Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa legumain

Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa legumain

MỞ ĐẦU

Bệnh ung thư được coi là một trong những chứng bệnh nan y nguy hiểmđược phát hiện với số ca mắc bệnh ngày càng gia tăng trên thế giới Không ít giảthuyết cho rằng, ung thư là căn bệnh phát sinh do lối sống, lối sinh hoạt thiếukhoa học của con người Song phải chăng ung thư là căn bệnh hiện đại?

Với số lượng bệnh nhân được phát hiện là mắc bệnh ung thư và số ca tửvong do ung thư tăng đột biến trong một vài năm gầm đây, ung thư đã được xem

là căn bệnh của xã hội thời hiện đại Ts.Roaslie David – trường đại họcManchester – Anh và Ts.Michael Zimmermann – trường đại học Villanova trongnghiên cứu của mình đã khẳng định: cuộc sống xã hội thời hiện đại đã góp phầnđẩy mạnh sự hình thành của nhiều yếu tố gây ung thư

Theo dự báo của các nhà khoa học Anh, thế kỷ 21, ung thư tiếp tục là cănbệnh có tỉ lệ tử vong cao trên thế giới Khoa học vẫn chưa thể tìm ra cách điều trịdứt điểm các trường hợp khối u ác tính, và ung thư cẫn được xem là căn bệnhnan y khó chữa

Theo thống kê của Tổ chức ung thư Liên hợp quốc, tới năm 2030, số cáctrường hợp mắc ung thư trên thế giới sẽ tăng gấp nhiều lần con số hiện nay và sốcác trường hợp tử vong do ung thư sẽ nhiều gấp đôi con số đã được thống kê trênthế gới vào năm 2008 Theo ước tính này, số người bị tử vong do ung thư sẽ lêntới khoảng hơn 13,2 triệu người vào năm 2030 Hiệp hội nghiên cứu ung thưquốc tế - IARC cũng cho biết, khoảng 21,4 triệu trường hợp mắc mới ung thư sẽđược phát hiện vào năm 2030 và sẽ tập trung chủ yếu tại các nước nghèo, nơi cómức sống thấp và tỉ lệ mắc bệnh cao nhất thế giới Lý giải cho việc số ca tử vong

do ung thư sẽ tăng lên trong tương lai, các nhà khoa học cho rằng, do điều kiệnsống thay đổi, thói quen sinh hoạt, kèm theo đó là sự thay đổi khí hậu toàn cầudẫn tới sự khắc nghiệt của thời tiết, môi trường bị ô nhiễm nặng nề Nồng độ các

phân tử phóng xạ tự do trong môi trường tăng cao khiến cho nguy cơ tiếp xúcvới lượng phóng xạ gia tăng và là điều kiện thuận lợi cho sự xuất hiện của bệnhnhân ung thư.

Ung thư là một vấn nạn nghiêm trọng của con người nên việc điều trị ungthư rất quan trọng trong chương trình Phòng chống ung thư ở mọi quốc gia.Muốn nâng cao chất lượng điều trị, không chỉ hoàn chỉnh về kĩ thuật của mỗiphương pháp, thiết bị, mà còn phải có kinh nghiệm, kiến thức, chẩn đoán chínhxác, xây dựng phác đồ điều trị cho mỗi bệnh nhân một cách hợp lý nhất Cácphương pháp điều trị hiện nay như:

- Phương pháp điều trị tại chỗ: Phẫu thuật và tia xạ, có khả năng điều trịtriệt để khi bệnh còn ở giai đoạn sớm, tổn thương ung thư chỉ khu chú ở tại chỗhoặc tại vùng

- Các phương pháp điều trị toàn thân: Điều trị hóa chất, điều trị nội tiết,điều trị miễn dịch…

- Ngoài các phương pháp điều trị trên hiện nay có rất nhiều nhà nghiêncứu đã ứng dụng enzyme trong điều trị ung thư ví dụ như: Chuyển 1 gen mã hóaenzyme để chuyển hóa thuốc chuyên dụng thành chất gây chết tế bào ung thư,hoặc sử dụng kháng thể có gắn một enzyme chuyển hóa thuốc chuyên dụngthành chất gây độc tế bào Legumain là một trong nhiều enzyme đã và đang được

ứng dụng nhiều trong y học Legumain được biểu hiện cao ở một số loại khối u,

chẳng hạn như tuyến tiền liệt, đại tràng và ung thư vú Ngoài ra, nó còn đượcbiểu hiện cao trong ung thư đại tràng Do đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài

“Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa legumain” Nhằm mục đích sản xuất

legumain với lượng lớn để phục vụ cho y học

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về Enzyme

1.1.1 Định nghĩa

Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất Sựtrao đổi chất ngừng thì sự sống không tồn tại Quá trình trao đổi của một chất làtập hợp các quy luật của rất nhiều các phản ứng hóa học khác nhau Các phảnứng hóa học phức tạp này có liên quan chặt chẽ với nhau và điều chỉnh lẫn nhau.enzyme là các hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó Chúng cókhả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho cácphản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơthể sống.[1]

Chúng có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống Chính do nhữngtác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúctác sinh học (biocatalysators) nhằm để phân biệt với các chất xúc tác hóa học.[2]

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu Enzyme

Do Enzyme học được coi như cột sống của hóa sinh học nên phần lớn cácnghiên cứu hóa sinh từ trước đến nay đều liên quan nhiều đến enzyme

Sự phất triển của enzyme có thể chia thành 4 giai đoạn [2]

- Giai đoạn 1: trước thế kỷ thứ XVII

- Giai đoạn 2: từ thế kỷ XVII đến nửa đầu của thế kỷ XX

- Giai đoạn 3: từ giữa thế kỷ XIX đến 30 năm đầu của thế kỷ XX

- Giai đoạn 4: từ ngững năm 30 của thế kỷ XX đến nay

1.1.2.1 Giai đoạn 1

Trước thế kỷ XVII người ta đã biết sử dụng các quá trình enzyme trongđời sống song chỉ có tính chất kinh nghiệm thực tế và thông qua hoạt động của vi

sinh vật Đó là các quá trình lên men rượu, muối dưa, làm tương và nướcchấm… Ở thời kỳ này người ta chưa hiểu về bản chất enzyme và các quá trìnhlên men…[2]

