Sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học từ dịch chiết lá cây thầu dầu ricinus communis và lá cây thuốc cá deris scandens ứng dụng trong phòng trừ bọ phấn bemisia tabaci hại cây trồng

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ NĂM 2018 SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ DỊCH CHIẾT LÁ CÂY THẦU DẦU (Ricinus communis) VÀ LÁ CÂY THUỐC CÁ (Derris scandens) ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ BỌ PHẤN (Bemisia tabaci) HẠI CÂY TRỒNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2018 BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ NĂM 2018 SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ DỊCH CHIẾT LÁ CÂY THẦU DẦU (Ricinus communis) VÀ LÁ CÂY THUỐC CÁ (Derris scandens) ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG TRỪ BỌ PHẤN (Bemisia tabaci) HẠI CÂY TRỒNG CƠ QUAN CHỦ TRÌ CHỦ NHIỆM (Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký ghi rõ họ tên) Trần Thu Trang THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2018 MỤC LỤC TĨM TẮT v THÔNG TIN CHUNG VỀ NHIỆM VỤ .vi PHẦN MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết nhiệm vụ Mục tiêu cuả nhiệm vụ Giới hạn nghiên cứu CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Ricin thầu dầu ( Ricinus communis) 1.2 Tổng quan thuốc cá (Derris scandens) 1.3 Phát sinh gây hại bọ phấn (Bemisia tabaci) .9 1.4 Giới thiệu số phương pháp chiết 14 1.5 Tình hình nghiên cứu nước giới 19 CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Nội dung nghiên cứu 24 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 24 2.3 Vật liệu nghiên cứu 25 2.4 Phương pháp nghiên cứu 26 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Thử nghiệm phương pháp chiết khác 33 3.2.Xác định ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến chất lượn dịch chiết 36 3.3.Khảo sát khả diệt trừ bọ phấn (Bemisia tabaci)của dịch chiết thầu dầu (R Communis) kết hợp với dịch chiết thuốc cá (Derris scandens) 40 i 3.4.Thí nghiệm khảo sát khả diệt trừ sâu hỗn hợp dịch chiết sau phối trộn với loại phụ gia khác 46 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 4.1 Kết luận 50 4.2 Kiến nghị 50 Tài liệu tham khảo 51 ii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cành, hoa thầu dầu (R cummunis) Hình 1.2 Cấu trúc ricin .4 Hình 1.3 Cây thuốc cá (Derris scandens) Hình 1.4 Phân tử rotenone Hình 1.5 Ba pha phát dục bọ phấn .9 Hình 1.6 Bọ phấn chích hút nhựa gây nên bệnh xoăn đọt 11 Hình 1.7 Bệnh khảm xoăn dưa bọ phấn mơi giới truyền Virus 11 Hình 2.1 Quy trình xử lý trước tách chiết 26 Hình 2.2 Tủ nuôi bọ phấn 30 Hình 2.3 Bọ phấn ni lồng nuôi 32 Hình 3.1 Bột trước sau chiết 34 Hình 3.2 Dịch chiết thầu dầu, thuốc cá sau quay chân khơng 36 Hình 3.3 Chạy máy cô quay chân không loại bỏ dung môi dịch chiết 37 Hình 3.4 Biểu đồ hàm lượng Ricin thu tỉ lệ dung môi chiết khác 39 Hình 3.5 Khoai tây không ngâm dịch chiết lá, khoai tây ngâm dịch chiết 41 Hình 3.6 Bọ phấn chết quan sát qua kính hiển vi soi 42 Hình 3.7 Phịng ni bọ phấn thí nghiệm tỉ lệ pha trộn loại dịch chiết thầu dầu, thuốc cá 42 Hình 3.8 Bọ phấn khơng di chuyển bám vào nắp lồng nuôi 43 Hình 3.9 Bọ phấn chết cơng thức pha trộn dịch chiết khác 45 Hình 3.10 Tủ nuôi bọ phấn 47 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Hàm lượng Ricin, Rotenone dịch chiết thầu dầu, thuốc cá phương pháp chiết