Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin 1 ở người việt nam

Tách dòng và thit k vector biu hin gen mã hóa cho th th neurokinin-1  i Vit Nam Lê Hng Thu i hc Khoa hc T nhiên Luchuyên ngành: Sinh hc thc nghim; Mã s: 60 42 30 ng dn: PGS. TS. Võ Th  o v: 2012 Abstract: Tng quan v G protein; h tachykinin  ng vt có vú; th th h tachykinin và th th neurokinin-1; ng dng ca th th neurokinin-u tr bnh; vector biu hin gen mã hóa cho th th neurokinin-1. Trình bày nguyên li nghiên cu: Tách RNA tng s; phn c; phn ng PCR (Polymerase Chain Reaction); Tinh sch DAN b n DNA vào vector; k thut bin np; sàng lc khun l    t ct s dng enzyme gii hn; ký thun di; phân tích trình t cDnA ca cDNA-t qu và tho lun: Tách dòng gen mã hóa cho th th neurokinin-1 t phi; thit k vector biu hin gen mã hóa cho th th neurokinin-1. Keywords: Sinh hc thc nghim; Gen mã hóa; i Vit Nam; Th th neurokinin-1; Cu trúc protein Content M U Th th neurokinin  1 thuc nhóm các th th xuyên màng liên kt vi G protein. Khi th th  i cu t gc hiu SP s dn truyn cn t vùng thn kinh ngoi vi v n kinh, gây ra trng thái lo âu và các triu chng ging trm cm, mt u hòa các phn ng min dch ca .  nhng nghiên cu v cu trúc và cha th th neurokinin-c ph gng tìm ra các chi vn vi th th neurokinin-1 nhm sn xut thuc gi cho các bnh nhân b chu, thuc chng trm cm, thuc chng nôn cho các bnh u v th th này  i Vit Nam còn rt ít hoc công b. Chính vì vy, vi mn cDNA hoàn chnh mã hóa cho th th này  i Vit Nam và biu hin chúng trên h thng t ng v có th ch c ngun gen và các h thng sàng lc thuc t ngu c liu Vit Nam,  tài “Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở ngườiViệt Nam” c thc hin ti Phòng thí nghim Sinh Y, Khoa Sinh hc; Phòng Genomic thuc Phòng thí nghim Tr m Công ngh Enzyme - Protein và Phòng Sinh hc Phân t thuc Trung tâm nghiên cu Khoa hc s si hc Khoa hc T i hc Quc Gia Hà Ni. Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 THỤ THỂ LIÊN KẾT VỚI G PROTEIN 1.1.1. G protein G protein lc phát hin và mô t bi Alfred và Martin khi hai ông nghiên cu tác ng ci vi t bào. Vi Nobel lý sinh  y h nh v  mt trong màng t c hot hóa nh th th liên kt vi G protein (GPCRs) phân b trên b mt màng t bào. 1.1.2. Thụ thể liên kết với G protein H th th liên kt vi G protein là nhng phân t c nh (350-500 acid amine) c phân thành các phân h khác nhau d ng v trình t acid amine, ch t vi các cu tn ra 367 th th liên kt vi G protein  c tìm thy vt chc  1.2 HỌ TACHYKININ Ở ĐỘNG VẬT CÓ VÚ Tachykinin là mt trong nhng h neuropeptide ln nhc tìm th ca tt c   ng v     c phân lp t  ng vt không ng [15, 45].                          ha                    ptide  1.3 THỤ THỂ HỌ TACHYKININ VÀ THỤ THỂ NEUROKININ-1 1.3.1. Giới thiệu chung về thụ thể họ tachykinin Th th ca h tachykinin (TACR) thuc lp A trong h th th liên kt vi G protein (Hình 1).   th rhodopsin, TACR có cu trúc gc ni vi nhau bi các vòng phía ngoài và phía trong màng sinh cht (exoloop và cytoloop). Nhng vòng  phía ngoài màng t bào ca th th liên kt vi G protein có cha chn cu t gc hiu trong khi các vùng xuyên màng có ch nh hot tính ca th th. i ta phân loi TACR da vào s sai khác trong các trình t này [45]. 