KHẢO sát điều KIỆN NUÔI cấy và SINH bào tử VI KHUẨN bacillus subtilis

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  NGUYỄN DUY KHÁNH KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực TS NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN DUY KHÁNH KHÓA: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  EXAMINE CULTURE CONDITION AND SPORULATION OF Bacillus subtilis GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Dr.NGUYEN NGOC HAI NGUYEN DUY KHANH TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Với tất lòng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, tất quý Thầy Cô truyền đạt kiến thức cho em suốt trình học trường Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Ngọc Hải hết lòng hướng dẫn dạy dỗ, động viên, quan tâm, ủng hộ em hồn thành khố luận Em xin chân thành cám ơn TS Lê Anh Phụng, BSTY Nguyễn Thị Kim Loan giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt q trình hồn thành khố luận Em xin chân thành cảm ơn Phòng vi sinh, Khoa Chăn nuôi – Thú Y cho phép tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập nghiên cứu phịng Tơi xin cảm ơn bạn lớp CNSH 28 chia xẻ vui buồn thời gian học hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ thời gian thực tập Sinh viên thực Nguyễn Duy Khánh i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT NGUYỄN DUY KHÁNH, ĐH Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 “KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis” Hội đồng hướng dẫn: TS NGUYỄN NGỌC HẢI Việt nam nước nơng nghiệp có nghành chăn ni phát triển có đóng góp lớn vào phát triển kinh tế đất nước Vì vậy, vấn đề nâng cao suất, chất lượng sản phẩm cải thiện môi trường chăn nuôi quan tâm nước ta Xuất phát từ vấn đề này, tiến hành nghiên cứu khảo sát đặc điểm vi khuẩn Bacillus subtils, tìm hiểu điều kiện ni cấy thích hợp xử lí bào tử để sản xuất chế phẩm sinh học nhằm cung cấp thông tin để chọn lựa điều kiện ni cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp, từ sản xuất chế phẩm sinh học cung cấp cho nghành chăn ni Qua q trình thực đề tài chúng tơi có ghi nhận sau: Khảo sát ảnh hưởng chế độ nuôi cấy tĩnh ni cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ) chế độ nuôi cấy lắc cho số lượng vi khuẩn cao Khảo sát ảnh hưởng loại môi trường khác (TSB, TSB + 1% glucose, TSB + 1% cao nấm men, TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men) mơi trường TSB cho số lượng vi khuẩn thấp nhất, mơi trường cịn lại môi trường phù hợp cho Bacillus subtilis phát triển Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường (pH 7,5), thời gian (24,36 48 giờ) nhiệt độ ni cấy (nhiệt độ phịng, 37oC) pH 7, thời gian 48 nhiệt độ nuôi cấy 37oC cho số lượng vi khuẩn lớn Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ (50, 70), pH (6, 9) thời gian xử lí (3, giờ) đến hình thành bào tử xử lí nhiệt độ pH có ảnh hưởng đến trình hình thành bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Trang tựa Lời cảm tạ i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt iv Danh sách hình v Danh sách bảng vi Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích – Yêu cầu Phần TỔNG QUAN 2.1 Đại cương vi khuẩn Bacilus subtilis 2.1.1 Lịch sử phát triển 2.1.2 Đặc điểm phân loại 2.1.3 Đặc điểm phân bố 2.1.4 Đặc điểm hình thái 2.1.5 Đặc điểm nuôi cấy 2.1.6 Đặc điểm sinh hoá 2.1.7 Cấu trúc kháng nguyên 2.1.8 Tính chất đối kháng B subtilis với số vi sinh vật gây bệnh 2.2 Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 2.2.1 Khả sinh bào tử 2.2.2 Cấu tạo bào tử 2.2.3 Thành phần hoá học bào tử 2.2.4 Sự nảy mầm bào tử 2.2.5 Sức đề kháng bào tử 2.3 Hệ vi sinh vật đường ruột loạn khuẩn 10 2.3.1 Hệ vi sinh vật đường ruột 10 2.3.2 Vai trò hệ vi sinh vật đường ruột 11 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.3.3 Sự loạn khuẩn 12 2.4 Giới thiệu chung probiotic 13 2.4.1 Định nghĩa 13 2.4.2 Chức sinh học probiotic 13 2.