Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn bacillus subtilis để khử protein vỏ tôm

TRƯỜNG ………………… KHOA……………………… -[\ [\ - Báo cáo tốt nghiệp Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus subtilis để khử protein vỏ tôm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO CỘNG HÒA Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ðộc lập – Tự – Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Phạm Thị Trang Khóa: 49 Số hiệu sinh viên : 20043179 Viện : Công nghệ sinh học thực phẩm Ngành : Công nghệ sản phẩm lên men ðề tài tốt nghiệp: “Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus subtilis ñể khử protein vỏ tôm” Giáo viên hướng dẫn : TS Lê Thanh Hà Ngày giao luận văn : Ngày hoàn thành luận văn : Hà Nội, ngày tháng năm 2009 Trưởng môn Giảng viên hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thanh Hằng TS Lê Thanh Hà LỜI CẢM ƠN ============================================================== LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= Em xin chân trọng cảm ơn Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Trường ðại học Bách Khoa Hà Nội ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho em thực hoàn thành luận văn tốt nghiệp Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Lê Thanh Hà ñã tận tâm, chu ñáo hướng dẫn có dẫn quan trọng, quý giá giúp em hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình thầy cơ, anh chị cán Phịng, Bộ mơn Viện Cơng nghệ sinh học Cơng nghệ thực phẩm nhiệt tình quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em trình nghiên cứu thực luận văn tốt nghiệp Cuối em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến người thân gia đình tồn thể bạn bè động viên giúp đỡ em vượt khó khăn hồn thành luận văn tốt nghiệp Hà Nội, ngày … tháng … năm … SV thực Phạm Thị Trang ============================================================== LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= Mục Lục MỞ ðẦU I TỔNG QUAN I.1 HIỆN TRẠNG KHAI THÁC VÀ CHẾ BIẾN THỦY SẢN I.1.1 Thành phần phế phẩm tôm I.1.2 Phế thải công nghiệp chế biến I.1.3 Cấu tạo thành phần hoá học phế liệu tôm 10 I.1.3.1 Cấu tạo hóa học phế liệu vỏ tơm 10 I.1.3.2 Thành phần hóa học vỏ tôm 11 I.2 MỘT SỐ TÍNH CHẤT VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHITIN VÀ CHITOSAN 13 I.2.1 Tổng quan chitin 13 I.2.1.1 Sự tồn chitin tự nhiên 13 I.2.1.2 Cấu tạo chitin 13 I.2.1.3 Tính chất chitin 14 I.2.2 Tổng quan chitosan 15 I.2.2.1 Cấu trúc phân tử chitosan 15 I.2.2.2 Tính chất chitosan 15 I.2.3 Ứng dụng chitin chitosan 16 I.2.3.1 Trong công nghệ thực phẩm 16 I.2.3.2 Trong y dược 18 I.2.3.3 Trong xử lý môi trường 20 I.2.3.4 Trong nông nghiệp 20 I.2.3.5 Trong công nghệ mỹ phẩm 21 I.2.4 Phương pháp thu nhận chitin 21 I.2.4.1 Phương pháp hóa học 21 I.2.4.2 Phương pháp học 23 I.2.4.4 Phương pháp sinh học 23 I.3 Bacillus subtilis 25 I.3.1 Giới thiệu vi khuẩn Bacillus subtilis 25 I.