1.1.2.2 Giai đoạn 2

Ở giai đoạn này các nhà bác học đã tiến hành tìm hiểu bản chất của cácquá trình lên men Thời kỳ này đã khái quát hiện tượng lên men như là hiệntượng phổ biến trong sự sống và enzyme là yếu tố gây nên sự chuyển hóa cácchất trong quá trình lên men

Vào những năm 1600 của thế kỷ XVII, Jan Baptista Van Helmont (HàLan, 1577 – 1644) là người đầu tiên tìm hiểu sâu bản chất của quá trình lên men.Van Helmont đã nhận thấy bản chất của sự tiêu hóa là sự chuyển hóa hóa họccủa thức ăn và giải thích cơ chế của nó với sự so sánh nó với quá trình lên men

rượu Danh từ ‘ferment’ được Van helmont dùng để chỉ tác nhân gây ra sự

chuyển biến các chất trong quá trinh lên men rượu

Vào nửa cuối thế kỷ thứ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp là Réaumurcũng đã nghiên cứu bản chất của sự tiêu hóa Ông đã nghiên cứu trên vật thínghiệm là chim quạ đen

Đầu thế kỷ XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được các chất gây ra quátrình lên men Năm 1814 Kirchoff, viện sỹ Saint Petercburg đã phát hiệnamylase trong mầm đại mạch

Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Pessoz đã chứngminh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường có thể tách được ở dạngbột Tiếp đó người ta đã tìm ra và tách được nhiều Enzyme khác như Enzymephân giải protein của dich tiêu hóa trong dạ dày như Pepsin

Sau đó, lý thuyết xúc tác đã ra đời Năm 1835, nhà khoa học Berzelius(nhà hóa học Thụy Điển) có quan điểm cho rằng tăng tốc độ phản ứng là hiệntượng xúc tác Đây là một quan điểm đúng Song tiếc cho nhà khoa học này đã

coi các chất xúc tác này hoạt động được là do “ lực sống” không theo điều khiểncủa con người Đây là quan điểm duy tâm, siêu hình đã làm trì trệ sự phát triểncủa khoa học nhất là ảnh hưởng sâu sắc đến sự phất triển của nghành Enzymehọc.[2]

*Trường phái Pasteur:

Năm 1856 Pasteur đã đề cập đến bản chất của quá trình lên men Ông chorằng không thể tách các Enzyme khỏi tế bào Tác dụng và tính chất của Enzymegắn liền với sự sống của tế bào và quá trình lên men rượu là kết quả hoạt độngsống của tế bào nấm men chứ không phải là kết quả của tác dụng Enzyme Ông

đã tiến hành thí nghiệm và nhận thấy nếu một dung dịch hữu cơ, ví dụ dung dịchglucose để trong bình đã khử trùng thì không xảy ra quá trình lên men rượu.Chính nhờ suy nghĩ ấy, Pasteur đã chia các Enzyme thành hai loại: “ Enzyme có

tổ chức” và “Enzyme không có tổ chức”

Theo ông, các “Enzyme có tổ chức” là những Enzyme không thể tách khỏi

tế bào, nếu tách chúng sẽ mất tách dụng Các “ Enzyme không có tổ chức” là cácEnzyme có trong dịch tiêu hóa (ví dụ Pepsin ở trong dạ dày, amylase ở trongtuyến nước bọt, trong mầm thóc…) Quan điểm sai lầm này của Pasteur đã thốngtrị nghành Enzyme học trong một thời gian dài

Năm 1878 Kuhne đã đề nghị dùng danh từ “ferment” để gọi các “Enzyme

có tổ chức” Còn “Enzyme” để gọi các “Enzyme không có tổ chức” Danh từEnzyme được xuất phát từ đây

* Trường phái Liebig

Chống lại quan điểm trên của Pasteur, Liebig (trước đó có cả Berzeliu)cho rằng không có hoạt động của các tế bào vi sinh vật cũng có quá trình lênmen Điều đó có nghĩa là ông coi Enzyme như một chất hóa học gây lên hiệu quảtương tự chất xúc tác, tác dụng cả ở trong và ngoài tế bào, không phụ thuộc vàohoạt động sống của vi sinh vật

Nhưng năm 1871 Liebig thất bại vì thực nghiệm không chứng minh đượcquan điểm trên của mình Các thí nghiệm được tiến hành bằng cách lấy dịchchiết từ tế bào nấm men nghiền nát, đều không có tác dụng gây men rượu Cũngvào năm 1871 Mannatxein là một bác sỹ gười Nga đã dùng cát thạch anh nghiềncác tế bào nấm men và thu được dịch chiết không chứa tế bào có khả năng biếnđổi đường thành rượu Nhưng những quan sát này đã không được ai chú ý tới.Chính vì vậy, quan điểm siêu hình của Pasteur đã hạn chế khá nhiều sự phát triểncủa nghành Enzyme học Đến năm 1897, H Buchner – một nhà khoa học ngườiĐức đã nhận được dịch chiết nấm men bằng cách phân hủy tế bào hoàn thiệnhơn Trong thí ngiệm này, các tế bào nấm men được nghiền nát hoàn toàn cùngvới bột thủy tinh, sau đó được ép bằng áp suất cao Dịch chiết thu được khôngchứa tế bào nhưng vẫn có khả năng gây ra quá trình lên men (chuyển hóa từđường glucose thành rượu) Điều đó chứng tỏ quá trình lên men không phải làkết quả của hoạt động sống của tế bào nấm men mà là kết quả của các Enzymevốn có trong các tế bào Do đó, quan điểm sai lầm về Enzyme hoàn toàn bị xóa

bỏ Cũng từ đó không có sự phân biệt về nội dung giữa thuật ngữ “ferment” và

“enzyme” Có thể nói công trình của Buchner đã đánh dấu một bước ngoặt quan

trọng trong lịch sử phát triển của Enzyme học

Từ đó có rất nhiều Enzyme trong cơ thể sống được tìm ra Vì vậy việcphân loại và gọi tên các Enzyme một cách thống nhất là rất cần thiết Năm 1883,Duyclo nhà bác học người Pháp đã đề ra nguyên tắc phân loại Enzyme theo cơ

chất (substrate) do chúng biến đổi và thêm đuôi tận cùng là “ase” vào Tuy vậy,trong thực tế còn tồn tại rất nhiều ngoại lệ về thuật ngữ, ví dụ những tên gọiEnzyme pepsin, trypsin, catalase trước đây vẫn được dùng.