1.4 ỨNG DỤNG CỦA THỤ THỂ NEUROKININ-1 TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH T nhng hiu bit v cha th th neurokinin 1 ha h ng hiu qu u tr mt s c nhiên khi nhic phm ln tp trung nghiên cu v th th tachykinin nhm tìm ra các chi vn c ng du tr bnh: làm thuc ging lo âu, trm cm, cha các bng hô h phát hin ra các chi vn vi th th  mt mt xích quan trng trong viu tr trong via chng bun nôn và s nôn ma do tác dng ca hóa tr lin nay các nghiên cu v chi vn vi th th tachykinin v c kt qu   i và gp rt nhi   c s dng th th ng ca thuc vn là mt bài tóan hay và khó cho nhiu nhà nghiên c các nghiên cu ch yu tp trung vào nhng phân t không có bn cht peptide có kh m xuyên qua màng t bào tht này ha hn s u tr bnh liên quan ti chng nghi 1.5 VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 Gen mã hóa cho th th liên kt v c dung hp vào nhiu h vector và nhiu dòng t  biu hin chúng trên c t  trên t bào nhân thc. Tuy nhiên, do th th liên kt vc bii sau dch mã bng cách gn thêm carbonhydrate hoc biu hin trên h thng t bào nhân ng không cho kt qu n. Theo các nghiên c     c biu hin trong vector pCDNA [24], pMAM- các chng t bào HEK293, COS-7, u cho kt qu kh quan. Mt nghiên cu ga Farahdiba và cng s khi nghiên cu truyn tin ca th th -n hành dung hp gen mã hóa cho th th này vi gen mã hóa cho NK1 và biu hin chúng trong hai h vector pCDNA3.1 và pEGFP-N1 t qu t cho chúng tôi la chn và thit k vector biu hin pCDNA3 và pEGFP- tài. pCDNA3 và pEGFP-N1 là vector biu hin  t ng vt vc trình bày trong ph lc. Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU Mu phi b c cung cp bi Vin Quân Y 103 (kí hiu H211 ly ngày 25/1/2011). 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu   cDNA -NK1 -NK1 Tách -NK1 -NK1 Hình 5  nghiên cu tách dòng và thit k vector biu hin cDNA mã hóa cho th th neurokinin  1  phi Vit Nam. Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 TỪ PHỔI NGƢỜI  RNA tng s t mu phc tách chit bng kit AccuPrep® Viral RNA Extraction Kit c tng hp nh phn c s dng RNA tng s và mi hexamer. Thành phu kin ca phn ng tng hc trình bày trong Bng 9. Bảng 9: Thành phu kin phn ng tng hp cDNA ca gen neurokinin-1 Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện  13.0  0   1.5 dNTPs (10 mM) 2.5  5.0 -  0 trong 10 phút AMV RTase 3.0 - Kéo dài: 37 0 trong 90 phút - 85 0 trong 5 phút Tổng 25.0 Sn phc bo qun  4 o  s dng cho các thí nghim tip theo. --1 n cDNA mã hóa cho th th NK1 s -NK1 và - c ni v to nên cDNA hoàn ch Hình 6. Hình 6:   khu-NK1 ca gen mã hóa cho neurokinin-1  khu-NK1, chúng tôi s dc tng hp t phn ng phiên  làm khuôn cho phn ng PCR vi cp mc hiu NK1 F/ NK1 R1. Thành phn u kin ca phn c trình bày trong Bng 10. Bảng 10: Thành phu kin phn ng PCR khu-NK1 ca cDNA mã hóa cho th th neurokinin-1 Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện H 2 O 10.4 - Thi gian biu tiên: 94 o C, 5 phút - Lp li 45 chu kì: +Biến tính: 94 0 C, 30 giây +Gắn mồi : 60 0 C, 30 giây +Tổng hợp: 72 0 C, 150 giây - Thi gian tng hp sau cùng:  2 20 mM) 1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 F (2 µM) 0.5 NK1 R1 (2 µM) 0.5 Pfu polymerase 0.1 cDNA 1.0 Tổng 15.0 NK1 F NK1 R NK1 R1 NK1 F1 94 bp 76 bp 94 bp Đoạn 5’–NK1 (788 bp) CCCGG G 76 bp CCCGG G Đoạn 3’- NK1 (728 bp) 72 0 C, 10 phút Sn phn di trên gel agarose. Kt qu n di cho mc xp x -NK1. Hình 7: n di sn phm PCR khu   -NK1 ca cDNA mã hóa cho th th neurokinin-1. Gii chng âm không có cDNA; Gin phm PCR khui -NK1; Ging M: thang chun SY-500. Sn phc tinh sch bng High Pure PCR Product Purificati chun b cho phn -NK1 ca cDNA. 3.1.3. --1  i v-NK1, chúng tôi s dng cDNA làm khuôn cho phn ng PCR vi cp mi NK1 F1/ NK1 R  khu-NK1 ca cDNA mã hóa cho th th neurokinin-1. Tuy nhiên, sn phm PCR gc hi DNA vi (Hình 8). Hình 8n di sn phm PCR khu-NK1 ca cDNA mã hóa cho th th neurokinin-1. Gin phm PCR