Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp Huperzine A của chủng vi nấm hội sinh Penicillium sp. LĐL4.4 từ cây thạch tùng răng cưa (Luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp Huperzine A của chủng vi nấm hội sinh Penicillium sp. LĐL4.4 từ cây thạch tùng răng cưa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp Huperzine A của chủng vi nấm hội sinh Penicillium sp. LĐL4.4 từ cây thạch tùng răng cưa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp Huperzine A của chủng vi nấm hội sinh Penicillium sp. LĐL4.4 từ cây thạch tùng răng cưa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp Huperzine A của chủng vi nấm hội sinh Penicillium sp. LĐL4.4 từ cây thạch tùng răng cưa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp Huperzine A của chủng vi nấm hội sinh Penicillium sp. LĐL4.4 từ cây thạch tùng răng cưa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp Huperzine A của chủng vi nấm hội sinh Penicillium sp. LĐL4.4 từ cây thạch tùng răng cưa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp Huperzine A của chủng vi nấm hội sinh Penicillium sp. LĐL4.4 từ cây thạch tùng răng cưa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp Huperzine A của chủng vi nấm hội sinh Penicillium sp. LĐL4.4 từ cây thạch tùng răng cưa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp Huperzine A của chủng vi nấm hội sinh Penicillium sp. LĐL4.4 từ cây thạch tùng răng cưa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp Huperzine A của chủng vi nấm hội sinh Penicillium sp. LĐL4.4 từ cây thạch tùng răng cưa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp Huperzine A của chủng vi nấm hội sinh Penicillium sp. LĐL4.4 từ cây thạch tùng răng cưa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp Huperzine A của chủng vi nấm hội sinh Penicillium sp. LĐL4.4 từ cây thạch tùng răng cưa (Luận văn thạc sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Họ tên tác giả luận văn: Hoàng Thị Hồng Anh TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN NGHIÊN C U NÂNG CAO KH NĂNG INH T NG H HU IN A C A CH NG VI N M NỘI INH Penicillium sp LĐL4.4 TỪ CÂY THẠCH TÙNG ĂNG CƯA LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Họ tên tác giả luận văn: Hoàng Thị Hồng Anh TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN NGHIÊN C U NÂNG CAO KH NĂNG INH T NG H HU IN A C A CH NG VI N M NỘI INH Penicillium sp LĐL4.4 TỪ CÂY THẠCH TÙNG ĂNG CƯA Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Hướng dẫn : TS Lê Thị Minh Thành Hà Nội – 2019 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Luận văn công trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Mọi giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn cảm ơn Các thơng tin, tài liệu trình bày luận văn ghi rõ nguồn gốc Nếu không nêu trên, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm đề tài Tác giả luận văn Hồng Thị Hồng Anh Lời cảm ơn Với lòng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm chân thành tới TS Lê Thị Minh Thành – Phó giám đốc Trung tâm Giống Bảo tồn Nguồn gen Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người tận tình hướng dẫn, bảo, giúp đỡ tơi suốt thời gian thực luận văn Tôi xin cảm ơn tập thể cán Trung Tâm Giống Bảo Tồn Nguồn Gen Vi Sinh Vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho suốt thời gian thực luận văn Qua