khác 35 Bảng 3.2 Hàm lượng Ricin thu tỉ lệ dung môi/nguyên liệu khác 38 Bảng 3.3 Hàm lượng Rotenone thu tỉ lệ dung môi/nguyên liệu khác 39 Bảng 3.4 Hiệu lực diệt trừ bọ phấn tỉ lệ phối trộn khác 44 Bảng 3.5 Hiệu lực thuốc sau phối trộn với loại phụ gia khác 48 iv TÓM TẮT Nhiệm vụ KHCN cấp sở “Sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học từ dịch chiết thầu dầu (Ricinus communis) thuốc cá (Derrisscandens) ứng dụng phòng trừ bọ phấn (Bemisia tabaci) hại trồng”gồm giai đoạn: Giai đoạn 1: Xây dựng quy trình tách chiết hoạt chất có chứa ricin, rotenone từ thầu dầu, thuốc cá ( năm 2018) Giai đoạn 2: Đánh giá hiệu lực sản phẩm đồng ruộng ( năm 2019) Giai đoạn thực từ tháng 1/2018 đến tháng 12/2018 Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao thu kết sau: Sản phẩm dịch chiết xác định máy sắc kí lỏng cao áp có hàm lượng ricin: 30,51 g/L; hàm lượng rotenone: 205 mg/L Quy trình tách chiết hoạt chất chưa ricin, rotenone từ thầu dầu, thuốc cá Lá sau xử lý sấy 500C đến đạt độ ẩm khoảng 12%-13%, xay nhỏ thành bột Kg bột trộn với 24 lít dung dịch ethanol 980 Tiếp theo cho hỗn hợp vào bình thủy tinh chạy mẫu bể siêu âm để phá vớ tế bào Lọc bỏ xác màng lọc Nylon Advantec µm thu dịch lọc Sau dịch lọc tách bỏ dung mơi máy cô chân không Thu 500 mL dịch chiết cô đặc Dịch chiết loại pha trộn theo tỉ lệ: 50% dịch chiết thầu dầu + 50% dịch chiết thuốc cá Sản phẩm hỗn hợp dịch chiết thầu dầu thuốc cá đạt khả diệt trừ bọ phấn phịng thí nghiệm 56,98 % Sản phẩm dịch chiết bổ sung thêm phụ gia Aceton với tỉ lệ 1:10 Sản phẩm dịch chiết sau bổ sung chất phụ gia đạt khả diệt trừ bọ phấn 60,19 % v THÔNG TIN CHUNG VỀ NHIỆM VỤ Tên nhiện vụ: Sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học từ dịch chiết thầu dầu (Ricinus communis) thuốc cá (Derrisscandens) ứng dụng phòng trừ bọ phấn (Bemisia tabaci) hại trồng Chủ nhiệm: Họ tên: Trần Thu Trang Năm sinh: 1994 Giới tính: Nữ Học vị: Cử nhân Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Năm đạt học vị: 2017 Năm phong chức danh: Chức danh khoa học: Chức vụ: Kỹ sư phịng Hỗ trợ cơng nghệ vi sinh Tên quan công tác: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao Đại quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, Tp.HCM Điện thoại quan: 02862646103 Fax: 02862646104 Địa nhà riêng: Điện thoại riêng: ĐTDĐ: 0379974672 Email: tranthutrang.160494@gmail.com Tên quan chủ trì: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nơng nghiệp Công nghệ cao Điện thoại: 028.62646103 Fax: 028.62646104 E-mail: info@abi.com.vn Website: www.abi.com.vn vi Địa chỉ: ấp 1, xã Phạm Văn Cỗi, huyện Củ Chi, Tp HCM Văn phòng giao dịch: Số 499, Cách Mạng Tháng 8, phường 13, quận 10, Tp.HCM Thời gian thực hiện: 24 tháng Kinh phí: 156.945.000 đồng Nội dung Nội dung 1: Xây dựng quy trình tách chiết hoạt chất có chứa ricin, rotenone từ thầu dầu, thuốc cá Nội dung 2: Xác định hiệu lực diệt trừ bọ phấn chế phẩm phịng thí nghiệm Sản phẩm - Báo cáo khoa học - Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ dịch chiết thầu dầu (Ricinus communis) thuốc cá (Derrisscandens) ứng dụng phòng trừ bọ phấn (Bemisia tabaci) hại trồng - lít chế phẩm sinh học Tiến độ thực STT Nội dung Kết Người thực Thời gian thực Giai đoạn (2018) Thử nghiệm phương pháp chiết khác 01/2018 Hoàn thành 100% vii Trần Thu Trang đến 04/2018 Thử nghiệm ảnh hưởng Hoàn tỉ lệ dung