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng ñến sinh trưởng Bacillus subtilis 25 I.3.2.1 Môi trường dinh dưỡng 25 I.3.2.2 Nhiệt ñộ 27 I.3.2.3 pH 27 I.3.2.4 Nguồn O2 27 I.3.3 Tình hình nghiên cứu trình khử protein phế liệu tôm Bacillus subtilis Việt Nam giới 27 II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 II.1 VẬT LIỆU 29 II.1.1 Vi sinh vật 29 II.1.2 Vỏ tôm 29 ============================================================== LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= II.1.3 Các loại thiết bị sử dụng 29 II.1.4 Các môi trường sử dụng nghiên cứu 30 II.1.5 Các hóa chất sử dụng 30 II.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 II.2.1 Phương pháp vi sinh 30 II.2.1.1 Phương pháp nuôi cấy lỏng 30 II.2.1.2 Phương pháp lên men vỏ tôm 30 II.2.2 Phương pháp hóa sinh 30 II.2.2.1 Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ proteaza phương pháp khuyếch tán ñĩa thạch 30 II.2.2.2 Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ proteaza phương pháp Anson cải tiến 31 II.2.2.3 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng protein phương pháp Biuret ………………………………………………………………………………32 II.2.3 Phương pháp qui hoạch thực nghiệm bề mặt ñáp ứng 34 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 III.1 Tuyển chọn chủng sinh tổng hợp protease cao 35 III.1.1 ðịnh tính phương pháp đo đường kính vịng thuỷ phân 35 III.1.2 ðịnh lượng phương pháp ño hoạt lực proteaza tạo thành theo phương pháp Anson cải tiến 36 III.2 Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp proteaza 37 III.2.1 Chọn yếu tố ảnh hưởng 37 III.2.1.1 Ảnh hưởng pH 37 III.2.1.2 Ảnh hưởng nồng ñộ CaCl2 38 III.2.1.3 Ảnh hưởng nồng ñộ ñường 39 III.2.1.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 39 III.2.2 Tối ưu hóa điều kiện ni cấy phương pháp bề mặt đáp ứng 40 III.3 Tìm điều kiện thích hợp cho q trình lên men phế liệu tơm loại protein 43 IV KẾT LUẬN 47 V PHỤ LỤC……………………………………………………………………… 47 ============================================================== LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= TĨM TẮT NỘI DUNG Chitin có nhiều vỏ tơm, đồng thời dẫn xuất chitosan lại có hoạt tính sinh học cao ứng dụng nhiều công nghiệp dược, nông nghiệp cơng nghệ thực phẩm…Qui trình thu hồi chitin từ vỏ tơm gồm hai q trình q trình loại bỏ chất khoáng loại bỏ protein Phương pháp khử protein sử dụng phương pháp hóa học dùng bazo mạnh NaOH Phương pháp có nhược điểm chất thải q trình có chứa chất ăn mịn, làm nhiễm mơi trường, dịch thủy phân có chất lượng khơng thu hồi lại Hiện nhiều nghiên cứu tập trung vào sử dụng phương pháp sinh học ứng dụng chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme proteaza thuỷ phân loại bỏ protein khỏi nguyên liệu, khắc phục nhược ñiểm phương pháp hóa học Mục đích đề tài nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính proteaza cao, tối ưu hóa điều kiện ni cấy thu dịch enzym có hoạt lực proteaza cao ứng dụng khử protein vỏ tôm Từ 11 chủng vi khuẩn chúng tơi chọn chủng Bacillus subtilis DT2 có hoạt lực proteaza cao Tiến hành qui hoạch thực nghiệm phương pháp bề mặt ñáp ứng ñã chọn ñược ñiều kiện tối ưu ñể thu dịch enzyme CaCl2 0,5g/l, nồng ñộ glucoza 0,5 g/l, pH 9,37 thời gian nuôi cấy 14h Ứng dụng dịch enzyme chủng Bacillus subtilis khử 96,14% protein vỏ tôm ============================================================== LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU VÀ SƠ ðỒ Tên bảng Trang Bảng 1.1: Thành phần hoá