Hợp tác nghiên cứu quy trình sản xuất một số chế phẩm sinh học từ tế bào gốc màng ối người

BỘ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ BỘ QUỐC PHỊNG NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ QUYỂN BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI: HỢP TÁC NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH SẢN XUẤT MỘT SỐ CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ TẾ BÀO GỐC MÀNG ỐI Cơ quan chủ trì đề tài: Học viện Quân y Chủ nhiệm đề tài: TS.BS Phạm Văn Trân HÀ NỘI - 2012 BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ QUỐC PHÒNG NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ VỀ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI HỢP TÁC NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH SẢN XUẤT MỘT SỐ CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ TẾ BÀO GỐC MÀNG ỐI Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài TS.BS Phạm Văn Trân Ban chủ nhiệm chương trình GS.TS Hồng Văn Lương Bộ Khoa học Công nghệ Hà Nội - 2012 MỤC LỤC MỤC LỤC BẢNG CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG 11 MỞ ĐẦU 12 Luận cứ, cách tiếp cận để đạt mục tiêu 20 NỘI DUNG KHOA HỌC ĐÃ THỰC HIỆN 22 PHẦN I: CƠ SỞ LÝ THUYẾT 22 Đặc điểm sinh học màng ối người Việt Nam liên quan đến việc lựa chọn phân lập tế bào gốc 22 Phân lập, nuôi cấy bảo quản tế bào gốc màng ối 27 Biệt hóa tế bào gốc màng ối người thành tế bào biểu bì tế bào be ta tụy đảo 36 Xây dựng qui trình sản xuất tế bào gốc màng ối 40 Đánh giá hiệu sử dụng tế bào gốc màng ối điều trị vết thương, vết bỏng động vật thực nghiệm 45 Xây dựng tiêu chuẩn sở đánh giá sản phẩm sinh học tế bào gốc màng ối: 49 PHẦN II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 51 Đặc điểm sinh học màng ối người Việt Nam liên quan đến việc lựa chọn phân lập tế bào gốc 51 Phân lập, nuôi cấy bảo quản tế bào gốc màng ối 51 Biệt hóa tế bào gốc màng ối người thành tế bào biểu bì tế bào be ta tụy đảo 56 Xây dựng qui trình sản xuất tế bào gốc màng ối 57 4.1 Chuẩn bị màng ối đông khô 58 4.2 Sản xuất tế bào gốc màng ối 59 Đánh giá hiệu sử dụng tế bào gốc màng ối điều trị vết thương, vết bỏng động vật thực nghiệm 61 Các kỹ thuật khác 65 6.1 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) 65 6.2 Kỹ thuật hóa miễn dịch tế bào 66 6.3 Kỹ thuật Western blot 67 6.4 Nhuộm Trypan blue xác định tỷ lệ tế bào sống 67 6.5 Đo tăng sinh tế bào 68 PHẦN III: KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐÃ ĐẠT ĐƯỢC 70 Đặc điểm sinh học màng ối người Việt Nam liên quan đến việc lựa chọn phân lập tế bào gốc 70 1.1 Xác định cấu trúc biểu mô màng ối, màng màng vô mạch tiêu nhuộm HE 70 1.2 Xác định quần thể tế bào biểu mô, tế bào gốc màng ối 71 Kết phân lập, nuôi cấy bảo quản tế bào gốc màng ối 74 2.1 Phân lập 74 2.2 Nuôi cấy tăng sinh 75 2.3 Bảo quản phục hồi thành công tế bào