0,02 77,83 0,2003
Bảng 3.1 : Khảo sát ảnh hưởng của tỉ ỉệ aceton : nước
Từ kết quả bảng 3.1 cho thấy khi tăng tỉ lệ aceton trong hỗn hợp dung môi thì khối lượng sản phẩm thu được tăng, hàm lượng G-AA thực trong sản phẩm cũng có xu hướng tăng. Chiết bằng hỗn hợp dung môi có tỉ lệ aceton : nước (9:1) cho khối lượng G-AA thực cao nhất. Mặt khác, khi tăng tỉ lệ aceton trong hỗn hợp dung môi thì sản phẩm G-AA thô có màu vàng sáng hơn. Lí do là gossypol sau khi đã bị thủy phân trở về dạng tự do thì tan tốt trong aceton, tỉ lệ aceton càng cao càng chiết được nhiều gossypol ra khỏi nguyên liệu.
Tuy nhiên, khi chiết bằng dung môi aceton không chứa nước (tỉ lệ aceton : nước = 10:0) thì khó lọc tinh thể G-AA thô sau khi kết tinh. Nguyên nhân do khi không có nước, độ phân cực của dung môi chiết giảm vì vậy tăng
khả năng hòa tan dầu béo. Lượng dầu trong cao chiết nhiều, nên khi kết tinh làm cản trở sự va chạm của các tiểu phân G-AA, do đó tinh thể thu được rất mịn. Vì vậy quá trình lọc thu tinh thể G-AA thô rất khó khăn, và tinh thể lẫn rất nhiều dầu nên có màu vàng nâu đậm. Đồng thời tỉ lệ dung môi 10:0 cũng hòa tan nhiều tạp hơn. Những nguyên nhân trên dẫn tới khối lưọng G-AA thực thu được thấp hơn so với khi chiết bằng hỗn hợp 9:1.
Từ két quả trên, kết luận rằng tỉ lệ aceton : nước tối ưu là 9:1. ở tỉ lệ này hỗn hợp dung môi có độ phân cực phù hợp để chiết tối đa lượng gossypol có trong nguyên liệu, mặt khác, do có nước làm tăng độ phân cực của dung môi nên hạn chế việc hòa tan các tạp ít phân cực và dầu béo. Sản phẩm thu được do đó không những nhiều mà còn có hàm lượng G-AA cao. Vì vậy, ở các thí nghệm khảo sát về sau đều dùng hỗn họp dung môi là aceton ; nước có tỉ lệ 9:1 để chiết gossypol toàn phần ra khỏi nguyên liệu.
3 .1.6.2 Khảo sát ảnh hưởng của lượng dung môi chiết
Lượng dung môi đang dùng là: lần chiết đầu dùng 230 ml aceton (tương đương với 330 ml hỗn họp aceton : nước = 7/3, sau đó chiết 2 lần bằng hỗn hợp aceton : nước = 9:1 là 150 ml và 100 ml. Trong quá trình chiết chúng tôi
nhận thấy sau 2 lần chiết, đặc biệt là sau khi thủy phân bằng acid thì nguyên
liệu bị trương nở nhiều. Lần chiết thứ 3 dùng 100 ml hỗn hợp dung môi không đủ làm ngập hết bã nguyên liệu, lượng dung môi này có thể không đủ để chiết hết gossypol còn trong nguyên liệu. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của lượng dung môi chiết, nhằm tìm ra được lượng dung môi hợp lí; vừa chiết được tối đa có thể gossypol ra khỏi nguyên liệu, vừa tiết kiệm dung môi.
- Điều kiện 1: lần chiết đầu 230 ml aceton, sau đó chiết 2 lần với 150 ml, 100 ml hỗn hợp dung môi tỉ lệ 9:1.
- Điều kiện 2: 230 ml aceton, sau đó chiết 2 lần với 200 ml, 150 ml hỗn hợp dung môi tỉ lệ 9:1.
- Điều kiện 3: 230 ml aceton, sau đó chiết 3 lần với 300 ml, 300 ml, và 250 ml hỗn hợp dung môi tỉ lệ 9:1.
Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.2
STT Điều kiện dung
môi Khối lượng sản phẩm (g) Hàm lượng G- AA (%) Khối lượng G-AA thực 1 Điều kiện 1 0,2828 ± 0 ,0 1 76,75 0,2170 2 Điều kiện 2 0,2910 ±0,02 85,82 0,2497 3 Điều kiện 3 0,2819 ±0,02 90,41 0,2548
Bảng 3.2- Khảo sát ảnh hưởng của ỉượng dung môi chiết
Từ kết quả bảng 3.2 cho thấy chiết ở điều kiện 1 thu được ít sản phẩm hon hai điều kiện còn lại. Điều đó cho thấy lưọTig dung môi đã dùng (230 ml, 150 ml, 100 ml) chưa chiết hết gossypol ra khỏi nguyên liệu. Chiết ở điều kiện
2 hết 545 ml aceton, thì quá trình chiết tách cho hiệu suất là 0,50%. Chiết ở
điều kiện 3 hết 995 ml aceton thì quá trình chiết tách cho hiệu suất là 0,51%. Như vậy, so sánh giữa 2 điều kiện ta thấy ở điều kiện 3 thu được nhiều hơn 0,01% tương ứng với 0,0051 g G-AA nhưng lại dùng tốn hơn 450 ml aceton. Tính lên lô sản xuất lớn thì cứ 1 kg nguyên liệu chiết ở điều kiện 3 sẽ thu được thêm 0,102 g G-AA nhưng lại cần thêm 9 lít aceton so với điều kiện 2. Xét tương quan giữa lợi ích và hao phí, tôi chọn điều kiện chiết thứ 2 để thu được lượng gossypol lớn nhất mà tốn ít dung môi nhất có thể.