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm chứa vi khuẩn Bacillus subtilis 14 PHẦN NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 16 3.2 Vật liệu thí nghiệm 16 3.2.1 Giống vi khuẩn 16 3.2.2 Môi trường nuôi cấy 16 3.2.3 Hoá chất 16 3.2.4 Thiết bị dụng cụ 16 3.3 Nội dung nghiên cứu 17 3.4 Phương pháp thực đề tài 17 3.4.1 Khảo sát đặc điểm sinh học Bacillus subtilis 17 3.4.2 Các thí nghiệm Bacillus subtilis 17 3.4.2.1 Ảnh hưởng chế độ nuôi cấy (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy lắc) thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn 17 3.4.2.2 Khảo sát môi trường thời gian ni cấy thích hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển tạo sinh khối 18 3.4.2.3 Khảo sát pH mơi trường thích hợp cho ni cấy vi khuẩn Bacilus subtilis 19 3.4.3 Các thí nghiệm bào tử Bacillus subtilis 20 3.4.3.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến tạo bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 20 3.4.3.2 Khảo sát ảnh hưởng pH đến tạo bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 21 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 Khảo sát đặc điểm sinh học Bacillus subtilis 22 4.1.1 Đặc điểm hình thái Bacillus sutilis 22 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.1.2 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc Bacillus subtilis 22 4.1.3 Quan sát dăc điểm ni cấy Bacillus subtilis mơi trường canh23 4.1.4 Tính chất sinh hoá 23 4.2 Các thí nghiệm Bacillus subtíils 25 4.2.1 Khảo sát chế độ (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy lắc) thời gian ni cấy thích hợp 25 4.2.2 Khảo sát môi trường thời gian nuôi cấy thích hợp 27 4.2.3 Khảo sát pH mơi trường ni cấy vi khuẩn thích hợp 29 4.2.4 Các thí nghiệm bào tử Bacillus subtilis 30 4.2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành bào tử Bacillus subtilis 30 4.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hình thành bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 32 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 5.1 Kết luận 34 5.2 Đề nghị 34 Phần TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 Phần PHỤ LỤC 38 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis Hình 2.2 Quá trình tạo bào tử Hình 2.3 Cấu tạo bào tử Bacillus sutilis Hình 4.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần 22 Hình 4.2 Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus subtilis môi trường TSA 23 Hình 4.3 Khuẩn lạc Bacillus subtilis mơi trường thạch tinh bột 23 Hình 4.4 Phản ứng lên men số loại đường vi khuẩn Bacillus subtilis 25 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các phản ứng sinh hoá Bacillus subtilis Bảng 2.2 Sự khác bào tử tế bào sinh dưỡng Bacillus subtilis Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm 18 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm 19 Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm 20 Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm 21 Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm 21 Bảng 4.1 Ảnh hưởng thời gian chế độ nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis 25 Bảng 4.2 Ảnh hưởng môi trường thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis 27 Bảng 43 Ảnh hưởng pH, nhiệt độ thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis 29 Bảng 4.