gốc màng ối 81 Biệt hóa tế bào gốc màng ối người thành tế bào biểu bì tế bào beta tụy đảo 85 3.1 Kết biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào biểu bì (keratinocytes) 85 3.1.1 Kết nhuộm hóa miễn dịch tế bào 85 3.1.2 Kết RT-PCR 86 3.1.3 Kết western blot 87 3.2 Kết biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào beta 88 3.2.1 Biểu OCT-4 - dấu ấn tế bào gốc 90 3.2.2 Biểu Insulin - Dấu ấn tế bào gốc biệt hóa thành tế bào beta 92 4 Xây dựng qui trình sản xuất tế bào gốc màng ối 95 4.1 Kết thu nhận màng ối tươi 95 4.2 Kết xử lý đông khô màng ối 96 4.3 Kết thu màng ối đông khô sau xử lý tia phóng xạ 97 4.4 Kết kiểm tra cấu trúc màng ối đông khô 98 4.5 Lựa chọn giá đỡ phù hợp để nuôi cấy tế bào gốc màng ối 100 4.6 Đánh giá khả tồn phát triển tế bào gốc giá đỡ hình thái, số lượng tế bào 101 Đánh giá hiệu sử dụng tế bào gốc màng ối điều trị vết thương, vết bỏng động vật thực nghiệm 102 5.1 Diễn biến lâm sàng thỏ thực nghiệm vết thương ghép tế bào gốc màng ối 102 5.1.1 Diễn biến toàn thân 103 5.1.2 Thay đổi số số máu ngoại vi thỏ bị bỏng trình điều trị 104 5.2 Diễn biến tế bào gốc màng ối vết thương, đánh giá khả tồn tế bào gốc màng ối 107 5.2.1 Tình trạng vết bỏng ngày đầu sau bỏng 107 5.2.2 Tổn thương chỗ vết bỏng ngày thứ đến ngày thứ 109 5.2.3 Tổn thương chỗ vết bỏng ngày thứ 10-15 111 5.2.4 Tổn thương chỗ vết bỏng ngày thứ 16-24 113 5.2.5 Tổn thương chỗ vết bỏng ngày thứ 28 115 5.2.6 Tốc độ thu hẹp diện tích vết bỏng sau điều trị nhóm 118 5.4 Hình thái cấu trúc mơ vùng vết thương che phủ tế bào gốc màng ối 120 5.5 Thay đổi vi khuẩn học vết thương ghép tế bào gốc màng ối…………… 127 5.5.1 Nhiễm khuẩn vết bỏng ngày thứ sau điều trị 127 5.5.2 Nhiễm khuẩn vết bỏng ngày thứ sau điều trị 128 5.5.3 Nhiễm khuẩn vết bỏng ngày thứ 14 sau điều trị 128 5.6 Tính an tồn tế bào gốc màng ối ghép vết bỏng thực nghiệm 129 5.6.1 Ảnh hưởng điều trị che phủ TBG màng ối vết thương bỏng tiêu hóa sinh chức gan, thận 129 5.6.2 Tính an tồn TBG màng ối đông khô 130 Xây dựng tiêu chuẩn sở đánh giá sản phẩm sinh học tế bào gốc màng ối: 131 6.1 Yêu cầu chất lượng 131 6.1.1 Công thức: 131 6.1.2 Tiêu chuẩn nguyên liệu: 132 6.1.3 Chất lượng thành phẩm 132 6.2 Đóng gói, ghi nhãn, bảo quản 134 KẾT LUẬN 135 KIẾN NGHỊ 137 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH… ……………………….135 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 149 BẢNG CHỮ VIẾT TẮT AFP BMP CK DMEM DMSO FBS GAPDH HAE HAM HLA HNF-4 ICAM MO NCAM Nhuộm HE NMSL Oct PBS PCAM PL RT-PCR Alpha Feto Proteine Bone Morphogenetic Protein Cytokeratin Dulbecco’s Modified Eagle’s medium Dimethyl sulfoxide Fetal Bovine Serum: Huyết bào thai bê Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human Amniotic Epithelial Cells Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells Human Leukocyte Antigen Hepatocyte