học phế liệu tơm ………………………………….10 Bảng 2.1: Gía trị mã hố thực nghiệm………………………………………… 31 Bảng 3.1: ðuờng kính khuẩn lạc vòng thuỷ phân 33 Bảng 3.2: ðường kính vịng thuỷ phân…………………………………………….34 Bảng 3.3: Hoạt ñộ proteaza chủng nghiên cứu………………………………34 Bảng 3.4: Ảnh hưởng pH ban ñầu ñến hoạt ñộ proteaza thu ñược…………….35 Bảng 3.5: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy………………………………………39 Bảng 3.6:Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy phương pháp quy hoạch thực nghiệm bề mặt………………………………………………………………………40 Bảng 5.1: Các nghiệm thực nghiệm tiến hành qui hoạch tối ưu kết quả………………………………………………………………………………… 45 ============================================================== LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ðỒ THỊ Tên hình vẽ Trang Hình 3.1: Ảnh hưởng pH ñến hoạt ñộ proteaza chủng DT2 37 Hình 3.2: Ảnh hưởng nồng ñộ CaCl2 ñến hoạt ñộ proteaza chủng DT2….37 Hình 3.3: Ảnh hưởng nồng ñộ glucoza ñến hoạt ñộ proteaza chủng DT2……………………………………………………………………………… 39 Hình 3.4 Ảnh hưởng yếu tố ñến hoạt ñộ proteaza cố ñịnh yếu tố lai A, B, C D giá trị biến nồng ñộ CaCl2, nồng ñộ glucoza, thời gian pH tương ứng………………………………………………………….41 Hình 3.5 Ảnh hưởng thời gian nồng độ CaCl2 đến hoạt độ proteaza 41 Hình 3.6 Ảnh hưởng pH nồng ñộ CaCl2 ñến hoạt ñộ proteaza…………….42 Hình 3.7 Ảnh hưởng thời gian nồng ñộ glucoza ñến hoạt ñộ proteaza……43 Hình 3.8 Ảnh hưởng tỷ lệ thời gian lên men ñến hiệu suất lên men……….45 ============================================================== LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= MỞ ðẦU Trong năm gần ñây, ngành nuôi trồng, khai thác chế biến thủy sản xuất Việt Nam phát triển mạnh mẽ, tơm đơng lạnh xuất đem lại thu nhập nguồn ngoại tệ cho ñất nước ñáng kể Tuy nhiên, với phát triển lượng lớn phế liệu thải lớn Do vậy, vấn ñể ñặt nghiên cứu tận dụng nguồn phế liệu ñể sản suất mặt hàng có giá trị gia tăng, nhằm đảm bảo u cầu sản xuất hơn, ñồng thời ñem lại nguồn kinh tế ñáng kể Hiện nay, việc tận dụng phế liệu tơm thực theo hướng sản xuất chitin – chitosan Tuy nhiên, trình sản xuất chitin chitosan từ vỏ tôm cần phải qua bước xử lý khử khoáng protein Trong nước thải có chứa thành phần lớn quan trọng protein Chính việc nghiên cứu để đưa quy trình thu hồi protein cần thiết Nếu thu hồi hỗn hợp ta sử dụng ñể bổ sung vào thức ăn gia súc, nuôi trồng thủy sản vừa góp phần làm tăng giá trị kinh tế cho quy trình sản xuất chitin vừa góp phần giải vấn đề nhiễm mơi trường dịch thải gây Nhận thấy tính cấp thiết vấn đề thu hồi protein từ quy trình sản xuất chitin chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus subtilis ñể khử protein vỏ tơm” Mục đích đề tài : Tối ưu hố điều kiện sinh tổng hợp Bacillus subtilis nhằm thu proteaza có hoạt lực cao nhất, đồng thời ñem ứng dụng vào thuỷ phân protein vỏ tôm cho hiệu suất thuỷ phân cao ============================================================== LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= I TỔNG QUAN I.1 HIỆN TRẠNG KHAI THÁC VÀ CHẾ BIẾN THỦY SẢN I.1.1 Thành phần phế phẩm tôm Tôm đối tượng quan trọng ngành ni trồng chế biến thủy sản Việt Nam Thịt tơm có giá trị dinh dưỡng cao có mùi vị thơm ngon ñặc