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 30 Bảng 4.6 Ảnh hưởng pH đến hình thành bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 32 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 33 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Sau thời gian thực đề tài rút kết luận sau: Đặc điểm sinh học, sinh hoá vi khuẩn Bacillus subtilis phịng thí nghiệm vi sinh khoa Chăn nuôi Thú y cung cấp cho thấy đặc điểm hình thái ni cấy phản ứng sinh hoá phù hợp Khảo sát ảnh hưởng chế độ nuôi cấy tĩnh nuôi cấy lắc (15 phút lắc, 45 phút nghỉ) chế độ ni cấy lắc cho số lượng vi khuẩn cao Khảo sát ảnh hưởng loại môi trường khác (TSB, TSB + 1% glucose, TSB + 1% cao nấm men, TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men) mơi trường TSB cho số lượng vi khuẩn thấp nhất, mơi trường cịn lại mơi trường phù hợp cho Bacillus subtilis phát triển Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường (pH 7,5), thời gian (24,36 48 giờ) nhiệt độ nuôi cấy (nhiệt độ phịng, 37oC) pH 7, thời gian 48 nhiệt độ nuôi cấy 37oC cho số lượng vi khuẩn lớn Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ (50, 70), pH (6, 9) thời gian xử lí (3, giờ) đến hình thành bào tử xử lí nhiệt độ pH có ảnh hưởng đến q trình hình thành bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 5.2 Đề nghị Khảo sát thêm nhiều chủng vi khuẩn Bacillus subtilis để chọn chủng có khả phát triển mạnh Khảo sát thêm nhiều loại môi trường, nhiệt độ, pH thời gian ni cấy để xác định điều kiện thích hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển Khảo sát thêm nhiều điều kiện xử lý bào tử để tìm điều kiện thích hợp cho hình thành bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis ` LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Đức Duy Anh, 2005 Phân lập khảo sát số đặc điểm vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis LVTN, môn công nghệ sinh học, Trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM Tô Minh Châu, 2000 Giáo rình thực tập vi sinh vật học Nguyễn Lân Dũng, 1983 Thực tập vi sinh vật Nhà xuất đại học trung học chuyên nghiệp Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Nguyên, Phạn Văn Ty, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Phùng Tiến, 1976 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập I, II, III Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Nguyễn Văn Đông, 1993 Khảo sát số tính chất vi khuẩn Bacillus subtilis dùng sản xuất chế phẩm Biosubtyl phòng trị bệnh tiêu chảy cho heo Luận văn tốt nghiệp khó Chăn Nuôi Thú y, trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM Nguyễn Ngọc Hải, Tơ Minh Châu, 2001 Giáo trình thực tập vi sinh Tủ sách trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM Lý Kim Hữu, 2005 Khảo sát đặc điểm Bacillus subtilis tìm hiểu điều kiện ni cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm probiotic LVTN, khoa Chăn nuôi Thú y, trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM Nguyễn Đức Lượng, 2001 Công nghệ sinh học NXB ĐH Quốc gia Tp.HCM Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ chế phẩm probiotic, tìm hiểu mơi trường ni cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm LVTN, khoa Chăn nuôi Thú y , trường Đại Học Nông Lâm Tp>HCM 10 Vũ Văn Ngữ, 1978 Loạn khuẩn đường ruột tác dụng Colisubtin Nhà xuất y học Hà Nội 11 Lương Đức Phẩm 1998 Công nghệ vi sinh vật NXB Nông nghiệp Hà Nội 12 Lương Dức Phẩm, Hồ Xướng, 1978 Vi sinh tổng hợp NXB KH tổng hợp LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 35 TIẾNG NƢỚC NGOÀI 13 www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages/Ba 14 www.techno-science.net/ ?onglet=glossaire&defi 15 www.mbc.ntu.edu.tw/ faculty/teachers/LeeKT1.htm 16 