khu-NK1; Ging M: thang chun SY-500. Lp li phn ng nhiu l u kin v n cDNA, nhi gn m chúng tôi vn. Vì vy, chúng tôi quynh thc hin phn c vi m tng hp li cDNA t RNA tng s. Thành phu kin ca phn c thc hing 11, ch i mi hexamer bng mc s dng làm khuôn cho phn ng PCR khui -NK1 bng cp mc hiu NK1 F1/ NK1 R. Thành phu kin ca phn ng c trình bày trong Bng 11. Bảng 11: Thành phu kin phn ng PCR khu-NK1 ca cDNA mã hóa cho th th neurokinin-1 Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện H 2 O 10.4 - Thi gian biu tiên: 94 o C, 5 phút - Lp li 45 chu kì: +Biến tính: 94 0 C, 30 giây +Gắn mồi : 60 0 C, 30 giây +Tổng hợp: 72 0 C, 150 giây - Thi gian tng hp sau cùng: 72 0 C, 10 phút (MgCl 2 20 mM) 1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 F1 (2 µM) 0.5 NK1 R (2 µM) 0.5 Pfu polymerase 0.1 cDNA 1.0 Tổng 15.0 Sn phn di trên gel agarose (Hình 9). Kt qu cho thy bên c c hit hic lp vc NK1. S dng kit High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) chúng tôi tinh sch -NK1. Hình 9n di sn phm PCR dùng khuôn cDNA tng hp t mi oligo T khui -NK1. Ging  n phm PCR khu-NK1, Ging M: thang chun SY- 100. ---1 ch, t--ng phn ng ni s dng kit Gene JET TM PCR Cloning Kit (Fermentas). Thành phn ca phn ng nc trình bày trong Bng 12. Bảng 12: Thành phn phn ng n-NK1 (ho-NK1) ca cDNA mã hóa cho th th neurokinin-1 vào vector pJET1.2 Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện -NK1 (ho 8.0 Hn hp ni   16 0  m 2x 10.0 pJET 1.2 (50 ng/µl) 1.0 T4 ligase (5 u/ µl) 1.0 Tổng 20.0 ng hn hp nc bin np vào dòng t bào kh bin E.coli i m ng thch cha  sàng lc các khun lc nhn plasmid tái t hp, chúng tôi chn 8 khun l kin chèn bng phn ng PCR vi cp mc hiu.  ki-NK1, chúng tôi s dng trc tip khun lc làm khuôn cho phn ng PCR vi cp mi NK1 F/NK1 R1. Thành phu kin phn c trình bày trong Bng 13. Bảng 13: Thành phu kin phn ng PCR sàng lc khun l-NK1 ca cDNA mã hóa cho th th neurokinin-1 Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện H 2 O 10.0 - Thi gian biu tiên: 94 o C, 5 phút - Lp li 40 chu kì: +Biến tính: 94 0 C, 30 giây +Gắn mồi : 60 0 C, 30 giây +Tổng hợp: 72 0 C, 150 giây - Thi gian tng hp sau cùng: 72 0 C, 10 phút  1.5 dNTPs (2 mM) 1.0 NK1 F (2 µM) 0.5 NK1 R1 (2 µM) 0.5 Taq DNA polymerase (1 u/µl) 0.5 Khuôn 1.0 Tổng 15.0 Sn phn di trên gel agarose (Hình 10). Kt qu cho thy 7 trong 8 khun lu cho mc phù hp v-y, chúng  NK1 ca cDNA mã hóa cho th th neurokinin-1. Chúng tôi kí hiu by khun lc này lt t -NK1--NK1-7. 788 bp [...]... cho thụ thể neurokinin- 1 từ mẫu phổi người Việt Nam 3.2 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ NEUROKININ- 1 3.2 .1 Thiết kế mồi Để biểu hiện cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin- 1 ở người, chúng tôi sử dụng hai vector biểu hiện ở tế bào động vật là pCDNA3 và pEGFP-N1 Bước đầu tiên cần chuyển đoạn cDNA đã tách dòng trong vector pJET1.2 sang hai hệ thống vector biểu hiện Khi lựa chọn enzyme cắt giới... dữ liệu (Mã số trên NCBI: M 817 97 .1) Điều này chứng tỏ rằng sự khác biệt giữa trình tự nucleotide trong gen mã hóa cho thụ thể neurokinin- 1 của người Việt Nam với trình tự nucleotide trong ngân hàng dữ liệu là do tính đa hình của gen mã hóa cho thụ thể neurokinin- 1 ở người Như vậy, từ kết quả giải trình tự cho thấy chúng tôi đã tách dòng thành công cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin- 1 từ mẫu... đoạn chèn 3’-NK1 bằng cặp mồi NK1 F1/ NK1 R Giếng 1- 8 lần lượt là các khuẩn lạc được đánh số tương ứng; ĐC: đối chứng âm không có khuôn; M: thang chuẩn SY-500 3 .1. 