Giai đoạn quan trọng nhất trong thời kì này là các công trình của nhà bác học

vĩ đại người Đức E Fisher Ông đã đặt nền móng cho những khái niệm hiện đại

về tính đặc hiệu của Enzyme, về sự tương tác không gian giữa Enzyme và cơchất Giả thuyết nổi tiếng của ông là giữa Enzyme và cơ chất kết hợp với nhau

như “ổ khóa với chìa khóa” Rồi những nghiên cứu của Bach và Palladin về các

Enzyme oxy hóa khử tạo nên cơ sở cho việc xây dựng học thuyết oxy hóa khửsinh học Trong thời gian này người ta cũng đã phát hiện ra được tính tác dụngthuận nghịch của Enzyme (Đanilepsski, 1894), các coenzyme cũng được pháthiện (Harden và Young, 1906) Họ là những người khám phá ra rằng dịch chiết

tế bào nấm men chứa hai loại chất cần thiết cho quá trình lên men là “zymase”

Các công trình của Sumner và Northrop đã mở ra một chương mới tronglịch sử phát triển của Enzyme học hiện đại Những kết quả đạt được đã khẳngđịnh một cách dứt khoát bản chất của Enzyme là protein Phải nói rằng bản chấthóa học phần lớn Enzyme là protein và định nghĩa có tính chất kinh điển vềEnzyme phải xem lại từ sau phát hiện của T.R Cech năm 1981 Cech đã phát

hiện một RNA có hoạt tính xúc tác như Enzyme và gọi là ribozyme Ribozymexúc tác cho quá trình chuyển hóa tiền chất RNA thông tin (pre – mRNA) thành

m – RNA Do đó Enzyme không nhất thiết phải là protein, đây là phát minh có ýnghĩa rất lớn Tác giả của phát minh này được giải Nobel năm 1989

Từ giữa thế kỷ XX, nhất là thời gian gần đây enzyme học phát triển rấtmạnh Nhờ ứng dụng các phương pháp mới, hiện đại như: điện di, sắc ký, quangphổ, đồng vị phóng xạ… đã cho phép nghiên cứu cấu trúc cũng như cơ chế tácdụng của nhiều Enzyme và sự điều hòa hoạt đông của Enzyme trong tế bào Năm 1969 người ta đã tổng hợp được Enzyme đầu tiên là ribonuclease(Denkewalter và Hirschmann, Gutte và Merrifielad) Đây là Enzyme gồm 124amino acid, bền với nhiệt, có thể đun nóng lên 80ºC với thời gian ngắn

Trong mấy chục năm cuối của thế kỷ XX và đấu thế kỷ XXI, người ta đãchú ý nghiên cứu việc ứng dụng Enzyme Người ta đã tận dụng các nguyên liệugiàu Enzyme để tách Enzyme, dung chế phẩm Enzyme này để chế biến cácnguyên liệu khác nhau hoặc sử dụng vào mục đích khác nhau Ở nhiều nước đãhình thành ngành công nghệ Enzyme, hàng năm đã sản xuất hàng trăm tấn chếphẩm Enzyme để phục vụ cho các nghành sản xuất khác nhau và cho y học.[2]

1.1.3 Phân loại Enzyme

Mục đích của phân loại enzyme là để nhấn mạnh một cách chính xác và tổngquát, mối quan hệ và những điều giống nhau của một loại enzyme

1.1.3.1 Các lớp enzyme

Tiểu ban về enzyme (The enzyme Commission EC) được tổ chức bởi Hộihóa sinh quốc tế (The internationl Union of Biochemistry, IUB) đã đưa ra cáchphân loại thống nhất dựa trên các loại phản ứng và cơ chế phản ứng Theo cáchphân loại này thì enzyme được chia ra làm sáu lớp lớn đánh số từ 1 đến 6 Các sốthứ tự này là cố định cho mỗi lớp

Sáu lớp enzyme theo phân loại quốc tế gồm có:

 Oxydoreductase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa - khử Trong

nhóm này có tất cả các enzyme có các tên thông thường đã biết nhưdehydrogenase, oxydase, cytochromreductase và peroxydase Trong cácphản ứng do chúng xúc tác xảy ta sự vận chuyển hydrogen, sự chuyểnelectron, sự oxy hóa bởi oxy phân tử, bởi hydrogen peroxide hoặc bởi cácchất oxy hóa khác

 Transferase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị Các transferase

do bản chất của những gốc mà chúng vận chuyển có thể tham gia vào cácquá trình trao đổi chất rất khác nhau Trong lớp transferase bên cạnhtransaminase và methyltransferase còn có các kinase khác nhau (xúc tácchủ yếu cho sự vận chuyển của gốc phosphate từ hợp chất cao năng tớichất khác, một phần lớn các enzyme trước kia gọi là mutase và một vàiloại synthetase, ví dụ các enzyme tổng hợp DNA và RNA)

 Hydrolase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân Trong lớp này

có các enzyme phân giải este (ví dụ lipid), glucozid, amid, peptid, protein

 Lyase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần nước, loại

nước tạo thành nối đôi hoặc kết hợp phân tử nước vào nối đôi Thuộc vàolớp này có các enzyme được gọi là hydratase, aldolase, decarboxylasecũng như một số desaminase