trưng, hấp dẫn Hiện nay, sản phẩm tôm đơng lạnh xuất góp 70-80% tổng kim ngạch xuất toàn ngành (theo thống kê kim ngạch xuất thuỷ sản Việt Nam vòng tháng ñầu năm 2008) Hiện nước ta, kỹ thuật khai thác nuôi tôm phát triển ngày cung cấp nhiều nguyên liệu cho nhà máy chế biến thủy sản nước xuất nhiều mặt hàng như: Tơm tươi ngun cấp đơng IQF Block Tơm vỏ bỏ đầu cấp đơng IQF hay Block Tơm surimi Tơm bỏ vỏ đóng hộp Tơm bỏ vỏ, cịn đốt cấp đơng IQF Tơm bỏ vỏ, bỏ lưng hấp cấp đơng ðiều chứng tỏ tơm mặt hàng đem lại nguồn lợi kinh tế lớn cho ñất nước ñồng thời thải lượng ñáng kể phế liệu, chủ yếu vỏ đầu tơm Ngồi ra, có lượng đáng kể thịt vụ bóc nõn khơng cẩn thận số tôm bị thải loại biến màu, chất lượng khơng đảm bảo Tùy theo giống, lồi phương pháp gia công chế biến mà lượng phế liệu thay đổi từ 40% (đối với tơm sú) đến 60% (đối với tơm xanh) lượng ngun liệu thu mua ðối với sản phẩm tơm bóc nõn rút ruột mát theo vỏ tơm khoảng 25% Nhìn chung, phế liệu tơm trọng lượng phần đầu thường gấp – lần so với phần vỏ ============================================================== LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= Nồng ñộ protein chiết ñược phần dịch mà lọc thu ñược Dịch lọc mà ta thu ñược ñem ly tâm với tốc độ 6000vịng/phút khoảng 20 phút ñể ñảm bảo ñã loại bỏ hết phần tử cặn lại dung dịch chiết Sau ly tâm ta gạn bỏ phần cặn kết tủa thu dịch hồn tồn Pha lỗng dịch ly tâm ñến nồng ñộ cho tiến hành phản ứng màu giá trị ño ñược phải nằm ñường chuẩn mà ñã xây dựng Sau pha lỗng ta lấy 1ml dung dịch pha lỗng cộng với 4ml dung dịch màu Biuret, ñể phản ứng vịng 30phút tiến hành đo giá trị màu máy đo quang bước sóng 570nm II.2.3 Phương pháp qui hoạch thực nghiệm bề mặt ñáp ứng Sử dụng thiết kế tâm xoay ñối xứng (central composite design CCD) phương pháp bề mặt ñáp ứng Giá trị biến số thể bảng Bảng 2.1 Giá trị mã hóa thực nghiệm Biến số Giá trị mã hóa -2 -1 +1 +2 CaCl2, A [mg/L] 0,5 1,5 Glucoza, B [mg/L] 0,5 1,5 Thời gian, C [h] 14 16 18 20 22 pH, D 10 11 Phương pháp CCD với yếu tố ảnh hưởng với 24 thí nghiệm cộng với điểm biên (α=2) điểm tâm (n0=6) tổng cộng 30 thí nghiệm Hoạt độ proteaza biến phụ thuộc Thí nghiệm kết bố trí theo ma trận trình bày bảng phụ lục ============================================================== 34 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN III.1 Tuyển chọn chủng sinh tổng hợp protease cao III.1.1 ðịnh tính phương pháp đo đường kính vịng thuỷ phân Tiến hành cấy chấm ñiểm chủng nghiên cứu môi trường nuôi cấy tủ ấm 370C ðo đường kính khuẩn lạc đường kính vịng thủy phân 11 chủng sau 24 h ni cấy Kết thể bảng 3.1 Bảng 3.1 ðường kính khuẩn lạc vịng thuỷ phân Chủng ðường khuẩn lạc kính ðường kính vịng D-d (mm) thuỷ phân d (mm) Bacillus macerans D (mm) 30 49 19 SD1 38 54 16 NTSA 10 18 18 BKH 30 48 18 M3 42 50 W1 48 59 11 W14 42 51 M1 40 45 B9 15 DT1 32 49 17 DT2 35 54 19 chủng có đường kính vịng thuỷ phân lớn theo phương pháp khuếch tán ñĩa thạch phương pháp chấm điểm (bảng 3.1) đem ni cấy mơi trường lỏng Dịch ni cấy sau 24 h đem li tâm 6000 v/p tách sinh khối 100 µl dịch ni cấy chủng đem nhỏ vào hộp thạch chứa môi trường khuyếch tán theo ============================================================== 