www.biol.lu.se/cellorgbiol/ membprot/pop_sv.html 17 www.answers.com/ topic/bacillus-1 18 www.foodnews.ch/ / Begriffsglossar_B.html 19 www.cat.cc.md.us/ / labmanua/lab2/bscolony.html 20 micro.med.harvard.edu/ faculty/rudner.html LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 36 PHỤ LỤC Thành phần môi trƣờng 1.1 Môi trƣờng Trypticase Soya Agar (TSA) Soya peptone 15g Tryptone peptone 5g Agar 18g Nước cất 1000ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30g mơi trường TSB + 18g agar, hồ tan vào 1000ml nước cất, đun sơi cho hồ tan Đem hấp tiệt trùng 121oC 20 phút 1.2 Môi trƣờng Trypticase Soya Broth (TSB) Soya pepton 15g Tryptone pepton 5g Nacl 5g Nước cất 1000ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30g bột mơi trường TSB hồ tan vào 1000ml nước cất, đun sơi cho hồ tan.Đem hấp khử trùng 121oC 20 phút 1.3 Môi trƣờng lên men loại đƣờng Cao thịt 5g Pepton bột 10g Đường 10g Phenol red 0,01g Nước cất 1000ml pH 7,4 ± 0,2 Hấp khử trùng 121oC 10 phút 1.4 Môi trƣờng Simmons Citrate Agar Sodium citrate 2g K2PO4 1g MgSO4 0,2g Brothynol blue 0,08g NaCl 5g NH4H2PO4 1g Agar 18g pH 6,9 ± 0,2 1.5 Môi trƣờng Starch Agar (Tinh bột) Nutrien Agar 23g Tinh bột tan 10g Nước cất 1000ml pH 7,4 ± 0,2 1.6 Môi trƣờng Trypticase Soya Agar (TSB) + % glucose Soya pepton 15g Tryptone pepton 5g Glucose 10g Nacl 5g Nước cất 1000ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30g bột môi trường TSB 10g glucose hồ tan vào 1000ml nước cất, đun sơi cho hoà tan.Đem hấp khử trùng 121oC 10 phút LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 37 1.7 Môi trƣờng Trypticase Soya Broth (TSB) + 1% cao nấm men Soya pepton 15g Tryptone pepton 5g Cao nấm men 10g Nacl 5g Nước cất 1000ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30g bột môi trường TSB 10g cao nấm men hồ tan vào 1000ml nước cất, đun sơi cho hoà tan.Đem hấp khử trùng 121oC 20 phút 1.8 Môi trƣờng Trypticase Soya Broth (TSB) + 1% glucose + 1% cao nấm men Soya pepton 15g Tryptone pepton 5g Glucose 10g Cao nấm men 10g Nacl 5g Nước cất 1000ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30g bột môi trường TSB hồ tan vào 1000ml nước cất, đun sơi cho hoà tan.Đem hấp khử trùng 121oC 10 phút 1.9 Môi trƣờng MR - VP Broth Môi trƣờng 1: Buffered peptone-water powder Difco BBL 7g Glucose 5g K2HPO4 5g Nước cất 1000ml Môi trƣờng Casein Pancreatic Digesr 3.5g Peptic digest of animal tissue 3.5g Dextrose 5g Potassium phosphate 5g Nước cất 1000ml Hoà tan thành phần nước, làm nóng nhẹ nêu cần.Phân phối vào ống nghiệm hấp vô trùng 121oC 15 phút pH cuối 6,9 + 0,2 Môi trƣờng Peptone 5g Glucose 5g Phosphat buffer 5g Nước cất 1000ml Hoà tan thành phần nước Phân phối 10ml vào ống nghiệm hấp vô trùng 121oC 15 phút pH cuối 7,5 + 0,2 2.Hoá chất 2.1.Nƣớc muối sinh lý ‰ NaCl 9g Nước cất 1000ml 2.2.HCl 1% HCl đđ 10ml Nước cất 1000ml 2.3 NaOH 1% NaOH đđ Nước cất 10ml 1000ml LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 38 2.4 Dung dịch Iod 0,2N Cân 2g KI hoà tan 3ml nước, lắc cho tan, thêm nước cất vào cho đủ 100ml 3.Thuốc thử chất thị màu 3.1.Thuốc thử Catalase Dung dịch 3% H2O2 (Hydogen peroxide) 3.2.Thuốc thử Methyl Red Methyl Red 0,1g Ethanol 95% 300ml Nước cất (vừa đủ) 500ml Hòa tan đỏ methyl vào 300ml ethanol Thêm nước cất vào cho đủ 500ml 4.Thuốc nhuộm 4.1.Crystal violet a Crystal violet 0,4g Cồn 96 10ml b Phenol 1g Nước cất 100ml Trộn hai dung dịch a b lại với nhau, khuấy cho tan đem lọc Dung dịch thuốc nhuộm bảo quản chai màu để tránh ánh sáng 4.2 Lugol KI 2g Iod tinh thể 1g Nước cất 300ml Hoà 2g KI vào 5ml nước , sau thêm 1g Iod,chờ cho Iod tan hết thêm nước cất vừa đủ 300ml 4.3 Fuschine kiềm loãng a