 Ligase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết

giàu năng lượng ATP v.v

 Isomerase: Các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa Tính cho

đến cùng thì chúng xúc tác cho những phản ứng chuyển các nhóm khácnhau bên trong phân tử Trong lớp này không những có những enzymechuyển hóa các đồng phân hình học và đồng phân quang học (nhưalaninracemase) mà cả các enzyme xúc tác cho các phản ứng ví dụ sựchuyển hóa aldose thành cetose (glucosophosphate isomerase, trước kiagọi là phosphohexoisomerase) hoặc biến đổi vị trí của liên kết este bêntrong phân tử (ví dụ phosphoglucomutase).[2]

1.1.3.2 Các phản ứng enzyme

* Lớp enzyme oxydoreductase

Lớp enzyme này gồm 14 lớp phụ, xúc tác cho các phản ứng oxy hóa khử.Phản ứng oxy hóa tương ứng với sự tách điện tử ra khỏi cơ chất, phản ứng khử làphản ứng thu nhận điện tử và thường đi kèm với nhau

Quá trình tổng quát có thể biểu thị như sau:

Trong đó AKh là cơ chất A ở dạng khử, Aox là cơ chất A ở dạng oxy hóa,

e là điện tử, Box là cơ chất B ở dạng oxy hóa, B Kh là cơ chất B ở dạng khử Cácenzyme thuộc lớp này là những enzyme 2 thành phần có các coenzyme nhưNAD+, NADP+, FMN, FAD,

- Dehydrogenase: xúc tác cho phản ứng tách H trực tiếp từ cơ chất vàchuyển đến NAD+ NADP+, FMN, FAD

- Oxydase: Xúc tác cho quá trình chuyển điện tử đến oxy do đó hoạt hóaoxy làm cho nó có khả năng kết hợp với proton có trong môi trường

- Oxygenase: xúc tác cho phản ứng kết hợp trực tiếp oxy vào phân tử củahợp chất hữu cơ (thường là các chất có vòng thơm) Có thể phân biệt hai loại:oxygenase và hydroxylase Oxygenase xúc tác cho phản ứng kết hợp toàn bộphân tử oxy còn hydroxylase chỉ kết hợp một nửa phân tử oxy (thường ở dạngOH) vào hợp chất hữu cơ

- Peroxydase: các peroxydase điển hình và catalase có coenzyme là hem,xúc tác cho phản ứng oxy hóa các chất hữu cơ khi có H 2O2

* Lớp enzyme transferase

Lớp này gồm tám lớp phụ Các enzyme lớp này cũng là những protein phức

Akh ↔ Aox + e Box + e ↔ Bkh

AKh + Box ↔ Aox + Bkh

tạp, bản chất hóa học của các coenzyme rất khác nhau, tùy theo bản chất củanhóm được chuyển vị Đây là lớp các enzyme chuyển nhóm (không phảihydrogen) giữa hai cơ chất, từ cơ chất A sang cơ chất B.

A-R + B ↔ B-R + A

Trong đó A - R là cơ chất A có mang nhóm R, B - R là cơ chất B có mangnhóm R Các enzyme này xúc tác sự vận chuyển các nhóm monocarbon, nhómalkyl, nhóm glucosyl, các nhóm có phosphore, các nhóm chứa lưu huỳnh

- Acyltransferase: Các enzyme này xúc tác cho phản ứng chuyển nhóm acylthường là thông qua coenzyme A, tạo thành phức CoAS ~ acyl

- Glucosyltransferase: xúc tác cho phản ứng vận chuyển gốc đường (hexose,pentose) từ chất cho đến các chất nhận khác nhau, thường gặp nhất lànhóm OH của một gốc saccharide khác hoặc các gốc phosphate, nguyên tử

N của nhân dị vòng

- Aminotransferase: các enzyme này có coenzyme là pyridoxal phosphatexúc tác cho phản ứng chuyển vị nhóm amin

- Phosphotransferase: Hầu hết các phản ứng chuyển gốc phosphoryl thường

có ATP tham gia với tính chất là chất cho, gốc phosphate được chuyển từATP (hoặc có thể là NTP khác) đến nhóm hydroxyl của alcol hoặcsaccharide

* Lớp enzyme hydrolase

Lớp enzyme này bao gồm 10 lớp phụ, xúc tác cho phản ứng thủy phân,phản ứng này làm đứt liên kết đồng hóa trị giữa hai nguyên tử của phân tử cơchất gắn các phần tử của phân tử H2O vào các hóa trị được tạo nên do sự đứt liênkết kể trên Có thể được biểu thị như sau:

A - B + H2O ↔ A - H + B – OH trong đó A - B là phân tử cơ chất

Các phản ứng do enzyme lớp này xúc tác luôn có nước tham gia Đặc điểm

khác là các hydrolase thường không cần coenzyme cho hoạt động xúc tác củachúng Một số hydrolase phổ biến có vai trò quan trọng đối với quá trình tiêu hóanhư amylase, peptide hydrolase, lipase.

- Amylase xúc tác cho quá trình thủy phân tinh bột, glycogen và cácpolysaccharide tương tự Có 3 loại amylase khác nhau về tính đặc hiệu tácdụng đối với liên kết glucoside và một số tính chất khác

- Peptide hydrolase xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide tạothành peptide phân tử thấp, amino acid Các peptide hydrolase khác nhau

có tính đặc hiệu khác nhau đối với liên kết peptide Một số enzyme phângiải các liên kết peptide ở giữa chuỗi mạch polypeptide gọi là endopeptidehydroase hay proteinase, một số khác lại thủy phân các liên kết ở đầu mútcủa chuỗi mạch, gọi là exo peptide hydrolase hay peptidase

- Lipase xúc tác cho phản ứng thủy phân triglycerid tạo thành các acid béo

tự do và glycerol (thủy phân lần lượt từng liên kết este).[2]

* Lớp enzyme lyase

Lớp enzyme này gồm 5 lớp phụ, xúc tác cho việc phân giải tách ra khỏi cơchất một nhóm nào đó cùng với việc tạo thành liên kết đôi hoặc kết hợp với cácnối đôi Có thể biểu thị như sau:

UDg - glucose - j - epimerase xúc tác cho sự chuyển hóa tương hỗ phức tạpgiữa galactose và glucose, tức là làm xoay nhóm OH xung quanh nguyên tửcarbon ở vị trí thứ tư của đường galactose Enzyme có coenzyme NAD+,xúc tác cho phản ứng:

UDg – galactose UDg - glucose

D - glucose - 6 - phosphate - cetoisomerase xúc tác cho phản ứng chuyểnhóa lẫn nhau giữa D - glucose - 6 - P và fructose - 6 – P

* Lớp enzyme ligase

Lớp enzyme này xúc tác cho những phản ứng kết hợp hai phân tử với nhaunhờ năng lượng của một liên kết giàu năng lượng trong ATg hay một hợp chấttương tự và thường kèm theo sự loại bỏ các phần tử của một phân tử nước Thuộc

về lớp enzyme này có lớp phụ và chúng thường tạo nên các liên kết C - O, C - S, C

- N, C – C

Các enzyme ligase xúc tác cho việc tạo thành aminoacyl - tRNA từ aminoacid và tRNA ở giai đoạn đầu tiên trong sự sinh tổng hợp protein Ngoài ra chúngcòn xúc tác cho sự sinh tổng hợp amino acid, tạo ra những dẫn chất acyl -CoA

Gyruvatcarboxylase xúc tác cho phản ứng carboxyl hóa acid pyruvicacid tạo thành oxaloacetic acid Enzyme này có chứa nhóm phụ là biotin, cần acetyl

- CoA và Mg++ cho phản ứng xúc tác

X Y Y X

A B A B

1.1.4 Cấu trúc phân tử Enzyme [2]

1.1.4.1 Bản chất hóa học của enzyme

Enzyme có tất cả các thuộc tính hóa học của các chất protein về hình dạngphân tử: đa số enzyme có dạng hình cầu (dạng hạt) Tỷ lệ giữa trục dài và trụcngắn của phân tử vào khoảng 1 - 2 hoặc 4 - 6

Về khối lượng phân tử: các enzyme có khối lượng phân tử lớn, thay đổi rấtrộng từ 12000 dalton đến 1.000.000 dalton hoặc lớn hơn

Do kích thước phân tử lớn, các enzyme không đi qua được màng bánthấm Enzyme tan trong nước, khi tan tạo thành dung dịch keo; chúng cũng tantrong dung dịch muối loãng, glycerin và các dung môi hữu cơ có cực khác.Enzyme không bền và dễ dàng bị biến tính dưới tác dụng của nhiệt độ cao.Enzyme bị biến tính thì mất khả năng xúc tác Mức độ giảm hoạt tính củaenzyme tương ứng với mức độ biến tính của protein trong chế phẩm Kiềm, acidmạnh, kim loại nặng cũng làm cho enzyme biến tính Cũng như protein, enzymecũng có tính chất lưỡng tính

1.1.4.2 Thành phần cấu tạo của enzyme

Cũng như protein, enzyme có thể là protein đơn giản hoặc protein phứctạp Trên cơ sở đó, người ta thường phân enzyme thành hai nhóm: enzyme mộtthành phần (enzyme một cấu tử) và enzyme hai thành phần (enzyme hai cấu tử).Trường hợp enzyme là một protein đơn giản gọi là enzyme một thành phần.Trường hợp enzyme là một protein phức tạp nghĩa là ngoài protein đơn giản còn

có một nhóm ngoại nào đó không phải protein gọi là enzyme hai thành phần

Phần protein của enzyme hai thành phần được gọi là apoprotein hayapoenzyme, còn phần không phải protein gọi là nhóm ngoại hoặc coenzyme.Phần không phải protein thường là những chất hữu cơ đặc hiệu có thể gắn chặtvào phần protein hoặc có thể chỉ liên kết lỏng lẻo và có thể tách khỏi phầnprotein khi cho thẩm tích qua màng Coenzyme là phần không phải protein của

enzyme trong trường hợp khi nó dễ tách khỏi phần apoenzyme khi cho thẩm tíchqua màng bán thấm và có thể tồn tại độc lập Phần không phải protein củaenzyme được gọi là nhóm ngoại hay nhóm prosthetic, khi nó liên kết chặt chẽvới phần protein của enzyme bằng liên kết đồng hóa trị Một phức hợp hoànchỉnh gồm cả apoenzyme và coenzyme được gọi là holoenzyme Một coenzymekhi kết hợp với các apoenzyme tạo thành các holoenzyme khác nhau xúc tác choquá trình chuyển hóa các chất khác nhau nhưng giống nhau về kiểu phản ứng.Coenzyme trực tiếp tham gia phản ứng xúc tác, giữ vai trò quyết định kiểu phảnứng mà enzyme xúc tác và làm tăng độ bền của apoenzyme đối với các yếu tốgây biến tính Còn apoenzyme có tác dụng nâng cao hoạt tính xúc tác củacoenzyme và quyết định tính đặc hiệu của enzyme Các coenzyme thường là cácdẫn xuất của các vitamin hòa tan trong nước Cần chú ý là sự phân biệtcoenzyme và nhóm ngoại chỉ là tương đối, vì khó có thể có một tiêu chuẩn thậtrành mạch để phân biệt “liên kết chặt chẽ” và “liên kết không chặt chẽ”, nhất làtrong những năm gần đây, người ta đã chứng minh rằng, nhiều coenzyme cũngkết hợp vào apoenzyme của chúng bằng liên kết đồng hóa trị Do đó, ngày nayngười ta ít chú ý đến sự phân biệt coenzyme và nhóm ngoại Ngoài ra, trongthành phần cấu tạo, rất nhiều enzyme có chứa kim loại Thuộc loại enzyme haithành phần gồm có hầu hết các enzyme của các lớp 1, 2, 4, 5, 6 Các enzymethủy phân (lớp 3) thường là enzyme một thành phần có chứa ion kim loại hoặcđòi hỏi ion kim loại làm cofactor (đồng yếu tố).

