CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu
2.3.9.Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) [25]
Kỹ thuật PCR còn được gọi là kỹ thuật nhân gen in vitro do Karl Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985. Đây được xem là một trong số các phát minh có tính đột phá lớn nhất của lĩnh vực sinh học phân tử và công nghệ sinh học hiện đại.
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR: phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng tổng hợp DNA in vitro của DNA polymeraza để nhân bản in vitro các đoạn DNA (gen) khác nhau lên hàng triệu lần so với ban đầu.
Do DNA polymeraza hoạt động theo nguyên tắc cần phức hợp khuôn – mồi, trong môi trường thích hợp có các dNTP thì sẽ kéo dài mồi thành sợi bổ sung với sợi khuôn. Vì vậy, để nhân bản được đoạn DNA đích, người ta cần phải biết được trình tự đoạn nucleotide ở hai đầu của đoạn DNA cần nhân bản để từ đó thiết kế các cặp mồi (primer) đặc hiệu.
Dựa trên trình tự khuôn DNA đã được xác định, cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho phản ứng PCR (in vitro) có trình tự như sau:
T7F: 5’-TAATACGACTCACTATAGGG -3’ T7R: 3’-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG -5’ Chúng tôi tiến hành PCR trực tiếp từ khuẩn lạc *Thành phần phản ứng PCR Bảng 2.7: Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) Buffer 10X 2.5 dNTPs (100mM) 2.5 T7F 1 T7R 1
DNA khuôn Khuẩn lạc
Taq polymerase 5U 0,2 H2O khử ion vô trùng 17,8
Tổng thể tích 25
* Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại của 3 bước cơ bản sau đây
- Bước 1: Biến tính hay tách sợi DNA kép thành sợi DNA đơn ở nhiệt độ 94°– 95° trong 30 đến 60 giây.
- Bước 2: Gắn mồi vào sợi DNA. Nhiệt độ phụ thuộc vào Tm của mồi, nhưng lưu ý nhiệt độ gắn phải thấp hơn vài độ so với Tm trong 30 đến 60 giây. Nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi T7F/T7R là 52°C.
- Bước 3: Kéo dài chuỗi mới ở 72oC trong 30 giây đến vài phút tùy thuộc kích thước đoạn gen cần nhân bản.
Phản ứng PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như: nhiệt độ, các thành phần phản ứng cũng như nồng độ DNA khuôn và mồi.