Fuschine kiềm 0,3g o Cồn 96 10ml b Phenol 5g Nước cất 35ml Trộn dung dịch a với dung dịch bạn cho hồ tan Đem bảo quản chai màu 5.Thử phản ứng sinh hoá 5.1 Kiểm tra khả lên men đƣờng Chuẩn bị Môi trường đường: glucose, maltose, saccharose, lactose Giống vi khuẩn Bacilius subtili Ống nghiệm, ống durham Tiến hành Cho vào ống nghiệm ống durham, đem hấp khử trùng 121oC 10 phút Sau cấy vi khuẩn vào môi trường môi trường, đem ủ 37oC/24 Quan sát đổi màu, sinh Nếu vi khuẩn có khả lên men đường đường bị lên men rượu, rượu hoá acid làm pH môi trường giảm làm chuyển màu môi trường Kết Phản ứng (-): mơi trường có màu hồng đỏ Phản ứng (+): mơi trường có màu vàng 5.2.Thử phản ứng Catalase Chuẩn bị Dung dịch H2O2 30% Lame LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 39 Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành Dùng pipete lấy vi khuẩn phết lên lame kính khơ Sau nhỏ giọt H2O2 30% lên vết vi khuẩn Đọc kết sau khoảng 15 giây Kết Phản ứng (-): khơng có tượng sủi bọt Phản ứng (+): Có tượng sủi bọt 5.3 Kiểm tra khả sinh Indol Chuẩn bị Môi trường TSB Thuốc thử Kovacc Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành Cấy vi khuẩn vào môi trường TSB, nuôi cấy 37oC 24 Sau nhỏ vài giọt thuốc thử Kovacc vào môi truờng đọc kết Kết Phản ứng (-): Lớp mặt có màu vàng Phản ứng (+): Lớp mặt có màu đỏ 5.4 Phản ứng VP (Voges Proskauer) Chuẩn bị Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Môi trường Clark Lubs Alpha-naphtol 10%, NaOH 40% Tiến hành Dùng que cấy vịng lấy vi khuủân vào mơi trường Clark Lubs, nuôi nhiệt độ 37 oC 24 Sau nhỏ 3-5 giọt NaOH 40% 3-5 giọt alpha-naphtol 10% Sau 15 phút đọc kết Kết Phản ứng VP (-): Mơi trường có màu vàng Phản ứng VP (+): Mơi trường có màu đỏ 5.5 Phản ứng Methyl-Red Chuẩn bị Môi trường Clark Lubs Thuốc thử Methyl-Red Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành Dùng que cấy vịng lấy vi khuẩn vào mơi trường Clark Lubs, ni 37 oC 24 Sau nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Methyl-Red vào canh khuẩn va đọc kết Kết Phản ứng (-): Mơi trường có màu vàng Phản ứng (+): Mơi trường có mau đỏ 5.6.Phản ứng khử Nitrate (NO3) Chuẩn bị Môi trường Nitrate Dung dịch thuốc thử Giess A, Giess B Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành Dùng que cấy lấy vi khuẩn vào môi trường thạch Nitrate bán lỏng, nuôi 37oC Sauu 24 giờ, nhỏ vào môi trường 2-3 giọt Giess A, sau nhỏ tiếp 2-3 giọt Giess B Kết Phản ứng (-): Mơi trường có màu vàng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 40 Phản ứng (+): Mơi trường có màu đỏ 5.7.Khả sử dụng Citrate Chuẩn bị Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Môi trường Citrate Tiến hành Cấy vi khuẩn vào môi trường citrate, nuôi 37oC 24 Kết Phản ứng (-): Mơi trường có màu xanh mạ non Phản ứng (+): Mơi trường có nàu xanh dương 6.Phƣơng pháp nhuộm Gram Cố định tiêu Đặt giấy lọc lên vết bôi Nhuộm Crystal violet – phút Rửa nước Cố định Lugol phút Rửa nước Tẩy cồn 90o 15 giây Rửa nước Nhuộm Fuschine kiềm lỗng phút Rửa nước Châm khơ, soi kính hiển vi Phƣơng pháp nhuộm bào tử Cố định tiêu Nhỏ dung dịch HCl 1% lên vếta bôi 1– phút Rửa nước Đặt giấy lọc lên vết bôi Nhỏ Fuschine đậm đặc, hơ nhẹ lửa đèn cồn 2– phút Bỏ giấy lọc, rửa nước Nhúng vào cồn 96o cho đén có màu hồng khơng phai Rửa nước Nhỏ dung dịch Xanh Methylene 1- phút Rửa nước Châm khô, đem soi kính Cơng thức tính số lượng vi khuẩn vết bơi: A=axNxHxB Trong đó: A: Tổng số vi sinh vật có ml dịch a= : Số vi sinh vật trung bình có hiển vi trường n ai: Số vi sinh vật có hiển vi trường n: Số hiển vi trường H = 1/Độ pha loãng: Hệ số pha loãng B = 1/V: Hệ số thể tích (1 ml) V: Thể tích làm vết