1.1.4.3 Cấu trúc bậc 4 của enzyme

Trong nhiều trường hợp, các chuỗi polypeptide có cấu trúc bậc ba có thểkết hợp với nhau tạo thành phân tử enzyme có cấu trúc bậc bốn Như vậy cấutrúc bậc bốn là cách sắp xếp đặc trưng trong không gian của các chuỗipolypeptide riêng biệt trong phân tử enzyme Đến nay người ta đã xác định rằng

số lớn các enzyme trong tế bào đều có cấu trúc bậc bốn Các enzyme có cấu trúc

bậc bốn là enzyme olygomer và polymer do nhiều đơn vị nhỏ cấu tạo nên, mỗiđơn vị nhỏ là do một chuỗi polypeptide Các đơn vị nhỏ trong một phân tửenzyme có thể giống nhau, nhưng cũng có thể khác nhau về cấu tạo và chứcnăng, hoặc cũng có thể một số giống nhau, một số khác nhau Những enzyme donhiều đơn vị nhỏ cấu tạo nên còn được gọi là các enzyme polymer và các đơn vịnhỏ được gọi là protomer.

So với các enzyme monomer, các enzyme có cấu trúc bậc bốn có nhữngđiểm sai khác sau đây:

- Có trọng lượng phân tử tương đối lớn, vào khoảng hơn 100.000kD

- Phân tử thường chứa một vài trung tâm hoạt động, có khi có đến 3,4 trungtâm hoạt động

- Khả năng tương tác của một trung tâm hoạt động với cơ chất sẽ phụ thuộcvào trạng thái chức năng của các trung tâm hoạt động khác Trong một số trườnghợp, mỗi tiểu phần có một trung tâm hoạt động nhưng sự tương tác giữa các tiểuphần sẽ ảnh hưởng đến cấu hình không gian của trung tâm hoạt động trên mỗitiểu phần, do đó ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác của enzyme Trong một sốtrường hợp khác, các nhóm định chức của trung tâm hoạt động lại nằm trên cáctiểu phần khác nhau, do đó hoạt động của enzyme chỉ thể hiện khi có sự kết hợpđúng đắn giữa các tiểu phần Như vậy, enzyme có cấu trúc bậc bốn có tính tổchức của một hệ thống hợp tác cao

- Là điều kiện cần thiết để xuất hiện tính chất allosteric của enzyme Cần nóithêm rằng, enzyme allosteric (enzyme dị lập thể, dị không gian) là enzyme màchất trao đổi có thể làm ảnh hưởng (ức chế hoặc hoạt hóa) lên tác dụng củachúng Hình như hiện tượng dị lập thể (allosteric) bắt đầu xảy ra trước hết ở cácenzyme được xây dựng nên từ một số tiểu đơn vị vì hiệu ứng dị lập thể có ảnhhưởng đến độ bền của liên kết giữa các tiểu đơn vị này (xem thêm ở phầnenzyme dị lập thể)

- Gồm các tiểu phần dưới đơn vị: Đa số các enzyme có cấu trúc bậc bốn chứa từ

2 - 4 protomer, một số enzyme khác chứa từ 6 - 8 protomer Một số enzyme chứađến 12 protomer ví dụ như arginine

- Sự sắp xếp của các mảnh dưới đơn vị trong phân tử enzyme thường có tính chấtđối xứng cao

1.1.4.4 Trung tâm hoạt động của enzyme

Trung tâm hoạt động của enzyme là phần của phân tử enzyme trực tiếp kếthợp với cơ chất, tham gia trực tiếp trong việc tạo thành và chuyển hóa phức chấttrung gian giữa enzyme và cơ chất để tạo thành sản phẩm phản ứng Trung tâmhoạt động bao gồm nhiều nhóm chức năng khác nhau của amino acid, phân tửnước liên kết và nhiều khi có cả cofactor hữu cơ (coenzyme) và vô cơ

Ở các enzyme một thành phần, trung tâm hoạt động thường bao gồm một tổhợp các nhóm chức năng của amino acid không tham gia tạo thành trục chínhcủa sợi polypeptide

Trung tâm hoạt động của các enzyme hai thành phần thường bao gồm nhómngoại (vitamin, ion kim loại ) và các nhóm chức năng của các amino acid ởphần apoenzyme

Theo quan niệm của Fisher thì trung tâm hoạt động của enzyme đã được hìnhthành sẵn với một cấu tạo nhất định chỉ cho phép cơ chất có cấu tạo tương ứngkết hợp vào Do đó có thể ví sự tương ứng đó như “ổ khóa với chìa khóa

Thuyết này tuy cũng giải thích được một số hiện tượng nhưng không giải thíchthỏa đáng được nhiều kết quả thu được trong thực nghiệm Vì vậy, Koshland đãđưa ra một giả thuyết khác hấp dẫn và tế nhị hơn Theo thuyết này thì đặc điểmcủa vùng trung tâm hoạt động là rất mềm dẻo và linh hoạt, các nhóm chức năngcủa trung tâm hoạt động của enzyme tự do chưa ở tư thế sẵn sàng hoạt động, khitiếp xúc với cơ chất, các nhóm chức năng ở trong phần trung tâm hoạt động củaphân tử enzyme thay đổi vị trí trong không gian, tạo thành hình thể khớp vớihình thể của cơ chất Cũng vì vậy, người ta gọi mô hình này là mô hình “tiếp xúccảm ứng” hoặc “khớp cảm ứng” Giữa cơ chất và trung tâm hoạt động tạo thànhnhiều tương tác yếu, do đó có thể dễ dàng bị cắt đứt trong quá trình phản ứng đểgiải phóng enzyme và sản phẩm phản ứng Trung tâm hoạt động của các enzyme

có cấu trúc bậc 4 có thể nằm trên một phần dưới đơn vị hoặc bao gồm các nhómchức năng thuộc các phần dưới đơn vị khác nhau.[5]

1.1.5 Cơ chế tác dụng của Enzyme

Vận tốc phản ứng hóa học được xác định bởi giá trị năng lượng hoạt hóa tức là mức năng lượng các chất tham gia phản ứng phải đạt được để cắt đứtliên kết cần thiết và hình thành các liên kết mới Năng lượng hoạt hóa càng lớn thì

Hình 1.2: Mô hình Fisher (a) và mô hình Koshland (b)

vận tốc phản ứng càng chậm và ngược lại Do làm giảm năng lượng hoạt hóa phảnứng, các chất xúc tác có tác dụng thúc đẩy vận tốc phản ứng hóa học.