môi thành nguyên liệu 100% 05/2018 Trần Thu Trang đến Nguyễn Tiến Duy 06/2018 Khảo sát khả diệt trừ bọ phấn (Bemisia tabaci) dịch chiết thầu Hoàn 07/2018 Nguyễn Duy Long dầu (R Communis) kết hợp thành với dịch chiết 100% đến Trần Thu Trang 9/2018 thuốc cá (Derrisscandens) phịng thí nghiệm Thí nghiệm khảo sát khả diệt trừ sâu hỗn hợp dịch chiết sau phối trộn với loại phụ gia Hoàn thành 10/2018 Trần Thu Trang đến 100% 11/2018 Tổng hợp tài liệu viết Hoàn 11/2018 báo cáo nghiệm thu (giai thành khác phịng thí nghiệm đoạn 1) 100% viii Trần Thu Trang đến Nguyễn Tiến Duy 12/2018 25 ± 1°C 75-80% độ ẩm tương đối Sau 72 nuôi tiến hành xác định hiệu lực thuốc Hình 3.10 Tủ ni bọ phấn Hiệu lực thuốc tính theo cơng thức Abbott: Trong đó: E(%): Hiệu lực thuốc tính (%) C: Số bọ phấn cịn sống cơng thức đối chứng T: Số bọ phấn cịn sống cơng thức xử lí thuốc (Bọ phấn cho thấy không phản ứng với chuyển động đầu thể co thắt chạm ghi chết) 47 Kết thử nghiệm khả diệt trừ sâu hỗn hợp dịch chiết sau phối trộn với loại phụ gia khác thể bảng 3.5 Bảng 3.5 Hiệu lực thuốc sau phối trộn với loại phụ gia khác Chất phụ gia Activator 90 Hiệu lực thuốc 58,18% a Acetone 60,19% b P < 0,05 Bọ phấn thả vào lồng ni có khoai tây xử lý Sau 40-45 phút bọ phấn có biểu giảm hoạt động tất nghiệm thức bọ phấn trở lại hoạt động bình thường cơng thức đối chứng cịn công thức dịch chiết phối trộn với phụ gia acetone, dịch chiết phối trộn với activator 90 bắt đầu xuất bọ phấn chết Sau 72 theo dõi Số bọ phấn chết nghiệm thức phối trộn với acetone đạt trung bình 19,25 con;đối với cơng thức đối chứng (ngâm khoai tây acetone) có bọ phấn bị chết; có trung bình 18,5 bọ phấn chết công thức phối trộn với activator 90 Hiệu lực thuốc cao 60,19 % công thức phối trộn dịch chiết với acetone Khi phối trộn dịch chiết với activator 90, hiệu lực thuốc thấp đạt 58,18% Kết phù hợp với kết nghiên cứu Chaojin cộng năm 2012 48 Vì vậy, nên sử dụng acetone làm chất phụ gia cho chế phẩm sinh học từ dịch chiết thầu dầu thuốc cá ứng dụng phòng trừ bọ phấn hại trồng 49 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Hồn thiện quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ dịch chiết thầu dầu (Ricinus communis) thuốc cá (Derrisscandens) ứng dụng phòng trừ bọ phấn (Bemisia tabaci) hại trồng: Lá sau xử lý sấy 500C, xay nhỏ thành bột Bột trộn với dung môi ethanol 980 bình thủy tinh lớn chạy bể siêu âm Tiếp theo lọc bỏ xác màng lọc Nylon Advantec µm thu dịch lọc Dịch lọc thu sau trình tách chiết đem chạy máy cô quay chân không thu dịch cô đặc Sản phẩm dịch chiết có pha trộn theo tỉ lệ: 50% dịch chiết thầu dầu + 50% dịch chiết thuốc cá Hỗn hợp dịch chiết trộn với Acetone theo tỉ lệ 1:10 - Sản phẩm dịch chiết pha trộn theo tỉ lệ: 50% dịch chiết thầu dầu + 50% dịch chiết thuốc cá Sản phẩm hỗn hợp dịch chiết thầu dầu thuốc cá đạt khả diệt trừ bọ phấn phịng thí nghiệm 56,98 % Sản phẩm dịch chiết bổ sung thêm phụ gia Acetone với tỉ lệ 1:10 Sản phẩm dịch chiết sau bổ sung chất phụ gia đạt khả diệt trừ bọ phấn 60,19% 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục thực thí nghiệm khảo sát hoạt lực chế phẩm quy mơ ngồi đồng ruộng - Cần xác định hiệu lực chế phẩm sau thời gian bảo quản 50 Tài liệu tham khảo Tài liệu nước: Đỗ Tất Lợi, 1999 Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB y dược Hà Nội Lê Văn Việt Mẫn, 2011 Sử dụng sóng