5 Tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin- 1 Quá trình tách dòng cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin- 1 được trình bày trong Hình 12 Hình 12 Sơ đồ tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin- 1 Đầu tiên chúng... chọn hai khuẩn lạc 11 A và 5E Các vector tái tổ hợp của hai khuẩn lạc này được kí hiệu là pCDNA3-NK1 -11 và pEGFP-N1-NK1-5 Chúng tôi tách chiết hai loại plasmid tái tổ hợp để giải trình tự 3.2.3 Giải trình tự gen mã hóa cho thụ thể neurokinin- 1 trong vector biểu hiện Để khẳng định sự có mặt của cDNA-NK1 trong các vector biểu hiện, hai vector biể u hiê ̣n pCDNA3-NK1 -11 và peGFP -N1-NK1-5 được giải trình... cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin- 1 ở người Việt Nam KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Với những kết quả thu được chúng tôi đưa ra những kết luận sau: 1 Tách dòng thành công cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin – 1 ở phổi người Việt Nam cDNA-NK1 có kích thước 13 38 bp trong đó có 5 nucleotide (ở các vị trí 18 4, 333, 370, 6 41, 996) không giống với trình tự cDNA-NK1 trong ngân hang dữ liệu,... của vector pEGFP-N1 và pCDNA3 thỏa mãn điều kiện cắt văng ra đoạn cDNA hoàn chỉnh từ vector tái tổ hợp pJET1.2-NK1 Vì vậy, chúng tôi đã thiết kế mồi NK1 F3/ NK1 R3 để chuyển cDNA-NK1 từ pNK1-3 sang vector biểu hiện Trình tự cặp mồi NK1 F3/ NK1 R3 được thiết kế dựa vào trình tự cDNA hoàn chỉnh tách dòng từ phổi người Việt Nam Trong đó ở đầu 5’ của mồi NK1 F3 được thiết kế mang trình tự nhận biết cho. .. chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin- 1 Đồng thời đoạn DNA mới được nhân bản có mang vị trí nhận biết của cặp enzyme HindIII/ BamHI ở hai đầu 5’ và 3’ Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit High Pure Product purification kit (Roche) và được kí hiệu là eNK1 (expression NK1) 3.2.2 Tách dòng vector biểu hiện mang cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin -1 Chúng tôi tách chiết và tinh sạch hai loại plasmid pCDNA3 và. .. sạch, eNK1 được đưa vào từng vector pCDNA 3 và pEGFP -N1 với thành phần được trình bày trong Bảng 22 Bảng 22: Thành phần và điều kiện của phản ứng nối cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin- 1 vào vector pCDNA3 và pEGFP-N1 Thành phần Thể tích(µl) Thành phần Thể tích (µl) Đệm 10 x 2.0 Đệm 10 x 2.0 eNK1cắt 8.5 eNK1 cắt 10 .0 Plasmid pCDNA3 cắt 8.5 Plasmid pEGFP-N1 cắt 7.0 T4 ligase 1. 0 T4 ligase 1. 0 Tổng 20.0 Tổng... (ở các vị trí 18 4, 333, 370, 6 41, 996) không giống với trình tự cDNA-NK1 trong ngân hang dữ liệu, chứng tỏ sự đa hình của gen mã cho thụ thể NK1 ở người Việt Nam 2 Thiết kế thành công vector biểu hiện pCDNA3 và pEGFP-N1 mang cDNA mã cho thụ thể NK1 phân lập từ phổi của người Việt Nam ... chọn khuẩn lạc 5’-NK1-2 và 3’-NK1-6 để tách chiết các plasmid tái tổ hợp mang đoạn chèn tương ứng 5’-NK1 và 3’-NK1 Plasmid này được kí hiệu p5’-NK1-2 và p3’NK1-6 Sử dụng p5’-NK1-2 làm khuôn cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn 5’-NK1 với mồi NK1 R1 đặc hiệu cho NK1 và mồi pJET R của vector pJET 1. 2 Thành phần và điều kiện của phản ứng được trình bày trong Bảng 15 Bảng 15 : Thành phần và điều kiện phản . c liu Vit Nam,  tài Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở ngườiViệt Nam  c. 1.5 VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 Gen mã hóa cho th th liên kt v c dung hp vào nhiu h vector và nhiu dòng