đây, xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hướng dẫn truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè người bên cạnh, động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập để tơi có kết ngày hơm Hà Nội, tháng năm 2019 Hoàng Thị Hồng Anh Danh mục ký hiệu chữ viết tắt Từ viết tắt Chữ viết đầy đủ CYA Czapek yeast extract agar HPLC High-performance liquid chromatography MEA Malt Extract Agar MNNG N-methyl-N’nitro-N-nitrosoguanidine PDA Potato Dextrose Agar PDB Potato Dextrose Broth TLC Thin layer chromatography UV Ultra violet Danh mục bảng Bảng 1.1 Sử dụng tác nhân vật lý gây đột biến 24 Bảng 1.2 Cơ chế tác động tác nhân hóa học gây đột biến 24 Bảng 2.1 Các môi trường nuôi cấy 32 Bảng 2.2 Môi trường khảo sát đặc điểm hình thái 33 Bảng Thành phần môi trường dinh dưỡng nuôi cấy 37 Bảng 2.4 Thành phần dung dịch môi trường MS 39 Bảng 2.5 Nguồn C, N chất bổ sung lựa chọn 40 Bảng 2.6 Thành phần môi trường nhân giống 41 Bảng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng Penicillium sp LĐL 4.4 môi trường nuôi cấy 44 Bảng Các khuẩn lạc đột biến chọn ngẫu nhiên 49 Bảng Kết định lượng HupA chủng đột biến 51 Bảng Lượng sinh khối tươi thu hàm lượng HupA dịch chiết chủng vi nấm LĐL4.4 môi trường nuôi cấy khác 53 Bảng Ảnh hư ng nguồn cacbon đến khả sinh tổng hợp HupA chủng nấm LĐL4.4 56 Bảng Ảnh hư ng hàm lượng nguồn cacbon đến khả sinh tổng hợp HupA chủng nấm LĐL4.4 58 Bảng Ảnh hư ng nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp HupA chủng nấm LĐL4.4 58 Bảng Ảnh hư ng chất bổ sung tới sinh khối tươi hàm lượng HupA chủng vi nấm nghiên cứu 60 Bảng Ảnh hư ng hàm lượng ethanol tới sinh khối tươi hàm lượng HupA chủng vi nấm LĐL 4.4 nghiên cứu 61 Bảng 10 Khả sinh trư ng chủng nấm LĐL 4.4 số môi trường nhân giống 63 Bảng 11 Ảnh hư ng thời gian nhân giống đến khả sinh tổng hợp HupA chủng vi nấm LĐL 4.4 64 Bảng 12 Ảnh hư ng tỷ lệ giống đến khả sinh tổng hợp HupA chủng LĐL 4.4 65 Bảng Ảnh hư ng pH môi trường đến khả sinh tổng hợp HupA chủng LĐL 4.4 66 Bảng 14 Ảnh hư ng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp HupA chủng chủng LĐL 4.4 66 Bảng 15 Ảnh hư ng độ thơng khí đến khả sinh tổng hợp HupA chủng LĐL 4.4 67 Bảng 16 Động thái trình lên men sinh tổng hợp HupA chủng nấm LĐL 4.4 thiêt bị lên men lít 69 Danh mục hình ảnh Hình 1.1: Cây Thạch tùng cưa (Huperzia serrata) [6] Hình 1.2: Cấu trúc hóa học Huperzine A [2] Hình : Nấm nội sinh phát triển rễ Cối xay Phong đường [11] 10 Hình Hình thái khuẩn ty chủng LĐL 4.4 môi trường sau ngày nuôi cấy 46 Hình Đặc điểm vi hình thái chủng Penicillium LĐL 4.4 môi trường sau ngày nuôi cấy 46 Hình Sắc ký đồ (UV 310 nm) Penicillium sp LĐL4.4 hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao 47 Hình Tỷ lệ sống sót chủng LĐL 4.4 sau xử lí đột biến 48 Hình Khuẩn lạc chủng đột biến 4.4hc15.2 (A), 4.4hc20.1 (B) 4.4uv30.3 (C) môi trường PDA 50 Hình Sắc kí lớp mỏng – TLC chất thị HupA (a, b), dịch chiết nấm thể 4.4hc20.1 (d), 4.4uv (e) 4.4hc15.2 (f) silica gel Merk 0.25 mm phát thuốc nhuộm KMnO4 0,5% 50 Hình Sắc ký đồ HPLC (UV 10 nm, Ref 90 nm) chất thị Huperzine A (A) mẫu phân tích 4.4hc15.2 (B), 4.4hc20.1 (C) 4.4uv30.3 (D) 51 Hình Sinh khối lên men dịch chiết (hòa Chlorofom) chủng LĐL 4.4 môi trường MT9 54 Hình Sắc kí đồ xác định hàm lượng HupA chủng LĐL 4.4 môi trường MT 55 Hình 10 Sinh khối chủng