Như vậy, trong các phản ứng có xúc tác, chất xúc tác làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng hóa học, có nghĩa là nó chỉ tham gia vào các phảnứng trung gian mà không đóng vai trò là chất tham gia phản ứng Sau phản ứng,chất xúc tác lại phục hồi về trạng thái ban đầu để tiếp tục xúc tác

Hầu như tất cả các biến đổi hóa sinh trong tế bào và cơ thể sống đều được xúc tác bởi enzyme ở pH trung tính, nhiệt độ và áp suất bình thường trong khi

đa số các chất xúc tác hóa học khác lại chỉ xúc tác ở nhiệt độ và áp suất cao

Trong phản ứng có sự xúc tác của enzyme, nhờ sự tạo thành phức hợp trung gian enzyme - cơ chất mà cơ chất được hoạt hóa Khi cơ chất kết hợpvào enzyme, do kết quả của sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron và sựbiến dạng của các liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới làm thay đổiđộng năng cũng như thế năng, kết quả là làm cho phân tử cơ chất trở nên hoạtđộng hơn, nhờ đó tham gia phản ứng dễ dàng Năng lượng hoạt hóa khi có xúc tácenzyme không những nhỏ hơn rất nhiều so với trường hợp không có xúc tác màcũng nhỏ hơn so với cả trường hợp có chất xúc tác thông thường

Nhiều hoạt động thực nghiệm đă cho thấy quá tŕnh tạo thành phức hợpenzyme cơ chất và sự biến đổi phức hợp này thành sản phẩm, giải phóngenzyme tự do thường trải qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau:

hợp enzyme - cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp.

- Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng

- Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, c ̣ác enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do

Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES làtương tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, tương tác Van der vaals Mỗi loại liênkết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi cónước

1.1.6 Ứng dụng của Enzyme

Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triểnmạnh mẽ trên qui mô công nghiệp Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzymebán trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đă được khai thác và tinh chế cómức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng Các chế phẩmenzyme phổ biến như amylase, protease, catalase, cellulase, lipase,glucoseoxydase [2,7]

Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa học… “ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lĩnh vực thực tế không kém so với ý nghĩa của việc sử dụng năng lượng nguyên tử”

1.1.6.1 Ứng dụng trong y dược

Enzyme có một vị trí quan trọng trong y học Đặc biệt là các phương phápđịnh lượng và định tính enzyme trong hóa học lâm sàng và phòng thí nghiệm chẩn

đoán Do đó, hiện nay trong y học đă xuất hiện lănh vực mới gọi là chẩn đoánenzyme, có nhiệm vụ:

- Phân tích xác định nồng độ cơ chất như glucose, ure, cholesterol… với sự hổ trợcủa enzyme

- Xác định hoạt tính xúc tác của enzyme trong mẫu sinh vật

- Xác định nồng độ cơ chất với sự hổ trợ của thuốc thử enzyme đánh dấu

- Dùng enzyme để định lượng các chất, phục vụ công việc xét nghiệm chẩn đoánbệnh, ví dụ dùng để kiểm tra glucose nước tiểu rất nhạy

- Dùng enzyme làm thuốc ví dụ: protease làm thuốc chữa tắc nghẽn tim mạch,tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm, điều trị ung thư, làmthuốc tăng tiêu hóa protein, thành phần của các loại thuốc dùng trong da liễu và

mỹ phẩm

- Trong y học các protease cũng được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng

để nuôi cấy vi sinh vật sản xuất ra kháng sinh, chất kháng độc… Ngoài ra người

ta còn dùng enzyme protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc đểchữa bệnh.[6, 3]

trong thời gian gần đây là dùng chất mang để gắn phức enzyme xúc tác cho phảnứng nhiều bước Ví dụ tổng hợp glutathion, acid béo, alcaloid, sản xuấthormone…Cũng bằng cách tạo phức, người ta gắn vi sinh vật để sử dụng trongcông nghệ xử lý nước thải, sản xuất alcohol, amino acid…

Trong nghiên cứu cấu trúc hóa học, người ta cũng sử dụng enzyme, ví dụdùng protease để nghiên cứu cấu trúc protein, dùng endonuclease để nghiên cứucấu trúc nucleic acid … Dùng làm thuốc thử trong hóa phân tích.[3]

1.1.6.3 Ứng dụng trong công nghiệp

Việc sử dụng enzyme trong công nghiệp là đa dạng, phong phú và

đã đạt được nhiều kết quả to lớn Thử nhìn thống kê sơ bộ sau đây về các lĩnh vực đã dùng protease ta có thể thấy được sự đa dạng: công nghiệp thịt, công nghiệp chế biến cá, công nghiệp chế biến sữa, công nghiệp bánh

mì , bánh kẹo, công nghiệp bia, công nghiệp sản xuất sữa khô và bột trứng, công nghiệp hương phẩm và mỹ phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp da, công nghiệp phim ảnh, công nghiệp y học

1.1.6.4 Ứng dụng trong nông nghiệp

Có thể sử dụng các loại chế phẩm enzyme khác nhau để chuyển hóa các phế liệu, đặc biệt là các phế liệu nông nghiệp cải tạo đất phục vụ nông nghiệp

Ở Nhật hằng năm đă sản xuất hàng vạn tấn chế phẩm cellulase các loại đểdùng trong nông nghiệp Có chế phẩm chứa cả cellulase, hemicellulase,protease và amylase

Công nghệ này khá phổ biến ở nhiều quốc gia Nước ta việc dùng enzyme

vi sinh vật góp phần trong sản xuất phân hữu cơ đang được khai thác để thay thếcho phân hóa học

1.2 Giới thiệu về Enzyme Protease [1, 2, 6, 7]

1.2.1 Khái niệm

Protease còn được gọi là các proteolytic enzyme, là nhóm enzyme xúc tácquá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein,polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin Ngoài ra, nhiều proteasecũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin

Sự phân bố của Protease rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vikhuẩn, nấm và virus), đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê )

So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểmkhác biệt

Các protease thủy phân các liên kết peptid bên trong chuỗi polypeptidđược gọi là các endoprotease và được chia thành 4 loại trên cơ sở các nhóm hóahọc tham gia vào quá trình xúc tác: Serin proteinase (EC3.4.21), Cysteinproteinase (EC3.4.22), Aspartic proteinase (EC3.4.23) và Metalloproteinase(EC3.4.24)

Hình 1.3: Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử

Protein.