35 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= phương pháp II.2.2 Kết đo đường kính vịng thủy phân sau 48 h ñược thể bảng 3.2 Bảng 3.2 ðường kính vịng thuỷ phân ðường kính vịng thuỷ phân (mm) Chủng SD1 12 NSTA 15,5 Bacillus macerans 18 BKH 15 DT1 20 DT2 21 Kết bảng 3.2 cho thấy chủng DT2 có đường kính vịng thủy phân lớn 21 mm sau 48 h thủy phân môi trường III.1.2 ðịnh lượng phương pháp ño hoạt lực proteaza tạo thành theo phương pháp Anson cải tiến ðể khẳng định chủng sinh tổng hợp proteaza có hoạt tính cao nhất, tiến hành xác định hoạt độ chủng có đường kính vịng thủy phân lớn chủng Bacillus macerans, DT1 DT2 phương pháp Anson cải tiến Ba chủng ni cấy môi trường khoảng thời gian 24 h Dịch thu ñược ñem li tâm xác ñịnh hoạt ñộ proteaza theo phươg pháp Anson cải tiến Kết ñược thể bảng 3.3 Bảng 3.3 Hoạt ñộ proteaza chủng nghiên cứu Chủng HdP (U/mL) DT1 0,584 DT2 0,684 Bacillus macerans 0,535 ============================================================== 36 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= Kết bảng cho thấy có tương ứng hoạt độ proteaza với đường kính vịng thủy phân, đường kính vịng thủy phân lớn hoạt độ proteaza cao Qua kết bảng 3.1,3.2 3.3 chọn chủng DT2 cho nghiên cứu III.2 Tối ưu hóa ñiều kiện sinh tổng hợp proteaza III.2.1 Chọn yếu tố ảnh hưởng Ta tiến hành nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng ñến khả sinh tổng hợp proteaza B subtilis bao gồm thành phần môi trường dinh dưỡng, pH, thời gian nuôi cấy III.2.1.1 Ảnh hưởng pH pH có ảnh hưởng lớn đến q trình sinh trưởng chủng Bacillus subtilis hoạt ñộ enzyme proteaza mà sinh Vì ảnh hưởng pH ñến hoạt ñộ proteaza thu ñược ñã ñược nghiên cứu Tiến hành nuôi cấy chủng DT2 mơi trường với pH ban đầu điều chỉnh ñến giá trị 6, 8, 10 12 theo phương pháp nuôi cấy lỏng II.2.2.1 Dịch nuôi cấy sau 24 h ñem xác ñịnh hoạt ñộ proteaza theo phương pháp trình bày mục phương pháp nghiên cứu Kết ñược thể bảng 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hưởng pH ban ñầu ñến hoạt ñộ proteaza thu ñược pH HdP (U/ml) 0,0003 0,02 10 0,110 12 0,006 Kết bảng 3.4 biểu diễn hình 3.1 ============================================================== 37 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= 0,12 HdP (U/mL) 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 pH6 pH8 pH10 pH12 Hình 3.1 Ảnh hưởng pH đến hoạt ñộ proteaza chủng DT2 Kết bảng 3.4 hình 3.1 cho thấy pH có ảnh hưởng lớn ñến hoạt ñộ proteaza thu ñược Hoạt ñộ proteaza ñạt giá trị cao pH 10 giảm 5,5 lần pH 18 lần pH 12 III.2.1.2 Ảnh hưởng nồng ñộ CaCl2 Theo nhiều nghiên cứu trước nồng độ ion canxi có tác dụng tốt ñến hoạt ñộ proteaza tạo thành, tiến hành thay đổi nồng độ ion Ca Kết hình vẽ 3.2 cho thấy hoạt độ proteaza thu tăng ñến lần thêm g/L CaCl2 vào thành phần môi trường HdP (U/mL) 0,12 0,08 0,04 0 Nồng độ CaCl2 (g/L) Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng ñộ CaCl2 ñến hoạt ñộ proteaza chủng DT2 ============================================================== 38 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= III.2.1.3 Ảnh hưởng nồng ñộ ñường Tiếp theo ảnh hưởng nguồn C glucoza ñến hoạt ñộ proteaza ñược nghiên cứu Kết