LĐL 4.4 môi trường khoai tây (A), Czapek – Dox (B) PDA (C) 63 Hình 11 Sinh khối chủng LĐL4.4 nuôi cấy pH môi trường khác 66 Hình 3.12 Sinh khối chủng LĐL 4.4 nuôi cấy nhiệt độ khác 67 Hình 3.13 Sinh khối chủng lắc tốc độ khác 68 Hình 14 Sinh khối lên men chủng LĐL 4.4 quy mô 5L thời gian khác 70 Hình 15 Sắc ký đồ (UV 310 nm) dịch chiết chủng Penicillium sp LĐL4.4 quy mô lên men 5L hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao 70 MỤC LỤC MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA VÀ HOẠT CHẤT HUPERZINE A 1.1.1 Cây Thạch tùng cưa (Huperzia serrata) 1.1.2 Hoạt chất Huperzine A (HupA) 1.2 VI NẤM NỘI SINH TRONG THỰC VẬT 1.2.1 Quan hệ vi nấm nội sinh thực vật 10 1.2.2 Một số nghiên cứu phân lập nấm nội sinh loài thực vật khác 11 1.2 Ứng dụng vi nấm nội sinh thực vật 13 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI NẤM NỘI SINH CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA SINH TỔNG HỢP HOẠT CHẤT HUPERZINE A 14 .1 Các nghiên cứu giới 14 .2 Các nghiên cứu nước 18 1.4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA VI NẤM 19 1.4.1 Ảnh hư ng nuôi cấy đến sinh trư ng phát triển vi nấm 19 1.4.2 Các nguồn dinh dưỡng sinh trư ng vi nấm 20 1.5 TẠO GIỐNG VI SINH VẬT BẰNG ĐỘT BIẾN 22 1.5.1 Khái niệm chung 22 1.5.2 Quy trình tạo giống phương pháp gây đột biến 23 1.5 Đột biến chủng tia UV 25 1.5.4 Đột biến chủng MNNG (N-methyl-N’nitro-N-nitrosoguanidine) 25 1.6 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ [5] 25 1.6.1 Sắc ký mỏng (Thin layer chromatography – TLC) 25 1.6.2 Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography – HPLC ) 27 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 VẬT LIỆU 31 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 31 Tuy nhiên, chênh lệch hàm lượng HupA nguồn nitơ bổ sung dao động không nhiều (từ 115,5 – 11 ,5 mg l), đặc biệt nguồn nitơ (pepton + trypton) đạt 117,46 mg l (pepton + trypton + cao nấm men) đạt 11 ,51 mg l nên nguồn nitơ thích hợp cho q trình lên men sinh tổng hợp HupA cho chủng nấm LĐL4.4 pepton + trypton 3.3.1.3 ự ọ b Trong trình lên men vi nấm, tùy thuộc vào sản phẩm tạo thành q trình ni cấy, số vi nấm cần có chất bổ sung vào môi trường nhằm cảm ứng để sinh tổng hợp sản phẩm Để tìm hiểu yếu tố ảnh hư ng q trình ni cấy sinh tổng hợp HupA, số nguồn chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm lựa chọn nguồn chất thích hợp cho chủng vi nấm LĐL4.4 sản xuất HupA Tham khảo cơng trình cơng bố, thực khảo sát ảnh hư ng số chất bổ sung vào môi trường lên men tới sinh tổng hợp HupA chủng nấm LĐL4.4, mục đích chọn chất làm tăng hoạt tính HupA Các chất dùng nghiên cứu gồm ethanol, methanol, acid acetic, L-lysin dịch chiết Thạch tùng cưa (TTRC) Trong mơi trường lựa chọn cho chủng nấm có ethanol 10 ml, thay ethanol chất nghiên cứu với hàm lượng ethanol, riêng L-lysin bổ sung với hàm lượng 50 mg L dịch chiết với hàm lượng 100g l Kết nuôi cấy chủng nấm nghiên cứu mơi trường có bổ sung nguồn chất khác thể bảng Kết cho thấy, chất khảo sát có ethanol dịch chiết Thạch tùng cưa có tác dụng tăng khả tổng hợp HupA; đó, dịch chiết thạch tùng cưa cho hiệu cao lên suất sinh HupA đạt 119,92 mg/L dịch lên men Trong mơi trường có L-lysin chủng nấm sinh tổng hợp HupA với lượng khơng cao Các chất lại khơng có tác dụng tích cực đến sinh tổng hợp HupA mạnh, điều trùng hợp với số cơng