bôi Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc Chuẩn bị đĩa môi trường TSA hấp tiệt trùng để khô mặt thạch Lấy ml dịch vi khuẩn cần đếm pha loãng nhiều nồng độ liên tiếp (theo phương pháp pha loãng thập phân) dung dịch nước muối sinh lí Cấy trang 0,1 ml dịch pha lỗng lên mơi trường TSA (mỗi nồng độ trang đĩa), ủ 37oC 24 Đem đếm số lượng vi khuẩn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 41 Đếm số lƣợng bào tử phƣơng pháp đếm khuẩn lạc: Lấy dịch nuôi cấy vi khuẩn pha lỗng xử lí tế bào sinh dưỡng cách đun 100oC giờ, sau thực bước Tính kết *Số khuẩn lạc 1g mẫu hay ml dịch mẫu độ pha lỗng Cơng thức: 1 X= A h V Trong đó: X: Số lượng vi khuẩn 1g mẫu hay ml dịch mẫu A: Số khuẩn lạc trung bình có đĩa (trong tổng số đĩa có nồng độ pha lỗng) h: Độ pha loãng tứ (10-7, 10-8, 10-9, …) V: Thể tích dịch mẫu cấy lên đĩa *Số khuẩn lạc trung bình 1g mẫu hay ml dịch mẫu độ pha lỗng liên tiếp nhau: Cơng thức: X1 X X Y= Trong đó: Y: Số khuẩn lạc trung bình độ pha lỗng X1, X2, X3: Số khuẩn lạc trung bình có 1g mẫu hay ml dịch mẫu nồng độ pha loãng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Ảnh hưởng môi trường thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Analysis of Variance for So luong - Type III Sums of Squares -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -MAIN EFFECTS A:thoi gian 0814333 0407167 11.258 0018 B:moi truong 1736500 0578833 16.005 0002 INTERACTIONS AB 0023000 3.83333E-004 106 9941 RESIDUAL 0434000 12 0036167 -TOTAL (CORRECTED) 3007833 23 Multiple range analysis for So luong by moi truong -Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -1 11.170000 X 11.320000 X 11.363333 X 11.390000 X -contrast difference limits - -0.15000 0.07567 * - -0.22000 0.07567 * - -0.19333 0.07567 * - -0.07000 0.07567 - -0.04333 0.07567 - 0.02667 0.07567 denotes a statistically significant difference Multiple range analysis for so luong by thoi gian -Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 24 11.250000 X 36 11.318750 X 48 11.390000 X LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com contrast 24 - 36 24 - 48 36 - 48 difference limits -0.06875 0.06087 * -0.14000 0.06087 * -0.07125 0.06087 * * denotes a statistically significant difference Ảnh hưởng chế độ thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Analysis of Variance for so luong - Type III Sums of Squares Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level MAIN EFFECTS A: che B: thoi gian INTERACTIONS AB RESIDUAL 6.5121333 2.8972667 6.5121333 1.4486333 89.617 19.935 0001 0022 0480667 0240333 331 7307 4360000 0726667 TOTAL (CORRECTED) 9.8934667 11 Multiple range analysis for so luong by che nuoi cay Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean 6 9.386667 10.860000 Homogeneous Groups X X contrast difference limits - 1.47333 0.38094 * * denotes a statistically significant difference LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Ảnh hưởng pH, thời gian nhiệt độ nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn Analysis of Variance for so luong - Type III Sums of Squares Source of variation level MAIN EFFECTS A:Thgian B:pH C:Nhdo INTERACTIONS AB AC BC ABC RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig .0417000 4160667 5890667 1 0208500 4160667 5890667 750 14.975 21.202 4931 0022 0006 2186333 4426333 1802667 3606333 2 1093167 2213167 1802667 1803167 3.935 7.966 6.488 6.490 0485 0063 0256 0123 3334000 12 0277833 2.5824000 23 Multiple range analysis for so luong by pH Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean 7.5 12 12 10.913333 11.176667 Homogeneous Groups X X contrast - 7.5 difference 0.26333 