Vậy, các khảo sát về sau, nguyên liệu đều được chiết lượng dung môi như sau: lần chiết đầu 230 ml aceton (tưong đương 330 ml hỗn họp aceton ; nước = 7:3), sau đó chiết 2 lần với 200 ml, và 150 ml hỗn họp aceton : nước = 9:1.
3.1.6.3. Khảo sát ảnh hưởng của loại acid dùng thủy phân
Tiến hành khảo sát với 4 loại acid sẵn có là HCl, H2SO4, H3PO4 và acid
citric. Các mẫu nguyên liệu đều được thủy phân với 100 ml dung dịch acid có nồng độ IM trong 60 phút. Quá trình chiết và kết tinh đều được tiến hành trong những điều kiện giống nhau. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3:
STT Loại acid Khối lượng sản
phẩm (g)
Hàm lượng G-AA (%)
Khối lượng G-AA thực (g)
1 H3PO4 0,2910 ±0,02 85,82 0,2497
2 H2SO4 0,3015 ±0,01 74,54 0,2247
3 HCl 0,1992 ±0,02 82,66 0,1647
4 Acid citric 0,2645 ±0,01 89,15 0,2358
Bảng 3.3- Khảo sát ảnh hưởng của loại acid dùng thủy phân
Kết quả cho thấy, thủy phân bằng H2SO4 cho khối lượng sản phẩm cao
nhất nhưng hàm lượng G-AA trong sản phẩm thấp nhất, vì vậy khối lượng G- AA thực thu được không cao. Nguyên nhân có thể do trong quá trình thủy
phân kéo dài ở nhiệt độ cao (60°C), H2SO4 đã làm phân hủy một phần
gossypol. Hơn nữa, H2SO4 là acid rất mạnh, nếu sử dụng trong sản xuất ở qui
mô lớn sẽ không an toàn. Mặt khác, khi thủy phân bằng HCl và H2SO4, do là
khó khăn cho quá trình lọc thu dịch chiết. Điều này cũng có thể làm giảm số lượng cũng như chất lượng sản phẩm. Cụ thể là, bã nguyên liệu vụn bít kín màng lọc, dẫn đến thời gian lọc tăng đáng kể, tức là tăng thời gian dịch chiết bị tiếp xúc với oxy không khí, làm tăng khả năng gossypol bị oxy hóa. Vì vậy,
k h ô n g c h ọ n HCl và H 2S O 4 c h o b ư ớ c th ủ y p h â n n g u y ê n liệ u .
Thủy phân bằng acid citric và H3PO4 thì khối lượng G-AA thực thu
được nhiều hon khi dùng 2 acid còn lại. Trong đó, dùng H3PO4 để thủy phân
cho kết quả cao nhất. Hofĩi nữa, với mục đích có thể tận dụng được những phụ
phẩm trong quá trình chiết xuất, H3PO4 được lựa chọn. Vì bã nguyên liệu sau
khi thủy phân bằng H3PO4 có thể ché biến thêm thành phân bón cho cây trồng.
Vậy lựa chọn H3PO4 cho bước thủy phân.
3.1.6.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch H3PO4 dùng thủy phân
Trong nghiên cứu của Michael Dowd và cộng sự trên nguyên liệu là soapstock đã trình bày ở chương I, nồng độ acid và thời gian thủy phân đã
được khảo sát. Theo đó, thủy phân bằng H3PO4 nồng độ 0,6 M thì khối lượng
G-AA thực thu được ít hơn hẳn so với các nồng độ khác. Thời gian thủy phân có ý nghĩa quan trọng khi dùng acid ở nồng độ 1 M, nhưng lại ít ảnh hưởng hơn khi dùng các nồng độ acid cao 1,4 M và 1,8 M. Nghiên cứu trên cũng cho thấy khối lượng sản phẩm thu được cao nhất khi thủy phân bằng acid 1,8 M
trong 1 giờ, và khi tăng thời gian thủy phân cũng cho kết quả với sự khác biệt
không đáng kể. Tương tự, khi thủy phân bằng acid 1,4 M, khi thời gian thủy
phân lớn hơn hoặc bằng 2 giờ thì kết quả thu được khác nhau không đáng kể
[27].
Vì vậy, để khảo sát nồng độ acid phosphoric dùng thủy phân, tôi tiến
IM/ 2 giờ; 1,4 M/ 1 giờ; 1,4 M/ 2 giờ và 1,8 M/ 1 giờ. Quá trình chiết và kết tinh tiến hành trong điều kiện như nhau. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4;
STT Nồng độ acid