trình cơng bố Theo Rimming Yan cộng (2014), đánh giá ảnh hư ng hợp chất bổ sung vào nuôi cấy chất lỏng PDA để tăng suất HupA sinh 59 khối sợi nấm chủng sản xuất Shiraia sp Slf14 So sánh kết bổ sung dịch chiết Thạch tùng cưa, l-lysine acid axetic nồng độ khác chất cảm ứng Kết bình ni cấy bổ sung dịch chiết Thạch tùng cưa l-lysine tạo nhiều sợi nấm HupA axit axetic Bổ sung lượng nhỏ dịch chiết Thạch tùng cưa làm tăng khả sinh Hup A, đạt 40 µg g sinh khối khô Đặc biệt, chủng Shiraia sp Slf14 sau bổ sung 0,2 g L vào môi trường nuôi cấy suất HupA tăng cao so với đối chứng không bổ sung L-Lysine khoảng 40% Bảng 3.8 Ảnh hư ng chất bổ sung tới sinh khối tươi hàm lượng HupA chủng vi nấm nghiên cứu Chất bổ sung Sinh khối sợi (g/L) Hàm lượng HupA (mg/L) Ethanol 300,17 117,93 Methanol 153,48 37,68 Acid acetic 102,48 8,73 L-lysin 165,23 28,05 Dịch chiết TTRC 317,24 119,92 So sánh tác dụng làm tăng khả sinh tổng hợp hoạt chất Huperzine A dịch chiết thạch tùng cưa ethanol dịch chiết Thạch tùng cưa cho hiệu cao Tuy nhiên, Thạch tùng cưa lồi q u cầu điều kiện canh tác ngặt nghèo sinh trư ng phát triển chậm (có lên đến 15 năm) Nếu sử dụng dịch chiết Thạch tùng cưa làm nguồn chất bổ sung vào môi trường lên men quy mơ cơng nghiệp giá thành đắt không đủ nguồn để cung cấp Mặt khác, hiệu tăng khả sinh tổng hợp HupA dịch chiết Thạch tùng cưa ethanol không chênh lệch nhiều (ethanol cao ~ g so với ethanol); bên cạnh đó, giá thành ethanol rẻ khâu chuẩn bị đơn giản so với dịch chiết Thạch tùng cưa Do 60 vậy, ethanol lựa chọn chất bổ sung vào mơi trường cho kích thích sinh tổng hợp HupA, cần lựa chọn hàm lượng bổ sung thích hợp Khảo sát hàm lượng ethanol bổ sung vào môi trường từ - 16 ml cho thấy hàm lượng bổ sung 10 ml cho hoạt tính HupA cao đạt 117,92 mg/l (Bảng 3.9) Kết nghiên cứu Zhao cộng (2013) bổ sung ethanol với tỉ lệ 1% vào môi trường nuôi cấy chủng sản xuất HupA Colletotrichum gloeosporioides ES026 thúc đẩy sản xuất sợ nấm tăng 18.01% so với ban đầu Hàm lượng ethanol 10 ml lựa chọn bổ sung vào môi trường lên men nghiên cứu Bảng 3.9 Ảnh hư ng hàm lượng ethanol tới sinh khối tươi hàm lượng HupA chủng vi nấm LĐL 4.4 nghiên cứu Hàm lượng Ethanol (ml) Sinh khối sợi (g/L) Hàm lượng HupA (mg/L) 266,17 97,58 297,48 113,68 10 301,20 117,92 12 293,15 110,58 14 288,0 107,87 16 270,11 98,12 Như vậy, môi trường MT9 cải tiến (thành phần bao gồm: Cao malt 15 g/L; tinh bột tan 15 g/L; sucrose 10 g/L; fructose 10 g/L; maltose 10 g/L; Peptone 10g/L; Tryptone 10 g/L; 1/8 dung dịch MS; 10 ml Ethanol) thích hợp cho sinh trưởng phát triển chủng, môi trường lựa chọn cho nghiên cứu 61 3.3.2 Kết nghiên cứu nâng cao sinh tổng hợp HupA nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp Q trình lên men sinh tổng hợp HupA không phụ thuộc vào thành phần mơi trường lên men, mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố Để xác định động thái lên men việc tìm giá trị thích hợp cho yếu tố, điều kiện lên men cần thiết, đồng thời giúp xác định thời điểm thích hợp thu hồi sản phẩm sau 3.3.2.1 ự ọ ô ườ ố Khảo sát môi trường nhân giống lên men chủng nghiên cứu nhằm nâng cao khả sinh trư ng sinh HupA chúng điều cần thiết Sinh khối sợi tiêu chí quan trọng để đánh giá khả sinh trư ng hệ sợi nấm môi trường dịch thể Sinh khối sợi tăng hàm lượng HupA thu tăng theo Từ ống nghiệm giữ giống, chủng nấm nghiên cứu cấy