ñược biểu thị hình 3.3 cho thấy nồng độ glucoza có ảnh hưởng ñến hạt ñộ proteaza thu ñược 0,02 HdP (U/mL) 0,015 0,01 0,005 0 Nồng ñộ glucoza (g/L) Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ glucoza đến hoạt ñộ proteaza chủng DT2 III.2.1.3 Ảnh hưởng thời gian ni cấy ðộng học q trình sinh tổng hợp proteaza ñược nghiên cứu 370C Kết ño hoạt ñộ proteaza thời ñiểm bảng 3.5 Ta thấy hoạt ñộ proteaza thay ñổi theo thời gian, ñạt giá trị cao sau 16 h nuôi cấy ============================================================== 39 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= Bảng 3.5 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Thời gian(h) HpD(U/ml) 0,203 0,214 12 0,280 16 0,317 21 0,292 24 0,252 III.2.2 Tối ưu hóa điều kiện ni cấy phương pháp bề mặt đáp ứng Kết thí nghiệm đem xử lí chương trình Design-Expert 7.1 thu phương trình đáp ứng sau: Hoạt ñộ proteaza Y = 3.50 - 0.38*A - 0.41*B - 0.091*C + 0.83*D + 0.18*A*B + 0.10 *A*C- 0.038*A*D + 0.27*B*C + 0.034*B*D + 0.38*C*D - 0.34* A2 - 0.32* - 0.20*C2 - 0.60*D2 Trong Y giá trị ñáp ứng hoạt ñộ proteaza, A, B, C D giá trị biến nồng ñộ CaCl2, nồng ñộ glucoza, thời gian pH tương ứng Phân tích theo mơ hình bậc cho thấy mơ hình có nghĩa thể chuẩn Fisher với giá trị xác suất thấp [(Pmơ hình >F)=0.0001] Hệ số hồi qui bội R2=0.8987 cho thấy lệch giá trị thực so với mơ hình nhỏ, có 10.13% ============================================================== 40 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Thơng số Tổng bình phương Chuẩn F Mức có nghĩa P>F Mơ hình 41,420 19,380 < 0,0001 A-CaCl2 3,410 22,360 0,0001 B-Glucoza 4,090 26,790 0,0003 C-Thời gian 0,200 0,200 0,273 D-pH 16,420 107,610 < 0,0001 AB 0,530 3,490 0,081 AC 0,170 1,130 0,306 AD 0,023 0,150 0,701 BC 1,210 7,920 0,013 BD 0,018 0,120 0,735 CD 2,360 15,450 0,001 A^2 3,250 21,310 0,000 B^2 2,800 18,330 0,001 Các phân tích thống kê (bảng 3.5) cho thấy biến thay đổi khồng biến thiên tất biến khảo sát trừ thời gian có ảnh hưởng nhiều đến hoạt độ proteaza, thể mức có nghĩa P ñều nhỏ 0.05 ðồ thị biểu diễn ảnh hưởng yếu tố ñến hoạt ñộ proteaza cố định yếu tố cịn lại thể hình 3.4 ============================================================== 41 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= Perturbation 3.9 D AB C C BA Hoat proteaza 2.925 D 1.95 0.975 -1.000 -0.500 0.000 0.500 1.000 Deviation from Reference Point (Coded Units) Hình 3.4 Ảnh hưởng yếu tố ñến hoạt ñộ proteaza cố định yếu tố cịn lai A, B, C D giá trị biến nồng ñộ CaCl2, nồng ñộ glucoza, thời gian pH tương ứng Kết cho thấy tăng nồng ñộ CaCl2 glucoza từ 0.5 ñến 0.75 làm tăng hoạt ñộ proteaza lên, tiếp tục tăng nồng ñộ chất ñến 1.5 g/l làm giảm hoạt ñộ proteaza thu ñược Tương tự thời gian tốt cho hoạt ñộ proteaza khoảng nghiên cứu tức 16h Riêng pH tăng ñến làm tăng hoạt ñộ proteaza, tăng tiếp giá trị pH đến 10 hoạt độ proteaza giảm khơng đáng kể Ảnh hưởng pH lớn thể biến thiên lớn hoạt ñộ proteaza khỏang nghiên cứu ảnh hưởng thời gian Hình ảnh khơng gian ba chiều bề mặt đáp ứng hoạt độ proteaza biêu diễn hình 3.4, 3.5 3.6 ============================================================== 42 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= Hình 