siêu âm trích ly isoflavone Nguyễn Duy Cường, Nguyễn Hữu Quỳnh (1999), Từ điển bách khoa dược học NXB Từ điển bách khoa HN Phạm Khắc Hiếu, Bùi Thị Tho, 1994 Đông dược thú y NXB Nông nghiệp Phan Phước Hiền, Heinz Gortnizka, Raymond Kraemer, 2003 Rotenone – Tiềm triển vọng nông nghiệp bền vững Quy phạm khảo nghiệm hiệu lực loại thuốc bảo vệ thực vật trừ bệnh phấn trắng hại họ bầu bí đồng ruộng Field trials of fungicides agaist powdery mildew on cucurbitaceae, 2010 TCCS 14: 2010/BVTV Trần Công Khanh, Phạm Quang Hải, 1992 Cây độc Việt Nam NXB y dược Hà Nội Tài liệu nước ngoài: Alexander Monastyrskii, Alexey Devyakin, 2001 Các loại bướm phổ biến Việt Nam (sách hướng dẫn) Nhà xuất bản đồ Aplin PJ, Eliseo T (tháng năm 1997) “Ingestion of castor oil plant seeds” Med J Aust 167 (5): 260–1 PMID 9315014 10 Bohmfalk G.T; Frisbie R.E; Sterling W.L; Metzer R.B and Knutson A.E 1996 Identification, biology and sampling of cotton insects; White flies (Bemisia tabaci[ Gennadius]) [ on-line] 11 Bridgemohan P, Bridgemohan RSH, 2014 Invasive weed risk assessment of three potential bioenergy fuel species International Journal of 51 Biodiversity and Conservation, 6(11):790-796 http://academicjournals.org/article/article1416497061_Bridgemohan%20a nd%20Bridgemohan.pdf 12 Chaojun Lv, Baozhu Zhong, Guohua Zhong, Qunfang Weng,Shaohua Chen, Meiying Hu,Xiaodong Sun and Weiquan Qin, 2012 Four Botanical Extracts are Toxic to the Hispine Beetle, Brontispa longissima, in Laboratory and Semi—field Trials 13 Cristiane de Melo Cazal, Jaqueline Raquel Batalhão, Vanessa de Cássia Domingues, Odair Corrêa Bueno, Edson Rodrigues Filho, Moacir R Forim, Maria Fátima G Fernandes da Silva, Paulo Cezar Vieira, João Batista Fernandes, 2009 High-speed counter-current chromatographic isolation of ricinine, an insecticide from Ricinus communis 14 Davidson, W M (1930) Rotenone as a contact insecticide J Econ Entomol 23: 868-874 15 Ferdinando L Mirarchi cộng sự, 2017 Ricin Exposure 16 Fliniaux O, Mesnard F, Grandic SR, Sylvie BR, Bienaimé C, Richard JR, Fliniaux MA 2004 Altered nitrogen metabolism associated with differentiated suspension cultures derived from root cultures of Datura stramonium studied by heteronuclear multiple bond coherence (HMBC) NMR spectroscopy Journal of Experimental Botany 55: 1053-1060 17 G.R Waller, M.S.-I Tang, M.R Scott, F.J Goldberg, J.S Mayes, H Auda, Plant Physiol 40 (1965) 803 18 Gordon DR, Tancig KJ, Onderdonk DA, Gantz CA, 2011 Assessing the invasive potential of biofuel species proposed for Florida and the United States using the Australian Weed Risk Assessment Biomass and Bioenergy, 35(1):74-79 http://www.sciencedirect.com/science/journal/09619534 52 19 Joshi M., Waghmare S., Chougule P., Kanase A (2004) "Extract of Ricinus communis leaves mediated alterations in liver and kidney functions against single dose of CCl4 induced liver necrosis in albino rats." Journal of Ecophysiology and Occupational Health (3–4): 169– 173 ISSN 0972-4397 20 Mậu Bân, Trần Bội Trân, 1997 Bướm đảo Hải Nam NXB Lâm nghiệp Trung Quốc) 21 Ronald F.L Mau Martin Jayma L.Kessing.1992 Bemisia tabaci biological characteristics as biological control agents Department of Entomology Honolulu, Hawai 22 S I., Zubairi cộng sự, 2004 THE EFFECT OF ROTENONE CRUDE EXTRACT FROM Derris elliptica ON THE LARVICIDAL ACTIVITY (MORTALITY) OF MOSQUITO 23 Sabina E.P., Rasool M.K., Mathew L., Parameswari (May–August 2009) "Studies on the protective effect of Ricinus communis leaves extract on carbon tetrachloride hepatotoxicity in albino rats" Pharmacologyonline 2: 905–916 ISSN 1827-8620 24 Schep LJ, Temple WA, Butt GA, Beasley MD (tháng 11 năm 2009) “Ricin as a weapon of mass terror—separating fact from fiction” Environ Int 35 (8): 1267–71 PMID 19767104 doi:10.1016/j.envint.2009.08.004 25 Ujváry I (2010) Krieger R, biên tập Hayes´ Handbook of Pesticide Toxicology Elsevier, Amsterdam tr 119–229 ISBN 978-0-12-3743671 26 Viện lâm nghiệp Tây Nam, 2003 Bọ rùa Vân Nam NXB Kỹ thuật Vân Nam 27 Wright HT, Robertus JD (tháng năm 1987) “The intersubunit disulfide bridge of ricin is essential for cytotoxicity” Arch Biochem Biophys 256 53 (1): 280–4 PMID 3606124 doi:10.1016/0003-9861(87)90447-4 28 Zahir AA, Rahuman AA, Bagavan A et al (August 2010) "Evaluation of botanical extracts against Haemaphysalis bispinosa Neumann and Hippobosca maculata Leach" Parasitol Res 107 (3): 585–92 doi:10.1007/s00436-010-1898-7 PMID 20467752 29 Zhou J, Zheng X, Yang Q, Liang Z, Li D, Yang X, Xu J, 2013 Optimization of ultrasonic-assisted extraction and radical-scavenging capacity of phenols and flavonoids from Clerodendrum cyrtophyllum Turcz leaves doi: 10.1371/journal.pone.0068392 Tài liệu internet 30 https://vi.wikipedia.org/wiki/Th%E1%BA%A7u_d%E1%BA%A7u https://www.thaythuoccuaban.com/vithuoc/thaudau.htm 54 PHỤ LỤC Kết thống kê Khảo sát phương pháp chiết khác Tn1- Thuốc cá T-Test [DataSet0] Group Statistics nghiemthuc hamluong nt1 nt2 N 5 Mean Std Deviation 43,00 3,082 104,00 4,301 Std Error Mean 1,378 1,924 Independent Samples Test Levene's Test for Equality of Variances t-test for Equality of Means F haml Equal uong variances assumed Equal variances not assumed Sig 1,565 ,246 t 25,777 df Std Sig Mean Error (2- Differ Differ tailed) ence ence 95% Confidence Interval of the Difference Lower Upper ,000 2,366 61,000 66,457 55,543 7,251 ,000 25,777 2,366 61,000 66,557 55,443 55 Tn1- thầu dầu Group Statistics nghiemthuc hamluon g Std N Mean Deviation Std Error Mean 6,900 ,3808 ,1703 15,925 ,4646 ,2323 Independent Samples Test Levene's Test for Equality of Variances F Sig t t-test for Equality of Means Sig Std 95% Confidence (2- Mean Error Interval of the Difference taile Differen Differ df d) ce ence Lower Upper haml Equal uong varian ces ,001 ,972 -32,128 ,000 -9,0250 ,2809 assum ed Equal varian ces not -31,334 5,829 ,000 -9,0250 ,2880 assum ed Khảo sát tỉ lệ dung môi/nguyên liệu Tn2-Thuốc cá Descriptives 56 -9,6892 -8,3608 -9,7348 -8,3152 hamluong 95% Confidence Interval for Mean N Total 4 4 16 Std Std Mean Deviation Error 104,00 205,00 170,00 162,00 160,25 4,243 4,690 4,899 5,228 37,712 Lower Bound 2,121 2,345 2,449 2,614 9,428 Upper Bound 97,25 197,54 162,20 153,68 140,15 Minim Maxim um um 110,75 212,46 177,80 170,32 180,35 ANOVA hamluong Sum of Squares Between Groups Within Groups Total Mean Square Df 21059,000 274,000 12 21333,000 15 F Sig 7019,667 307,431 ,000 22,833 Post Hoc Tests Homogeneous Subsets Hamluong Duncan nghie Subset for alpha = 0.05 mthu c N 4 104,00 4 162,00 170,00 57 100 199 164 157 100 109 210 174 167 210 205,00 Sig 1,000 1,000 1,000 1,000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed CV%=2.981834 P