chuyển sang ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng, nuôi 4-5 ngày Tiếp theo cấy giống vào bình tam giác, ni máy lắc (150 vòng phút), nhiệt độ oC ngày Các môi trường dùng để nghiên cứu lựa chọn môi trường nhân giống thích hợp cho chủng sinh trư ng tốt gồm Czapek – Dox, PDB, khoai tây bổ sung dung dịch MS, 10 ml Ethanol Môi trường nhân giống hướng tới có thành phần nguyên liệu dễ kiếm, không làm đục màu môi trường, thuận tiện cho khâu chuẩn bị môi trường theo dõi giống phát triển, mà đảm bảo cho chủng sinh trư ng tốt, tích lũy sinh khối cao, đảm bảo nguồn giống đạt u cầu cho q trình lên men cơng đoạn sau Kết nuôi cấy chủng nấm LĐL 4.4 mơi trường trình bày bảng 10 hình 10 Xác định sinh khối tươi chủng cho kết dao động từ 131,2 đến 2,2 g L, chủng phát triển tốt MT Czapek - Dox cải tiến, sinh khối tươi đạt1 2,2 g L thấp h n môi trường khoai tây Do môi trường Czapek - Dox cải tiến chọn làm môi trường nhân giống, môi 62 nghiên cứu Kết xác định hàm lượng HupA sau ngày lên men thể bảng 11 Bảng 3.11 Ảnh hư ng thời gian nhân giống đến khả sinh tổng hợp HupA chủng vi nấm LĐL 4.4 Thời gian nhân giống (giờ) Sinh khối sợi (g/L) Hàm lượng HupA (mg/L) 24 86,23 12,01 36 133,18 17,38 48 298,46 116,70 60 303,14 118,05 72 285,74 122,37 Kết bảng 11 cho thấy, thời gian nhân giống thích hợp - 60 giờ, ngắn dài ảnh hư ng đến tổng hợp HupA Trước giờ, sinh khối tạo thành chưa nhiều, vi nấm vừa qua giai đoạn thích nghi với mơi trường Nếu chuyển vào bình lên men giống phải khoảng thời gian để thích nghi, bên cạnh lượng sinh khối q làm giảm hiệu suất lên men, tăng nguy tạp nhiễm Sau 60 nuôi cấy, tế bào vi nấm phát triển gần hết pha logarit chuẩn bị bắt đầu pha cân Khi chuyển vào môi trường lên men, giống khơng phát triển mạnh, tích lũy sinh khối HupA Giống giai đoạn 60 phát triển tạo sinh khối nhiều, chuyển sang môi trường lên men, giống tiếp tục phát triển mạnh, tạo điều kiện cho tổng hợp HupA tốt Lượng giống tiếp vào môi trường lên men yếu tố quan trọng cần xác định Khảo sát ảnh hư ng tỷ lệ giống tới sinh tổng hợp HupA khoảng từ - 15%, thời gian nhân giống Số liệu bảng 3.12 cho thấy, tỷ lệ giống thích hợp 5%, bổ sung giống với lượng vậy, sau trình lên men HupA tích lũy nhiều nhất, đạt 119,12 mg/l Khi bổ sung lượng 64 giống 5% vừa đảm bảo chủng nấm sinh trư ng tốt tích lũy HupA cao, vừa tiết kiệm nguyên liệu hóa chất Khi lên men quy mô lớn cần qua nhiều cấp nhân giống cần có bước khảo sát thêm, tỉ lệ giống tiếp vào mơi trường lên men cần cao Bảng 3.12 Ảnh hư ng tỷ lệ giống đến khả sinh tổng hợp HupA chủng LĐL 4.4 3.3.2.3 Ả Tỷ lệ giống bổ sung (%) Hàm lượng HupA (mg/L) 22,71 119,12 117,70 10 108,58 12 106,37 15 101,93 ưở pH ô ườ ệ đ ô y Trên s môi trường điều chỉnh pH từ 6,0 đến 7,5 trình lên men thực với lượng giống tiếp vào 5%, tuổi giống 48 Kết cho thấy, pH thích hợp cho chủng sinh HupA 7,0 hoạt tính đạt cao 119,78 mg l Kết ni cấy mơi trường có pH ban đầu khác thể bảng 3.13 hình 3.11 Chủng nấm LĐL 4.4 có khả sinh trư ng khoảng nhiệt độ 2535oC Kết nghiên cứu ảnh hư ng dải nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp HupA chủng trình bày bảng 14, hình 12 cho thấy, nhiệt độ phát triển thích hợp -30oC đồng thời nhiệt độ tối thích cho q trình tổng hợp HupA Tại nhiệt độ nuôi này, sinh khối hoạt tính HupA đạt cao Ở nhiệt độ ni cao thấp chủng phát triển yếu sinh HupA thấp 65 Bảng 3.16 Động thái trình lên men sinh tổng hợp HupA chủng nấm LĐL 4.4 thiêt bị lên men lít Thời gian lên men (giờ) pH môi trường Sinh khối sợi (g/L) Hàm lượng HupA (mg/L) 12 7,0 16,02 - 24 7,0 45,23 1,02 36 6,7 78,18 7,38 48 6,5 102,38 20,71 60 6,5 148,17 31,05 72 6,0 185,74 54,37 84 6,0 225,23 85,52 96 6,0 256,04 101,09 108 6,0 293,17 118,81 120 6,0 294,05 118,97 132 6,0 294,17 119,08 144 6,0 294,12 119,01 69 Như vậy, từ kết nghiên cứu môi trường lên mên điều kiện nuôi cấy, điều kiện để chủng vi nấm LĐL4.4 sinh trưởng sinh tổng hợp HupA tốt là: Môi trường nhân giống: Czapek - Dox; môi trường lên men: Cao malt 15 g/L; tinh bột tan 15 g/L; sucrose 10 g/L; fructose 10 g/L; maltose 10 g/L; Peptone 10g/L; Tryptone 10 g/L; 1/8 dung dịch MS; 10 ml Ethanol; Điều kiện lên men: nhiệt độ 28oC, pH ban đầu mơi trường 7,0, tốc độ lắc 150 vòng/phút, tuổi giống 48 giờ, tỉ lệ giống tiếp 5%, thời gian nuôi cấy 108 71 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng vi nấm Penicillium sp LĐL4.4 môi trường nuôi cấy khác Bằng phương pháp gây đột biến tia UV hóa chất MNNG tạo dòng đột biến: 4.4uv (đột biến UV) 4.4hc20.1, 4.4hc15.2 (đột biến MNNG) có khả sinh hoạt chất HupA từ chủng giống gốc Penicillium sp LĐL 4.4 Tuy nhiên, chủng cho hàm lượng thấp so với chủng gốc ban đầu Đã nghiên cứu nâng cao khả sinh tổng hợp HupA chủng Penicillium sp LĐL4.4 nghiên cứu thành phần môi trường điều kiện nuôi cấy chủng Khả sinh tổng hợp hoạt chất Huperzine A chủng tăng 6,09 lần lên men bình lít (118,81 mg/L) so với điều kiện ban đầu môi trường PDB đạt 1, mg L Điều kiện ni cấy thích hợp chủng vi nấm Penicillium sp LĐL 4.4 là: Môi trường nhân giống: Czapek – Dox; Môi trường lên men: 15 g/L Cao malt; 15 g L tinh bột tan; 10 g/L sucrose; 10 g/L fructose; 10 g/L maltose; 10g/ L Peptone; 10 g/L Tryptone; dung dịch MS; 10 ml Ethanol; Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 28oC, pH ban đầu môi trường 7,0, tốc độ lắc 150 vòng phút, tuổi giống giờ, tỉ lệ tiếp giống 5%, thời gian lên men 10 4.2 KIẾN NGHỊ Cần tiếp tục nghiên cứu để xây dựng quy trình lên men chủng Penicillium sp LĐL4.4 quy mô lớn nhằm tiến tới sản xuất lượng lớn hoạt chất HupA làm s nghiên cứu, sản xuất thuốc quy mô công nghiệp phục vụ cho phòng h trị điều trị bệnh rối loạn trí nhớ Việt Nam, đặc biệt bệnh Alzheimer 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO Wimo A., Winblad B and Jonsson L., 2007, An estimate of the total worldwide societal costs of dementia in 2005, Alzheimer’s Dement, 3, pp 81–91 Darvesh S., Walsh R., Kumar R., Caines A., Roberts S., Magee D., Rockwood K and Martin E, 2003, Inhibition of human cholinesterases by drugs used to treat Alzheimer disease, Alzheimer Dis Assoc Disord , 17,pp 117–126 Liu JS., Yu CM., Zhou YZ., Han YY., Wu FW., Qi BF and Zhu YL, 1986a, Study on the chemistry of huperzine-A and huperzine-B, Acta Chimi Sin, 44, pp 1035–1040 Liang YQ and Tang XC., 2004, Comparative effects of huperzine A, donepezil and rivastigmine on cortical acetylcholine level and acetylcholinesterase activity in rats Neurosci Lett, 361, pp 56–59 Ma X., Tan C., Zhu D., Gang DR and Xiao P , 2007, Huperzine A from Huperzia speciesan thnopharmacological review, J Ethnopharmacol, 113, pp 15–34 Ma X and Gang DR., 2008, In vitro production of Huperzine A, a promising drug candidate for Alzheimer’s