3.5 Ảnh hưởng thời gian nồng ñộ CaCl2 ñến hoạt ñộ proteaza 3.9 Hoat proteaza 3.25 2.6 1.95 1.3 1.50 10.00 1.25 9.50 1.00 9.00 D: pH 0.75 8.50 8.00 A: CaCl2 0.50 Hình 3.6 Ảnh hưởng pH nồng ñộ CaCl2 ñến hoạt ñộ proteaza ============================================================== 43 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= 3.8 Hoat proteaza 3.425 3.05 2.675 1.50 2.3 1.25 1.00 18.00 B: Glucoza 17.00 0.75 16.00 15.00 14.00 0.50 C: Thoi gian Hình 3.7 Ảnh hưởng thịi gian nồng độ glucoza đến hoạt độ proteaza Hoạt độ proteaza lớn theo mơ hình đạt ñược nồng ñộ CaCl2 0,5g/l, nồng ñộ glucoza 0,5 g/l, pH 9,37 thời gian nuôi cấy 14h III.3 Tìm điều kiện thích hợp cho q trình lên men phế liệu tôm loại protein Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng thời gian lên men tỉ lệ vỏ tơm: dịch ni cấy Bacillus subtilis DT2 đến khả loại protein phế liệu tôm Bổ sung 50 ml dịch canh trường lên men ñiều kiện tối ưu ñã nghiên cứu phần (nồng ñộ CaCl2 0,51g/l, nồng ñộ glucoza 0,5 g/l, pH 9,37 thời gian ni cấy 14h) vào bình tam giác chứa lượng vỏ tôm 5g, 10g, 20g Lượng protein cịn lại vỏ tơm xác định phương pháp Buiret sau khoảng thời gian lên men 12h, 24h, 36 h Kết thể hình 3.6: ============================================================== 44 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= Hàm lượng protein (%) 5g 10 g 20 g 12 24 36 Thời gian lên men(h) Hình 3.8 Ảnh hưởng tỷ lệ thời gian lên men ñến hiệu suất lên men Kết hình 3.7 cho thấy thời gian lên men kéo dài từ 12h, 24h, ñến 36h hàm lượng protein cịn lại vỏ tơm giảm ñối với tỉ lệ khác ðồng thời lượng vỏ tôm tăng tức tỷ lệ nguyên liệu vỏ tôm dịch nuôi cấy Bacillus subtilis giảm khả khử protein tăng lên ðiều giải thích lượng vỏ tơm tăng tăng khả sinh trưởng chủng Bacillus subtilis tăng khả sử dụng protein vỏ tơm dẫn đến lượng protein khử tăng Kết nghiên cứu thu ñược cho thấy tỷ lệ lên men 20g/50ml thời gian lên men 36h thu ñược hiệu suất lên men cao nhất, loại bỏ 96,14% protein vỏ tơm (lượng protein cịn lại 3,86%) So với kết nghiên cứu ðỗ Thị Bích Thuỷ - Trường ðH Nơng Lâm, ðH Huế Trần Thị Luyến - Trường ðại Học Thuỷ Sản thu sau 24h lên men % protein lại phế liệu so với mẫu chưa lên men 12,99% Sau 48h lại giảm khoảng 1% so với thời điểm 24h Sau giảm hàm lượng protein khơng đáng kể( sau 96h lại 11,25%) Như hiệu suất lên men thí nghiệm chúng tơi tiến hành cao hẳn ============================================================== 45 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= IV KẾT LUẬN Như vậy, qua trình nghiên cứu rút kết luận : Trong số 11 chủng phịng thí nghiệm chúng tơi tiến hành đo đường kính khuẩn lạc, đường kính vịng thuỷ phân ñồng thời ño hoạt lực proteaza theo phương pháp Anson cải tiến tơi chọn chủng DT2 có hoạt lực lớn đem tối ưu hố điều kiện sinh tổng hợp Sau tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng, sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm bề mặt ta thu điều kiện tối ưu hố chủng Bacillus subtilis nồng ñộ CaCl2 0,51g/l, nồng ñộ glucoza 0,5 g/l, pH 9,37 thời gian nuôi cấy 14h Tiến hành nhân giống môi trường vi sinh vật để lên men vỏ tơm, tìm điều kiện thích hợp cho trình lên men tỷ lệ lượng phế liệu môi trường nhan giống, thời gian lên men Chúng tơi thu kết tỷ lệ 20g/50ml 36h ============================================================== 46 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= V PHỤ LỤC Bảng 5.1 Các thí nghiệm tiến hành qui hoạch tối ưu kết Thí nghiệm A:CaCl2 B:Glucoza C:Thoi gian g/l g/l 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1 0,5 0,5 1 1 1,5 1,5 1,5 0,5 1,5 0,5 0,5 1,5 1,5 1,5 0,5 0,5 0,5 1 1,5 1 1 0,5 1,5 1 1 0,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 0,5 1,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1,5 0,5 h 16 16 16 16 14 12 14 16 16 20 16 14 14 18 16 18 18 16 14 16 18 14 18 14 14 18 18 16 16 18 D:pH 9 9 9 9 10 10 10 8 10 10 10 10 11 10 Hoat proteaza U/ml 3,504 2,961 3,484 3,379 3,202 3,138 0,76 3,502 3,549 2,873 3,554 1,321 1,325 0,347 1,872 0,5 2,73 3,399 2,617 0,08 0,997 0,558 0,103 2,617 3,507 3,878 3,059 2,711 1,634 2,647 ============================================================== 47 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn tốt nghiệp Phạm Thị Trang K49 ================================================================= Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng Việt ðặng Thị Thu, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Tơ Kim Anh,1997 Thí nghiệm hố sinh cơng nghiệp Viện công nghệ sinh học thực phẩm, môn hố sinh, trường đại học Bách Khoa – Hà Nội Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thuỷ, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi, 2005 Các phương pháp phân tích ngành cơng nghệ lên men NXB Khoa Học Kĩ Thuật, Hà Nội Viện công nghệ sinh học thực phẩm, 2006 Thí nghiệm vi sinh vật cơng nghiệp Trường đại học Bách Khoa, Hà Nội sinhviendct net/forum/showthread.php?t=1293 www.ific.org/nutrition/functional/upload/functionalfoodsbackgrounder.pdf www.hoahocvietnam.com Tài liệu tiếng Anh Peng, Y., X Yang, Y Zhang, 2005 Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo Appl Microbiol Biotechnol 69, 126-132 Panuwan C., Anchalee O., Khanungkan K., Ekachai , and Saisamom L., 2002 Characterization of proteases of Bacillus subtilis strain 38 isolated from traditionally fermented soybean in Northern Thailand ScienceAsia, (28), 241-245 www.beta-glucan-info.com/enzyme_facts.htm 10 www.functionalfoodnet.eu/images/site/asset/a-New%20FF%20Ingredcardio%20health.pdf 11 en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis ============================================================== 48 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... cầu O2 ñầy ñủ I.3.3Tình hình nghiên cứu trình khử protein phế liệu tôm Bacillus subtilis Vi? ??t Nam giới Vi? ??t Nam có nhiều nghiên cứu ứng dụng thuỷ phân protein vỏ tơm để thu chitin nhiều phương... tính cấp thiết vấn đề thu hồi protein từ quy trình sản xuất chitin chúng tơi tiến hành nghiên cứu ñề tài: ? ?Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus subtilis để khử protein vỏ tơm” Mục đích đề tài :... phẩm Ngành : Công nghệ sản phẩm lên men ðề tài tốt nghiệp: ? ?Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn Bacillus subtilis để khử protein vỏ tơm” Giáo vi? ?n hướng dẫn : TS Lê Thanh Hà Ngày giao luận văn : Ngày