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4)

Trong cơ thể, các protease đảm nhiệm nhiều chức năng sinh lý như: hoạthóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phónghormon và các peptid có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển proteinqua màng… Ngoài ra, các protease có thể hoạt động như các yếu tố phát triểncủa cả tế bào ác tính và tế bào bình thường, là tăng sự phân chia tế bào, sinh tổnghợp ADN…

Peptidase (Protease) (E.C.3.4)

1.2.2 Ứng dụng của Protease

1.2.2.1 Trong công nghiệp chế biến thịt

Protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần proteintrong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn Ưuđiểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme là bảo toàn được vitamin củanguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân.

1.2.2.2 Trong chế biến thuỷ sản

Khi sản xuất nước mắm thường thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệusuất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gàinén, nguyên liệu cá Nên hiện nay quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đãđược hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme thực vật (bromelain vàpapain) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nướcmắm Tuy nhiên vẫn còn một số tồn tại cần phải hoàn thiện thêm về công nghệ

1.2.2.3 Trong công nghiệp sữa

Protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa

của chúng Protease từ một số vi sinh vật như A candidus, P roquerti, B.

mesentericus,… được dùng trong sản xuất pho mát Trong công nghiệp sản xuất

bánh mì, bánh quy protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làmnhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn

1.2.2.4 Trong sản xuất bia

Protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút

ngắn thời gian lọc Protease của A oryzae được dùng để thủy phân protein trong

hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn

1.2.2.5 Trong công nghiệp da

Protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần proteincủa da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng

1.2.2.6 Trong công nghiêp dệt

Proteinase vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo(các sợi nhân tạo được bằng các dung dịch cazein, gelatin) để sợi được bóng, đểnhuộm Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết cácsợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoáchất để tẩy trắng

1.3 Giới thiệu về Legumain [22, 23, 24]

khoa học đã nhân bản vô tính và giải trình tự legumain người và một phầncủa legumain lợn Một mức độ thấp của hoạt động được rõ ràng phát hiện trongnhau thai của con người, nhưng không ai được phát hiện trong bạch cầu máu Legumain được đưa ra bởi Kembhavi và cộng sự từ một enzyme thủyphân hiện có mặt trong rất nhiều cây thuộc họ đậu và các hạt giống khác, sau đóchúng được phân lập và được biểu hiện đặc tính enzyme từ Vigna aconitifolia( bướm đậu) Legumain đặc trưng cho sự thủy phân các liên kết asparaginyl.trình tự axit amin của legumain Ricinus communis từ (thầu dầu đậu) cho thấy nó

có tương đồng với một enzyme từ Schistosoma mansoni sán lá Vào thời điểm

đó, các enzyme sán lá chưa được biết đến cụ thể, các hoạt động thử nghiệm đãđược giới thiệu bởi Kembhavi và cộng sự

Cysteine peptidase tạo thành một trong những nhóm chính của cácenzyme phân giải protein, và có thể được chia thành khoảng 30 họ riêng biệt trên

cơ sở cấu trúc phân tử của chúng Ba họ của enzyme thủy phân protein được biếtđến được thể hiện trong động vật có vú Đông đảo nhất là họ papain trong đóbao gồm các protease B, H, L, S và các chất khác Chủ yếu là các enzym ty thể,chịu trách nhiệm về sự phân giải protein trong ty thể hệ thống cơ quan nội bào

và cũng được tiết ra tác dụng ngoại bào Trong phần bào thể của tế bào (phần tếbào ở ngoài nhân), có các thành phần của 2 họ khác của enzyme thủy phâncystein: các họ của captain (họ C2) và caspase (interleukin 1β-convertingenzyme C14) Các Peptidase trung gian đã giới hạn sự phân giải protein của chấtnền bào thể

Việc giải trình tự các động có vú rõ ràng là tương đồng với legumain từcác loài khác Legumain lợn là một glycoprotein trong khoảng 34 kDa, giảm dầnđến 31 kDa Nó là một enzyme thủy phân asparaginyl, thủy phân Z-Ala-Ala-Asn-7-(4-methyl) coumarylamide Hoạt động tối đa được thấy ở pH=5,8 dưới

các điều kiện khảo nghiệm bình thường, và enzyme này không thể biến tính đảongược ở pH bằng 7 và trên 7.

Các nhà nghiên cứu đã tinh chế legumain từ thận lợn, legumain lợn làmột glycoprotein trong khoảng 34kDa Thận lợn đã được chọn làm nguồn đểtách chiết legumain Chúng tôi đã tìm được quy trình độc đáo để tinh chếenzyme, vì legumain ổn định ở pH =3-6, và ở nồng độ muối thấp, nó có xuhướng bị hấp phụ với bất kì vật liệu rắn nào Khi một phần nhỏ ammoniumsulfate khoảng 1,2-3,2M đã được thảm tách ở pH=5.0, một lượng kết tủa đã tạothành để legumain hấp phụ Các enzyme được tách bằng cách tăng nồng độ muối

ở pH=6.0 đã cho thấy sự gia tăng lớn hoạt tính đặc trưng

1.3.2 Cấu trúc và vai trò của Legumain

cũng như cathepsins B, H, L, nhưng 10µM E64 không ảnh hưởng đáng kể tới tỉ

Hình 1.5: Cấu trúc không gian của legumain