disease, Phytochemistry, 69, pp 2022 -2028 Szypula W., Pietrosiuk A., Suchocki P., Olszowska O., Furmanowa M and Kazimieska O, 2005, Somatic embrogenesis and in vitro culture of Huperzine selago shoots as a potential source of Huperzine A Plant Sci , 168, pp 1443 – 1452 Sardul Singh Sandhu et al, 2014, Isolation and identification of endophytic fungi from Ricinus communis linn and their antibacterial activity, 73 International journal of research in pharmacy and chemistry, 4(3), pp 611-618 Trần Hợp, Phùng Mỹ Hưng, Cây thạch tùng cưa Huperzia serrata loài dược liệu quý Việt Nam, Web Sinh vật rừng Việt Nam 10.http://healthplus.vn/thach-tung-rang-cua-duoc-lieu-quy-chua-benhalzheimer- d26775.html/ 11.Zangara A., 2003, The psychopharmacology of huperzine A: an alkaloid with cognitiveenhancing and neuroprotective properties of interest in the treatment of Alzheimer ’s disease, Pharmacol Biochem Be, (75), pp 675686 12.Lê Thị Minh Thành, 2001 Sơn thục nấm nội sinh, triển vọng ứng dụng nông, Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp 13.rvn-vallet.org/wp-content/uploads/rvn2015/tom_tat_de_tai_nghien_cuungoc_my.doc/ 14 Brundrett, M C and Kendrick, B, 1988, The mycorrhizal status, root anatomy, and phenology of plants in a sugar mapple forest, Canadian “Journal of Botamy”, 66, pp 1153-1173 15 Sánchez Márquez S., Bills G.F, Zabalgogeazcoa I., 2007, The endophytic mycobiota of the grass Dactylis glomerata, Fung Divers, 27, pp 171-195 16 Arnold A.E, Mejía L.C, Kyllo D., Rojas E.I, Maynard Z., Robbins N., Herre E.A, 2003, Fungal endophytes limit pathogen damage in a tropical tree, PNAS USA, 100, pp 15649-15654 17 Gallery R.A, Dalling J.W, Arnold A.e , 2007, Diversity, host affinity and distribution of seed-infecting fungi: a case study with Cecropia, Ecol, 88, pp 582-588 74 18 Gunatilaka A.A.L., 2006, Natural products from plant-associated microorganisms: distribution, structural diversity, bioactivity, and implications of their occurrence, Journal of Natural Products, 69(3), pp 509–526 19.Yin Lu, Chuan Chen, Hong Chen, Jianfen Zhang and Weiqin Chen, 2012, Isolation and identification of endophytic fungi from Actinidia macrosperma and investigation of their bioactivities, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2012, pp 20.Mariana Recco Pimentel, Gustavo Molina, Ana Paula Dionísio, Mário Roberto Maróstica Junior and Gláucia Maria Pastore, 2010, Review article: The use of endophytes to obtain bioactive compounds and their application in biotransformation process, Biotechnology Research International 21.Shi W., Luo JP., Ting ZH., Wu J., 2005, Isolation and identification of endophytic fungi of Huperzia serrata, Herbal Drugs, 36, pp 281-283 22.Suzuki, 2002, Fungal succession at different scales, Fungal Succession (cds K.D Hyde and E.B.G Jones), Fungal Diversity, 10, pp 12 -20 23.Huang J., He CZ., 2010, Population structure and genetic diversity of Huperzia serrata (Huperziaceae) based on amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers, Biochem Syst Ecol, 38(6), pp 11371147 24 Chen XY., Qi YD., Wei JH., Zhang Z., Wang DL., Feng JD., Gan BC., 2011, Molecular identification of endophytic fungi from medicinal plant Huperzia serrata based on rDNA ITS analysis, World J Microbiol Biotechnol, 27(3), pp 495-503 25.Li W., Zhou J., Lin Z and Hu Z., 2007, Study on