limits 0.14830 * * denotes a statistically significant difference Multiple range analysis for so luong by nhdo Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean 32 37 contrast 32 - 37 12 12 10.888333 11.201667 Homogeneous Groups X X difference -0.31333 limits 0.14830 * * denotes a statistically significant difference LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả hình thành bào tử vi khuẩn Analysis of Variance for so luong - Type III Sums of Squares -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -MAIN EFFECTS A:thgian 4.8966667 1.6322222 333.107 0000 B:nhietdo 1.7563000 8781500 179.214 0000 INTERACTIONS AB 21.991433 3.6652389 748.008 0000 RESIDUAL 0588000 12 0049000 - -TOTAL (CORRECTED) 28.703200 23 -Multiple range analysis for so luong by thgian xu li -Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -0 6.1333333 X 6.2266667 X 6.9233333 X 7.1966667 X -contrast difference limits - -0.09333 0.08808 * - -0.79000 0.08808 * - -1.06333 0.08808 * - -0.69667 0.08808 * - -0.97000 0.08808 * - -0.27333 0.08808 * denotes a statistically significant difference Table of Least Squares Means for XLNHDO1.sltb 95% Confidence Level Count Average Stnd Error for mean GRAND MEAN 24 6.6200000 0142887 6.5888596 6.6511404 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com A:thgian 6.1333333 0285774 6.0710525 6.1956142 6.2266667 0285774 6.1643858 6.2889475 6.9233333 0285774 6.8610525 6.9856142 7.1966667 0285774 7.1343858 7.2589475 B:nhietdo 37 6.2375000 0247487 6.1835632 6.2914368 50 6.8175000 0247487 6.7635632 6.8714368 70 6.8050000 0247487 6.7510632 6.8589368 AB 37 5.6500000 0494975 5.5421264 5.7578736 50 5.9000000 0494975 5.7921264 6.0078736 70 6.8500000 0494975 6.7421264 6.9578736 37 7.1200000 0494975 7.0121264 7.2278736 - Ảnh hưởng pH đến khả hình thành bào tử vi khuẩn Analysis of Variance for so luong tbao - Type III Sums of Squares Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level MAIN EFFECTS A:thgian 19.861200 6.6204000 185.272 0000 B:pH 1.601200 8006000 22.405 0001 INTERACTIONS AB 1.6900000 2816667 7.882 0013 RESIDUAL 4288000 12 0357333 TOTAL (CORRECTED) 23.581200 23 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error Multiple range analysis for so luong by pH -Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups 6.1350000 X LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 6.6700000 X 6.6950000 X -contrast difference limits - 0.53500 0.20599 * - -0.02500 0.20599 - -0.56000 0.20599 * -* denotes a statistically significant difference Multiple range analysis for so luuong by thgian -Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -0 5.4900000 X 5.9733333 X 6.6233333 X 7.9133333 X -contrast difference limits - -0.48333 0.23785 * - -1.13333 0.23785 * - -2.42333 0.23785 * - -0.65000 0.23785 * - -1.94000 0.23785 * - -1.29000 0.23785 * -* denotes a statistically significant difference LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... ni cấy để xác định điều kiện thích hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển Khảo sát thêm nhiều điều kiện xử lý bào tử để tìm điều kiện thích hợp cho hình thành bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis. .. nghiệm bào tử Bacillus subtilis 30 4.2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành bào tử Bacillus subtilis 30 4.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hình thành bào tử vi khuẩn Bacillus. .. 4.2.1 Khảo sát chế độ (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy lắc) thời gian nuôi cấy thích hợp 25 4.2.2 Khảo sát môi trường thời gian ni cấy thích hợp 27 4.2.3 Khảo sát pH môi trường nuôi cấy vi khuẩn