fermentation for production of huperzine A from endophytic fungus 2F09P03B of Huperzia serrata, Chin Med Biotechnol, 2, pp 254–259 75 26.Zhu D., Wang J., Zeng Q., Zhang Z., Yan R., 2010, A novel endophytic Huperzine A – producing fungus, Shiraia sp Slf14, isolated from Huperzia serrata, Journal of Applied Microbiology, 109, pp 1469 -1478 27.Zhao X-M, Wang Z-Q, Shu S-H, Wang W-J, Xu H-J, et al, 2013, Ethanol and Methanol Can Improve Huperzine A Production from Endophytic Colletotrichum gloeosporioides ES026, PLoS ONE 8(4) 28.Riming Yan, Zhibin Zhang, Ya Wang, Huilin Yang, Qinggui Zeng, Du Zhu, 2014, Efficient strategy for maintaining and enhancing the huperzine A production of Shiraia sp Slf14 through inducer elicitation, J Ind Microbiol Biotechnol, 41(7), pp 1175-9 29.Huang LH., Feng JQ., Zhou SL., Hong YK., 2009, Isolation and identification of endophytic fungi of Huperzia Serrata, Prog Mod Biomed, 9, pp 2641-2644 30.Fang Q.H., Zhong J.J., 2002, Effect of initial pH on production of ganoderic acid and polysaccharide by submerged fermentation of Ganoderma lucidum, Process Biochemistry, 37, pp.769-774 31.Kim, H.J Hwang, c.p Xu, J.M Sung, J.w Choi, J.w Yun, 2003, Optimization of submerged culture process for the production of mycelial biomass and exo-polysaccharides by Cordyceps militaris C738, Journal of Applied Microbiology, 94(1), pp 120-126 32.Suzuki, 2002, Fungal succession at different scales, Fungal Succession (cds K.D Hyde and E.B.G Jones), Fungal Diversity, 10, pp 12 -20 33.http://sinhhoc247.com/tao-giong-bang-phuong-phap-gay-dot-biena867.html 34.Vũ Văn Hạnh, Lê Thị Thùy Dương, Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Thu Thủy, 2012, Nâng cao độc lực diệt rệp đào chủng nấm kí sinh trùng Lecanicilium đột biến tia cực tím (UV) N-methy-N’nitro-N- 76 nitrosoguanidine (NTG) nhằm sản xuất thuốc trừ sâu sinh học , Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 50, tr 197-209 35.https://duocdienvietnam.com/phuong-phap-sac-ky-lop-mong/ 36.http://www.case.vn/vi-VN/34/96/118/details.case 37.Cs Horváth, 1979, 75 Years of Chromatography — A Historical Dialogue, L.S Ettre and A Zlatkis, eds, Elsevier, Amsterdam, The Netherlands, pp 151–158 38.Samson RA, Houbraken J, Thrane U, Frisvad JC, Andersen B, 2010, Food and Indoor Fungi, CBS laboratory manual Series CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre, Utrecht 39.Hopwood D A., Bibb M J., Chater K F, Kieser T., Bruton C J., Kieser H M., Lydiate D J., Smith C P., Ward J M., 1985, Genetic manipulation of Streptomyces, A laboratory manual, F Crowe & Sons, Norwich, England, pp 35 – 41 40.Patent số CN101914452A (2010) Huperzine A high yield strain TCM-01 77 PHỤ LỤC BÀI BÁO ĐANG C NG BỐ 78 ... nước chủng vi nấm nội sinh sinh tổng hợp HupA Thạch tùng c a phân bố Vi t Nam Nhóm đề tài thu kết khả quan, chủng vi nấm Penicillium sp LĐL4.4 phân lập từ Thạch tùng c a phân bố Đà Lạt chủng. .. chi: Aspergillus, Fusarium, Alternaria, Penicillium, Pestalotiopsis, [20] TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI NẤM NỘI SINH CÂY THẠCH TÙNG RĂNG C A SINH TỔNG HỢP HOẠT CHẤT HUPERZINE A 1.3.1 Các nghiên cứu. .. Aspergillus sp., Alternaria sp., Stemphylium sp., Ulocladium sp., Phoma sp., Curvularia sp., Cylindrocarpon sp., Cylindrocarpon sp; , chi Alternaria sp., Phoma sp., Fusarium sp phong phú - Nấm nội sinh