Nuclear Factor -4 Intercellular Adhesion Molecule-1, CD54 Màng ối Neural Cell Adhesion Molecule Phương pháp nhuộm Hematoxilyn/Eosin Nước muối sinh lý Octamer-binding transcription factor-4 Phosphate Buffered Salin Platelet-endothelial cell adhesion molecule Plastic Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction SCF SGOT SGPT SMA SSEA-4 TBG VCAM Stem Cell Factor Serum Glutamat Oxaloacetat Transaminase Serum Glutamat Pyruvat Transaminase Smooth Muscle Actin Stage-Specific Embryonic Antigen Tế bào gốc Vascular cell adhesion molecule DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ thai vị trí màng ối 22 Hình 1.2 Sơ đồ cấu trúc màng ối 23 Hình 1.3 Đặc tính tế bào gốc màng ối 32 Hình 1.4 Nhuộm hóa miễn dịch tế bào gốc màng ối 33 Hình 1.5 Hình thái tăng sinh tế bào gốc màng ối 34 Hình 1.6 Khả biệt hóa tế bào gốc màng ối 36 Hình 2.1 Sơ đồ ly tâm với Percoll 53 Hình 2.2 Quy trình phân lập tế bào gốc từ màng ối 56 Hình 2.3 Hệ thống máy làm đơng khơ màng sinh học 58 Hình 2.4 Sơ đồ hệ thống xử lý màng ối đông khô phóng xạ 59 Hình 3.1: Cấu trúc màng ối tiêu nhuộm HE 70 Hình 3.2: Nhuộm hóa mơ miễn dịch màng ối 73 Hình 3.3 Hình ảnh tế bào chụp trực tiếp đĩa ni cấy qua kính hiển vi đối pha 76 Hình 3.4 Khả tăng sinh tế bào gốc màng ối 77 Hình 3.5 Xác định đặc tính tế bào gốc màng ối kỹ thuật hóa miễn dịch huỳnh quang 80 Hình 3.6 Nhuộm Trypan blue xác định tỷ lệ tế bào sống 82 Hình 3.7 Hình ảnh tế bào gốc sau 24 ni cấy 84 Hình 3.8 Hình ảnh nhuộm hóa miễn dịch OCT-4, vimentin, CK-14, CK-19 85 Hình 3.9: Biểu ARNtt CK-14 CK-19 86 Hình 3.10 Kết Western blot OCT-4 CK-14 87 Hình 3.11 Hình ảnh tế bào gốc màng ối người sau ngày nuôi cấy 92 Hình 3.12: Biểu ARNtt protein Insulin 93 Hình 3.13 Màng ối tươi tách từ bánh rau 96 Hình 3.14 Các màng ối thu sau xử lý qua hệ thống làm đông khô 97 Hình 3.15 Cấu trúc mơ học màng ối 99 Hình 3.16 Hình ảnh tế bào gốc ni cấy màng ối đông khô “làm ướt” 101 Hình 3.17 Tốc độ tăng sinh tế bào gốc màng ối 102 Hình 3.18 Tổn thương bỏng thực nghiệm sau gây bỏng 108 Hình 3.19 Tổn thương vi thể vết bỏng vùng rìa tổn thương, ngày thứ sau bỏng 109 Hình 3.20 Tổn thương bỏng ngày thứ sau bỏng thỏ đắp tế bào gốc màng ối 110 Hình 3.21 Tổn thương bỏng ngày thứ sau bỏng thỏ đắp silverin 111 Hình 3.22 Tổn thương bỏng ngày thứ sau bỏng thỏ đắp nước muối sinh lý 111 Hình 3.23 Vết bỏng ngày thứ 10 sau gây bỏng 113 Hình 3.24 Vết bỏng ghép TBG quan sát ngày thứ 24 sau gây bỏng 113 Hình 3.25 Vết bỏng điều trị silverin quan sát ngày thứ 24 sau gây bỏng 114 Hình 3.26 Vết bỏng rửa NMSL quan sát ngày thứ 24 sau gây bỏng 115 Hình 3.27 Vết bỏng điều trị ghép tế bào gốc quan sát ngày thứ 28 sau bỏng 116 Hình 3.28 Vết bỏng điều trị Silverin quan sát ngày thứ 28 sau bỏng 117 Hình 3.29 Vết bỏng rửa NMSL quan sát ngày thứ 28 sau bỏng 118 Hình 3.30 Tốc độ thu hẹp diện tích vết bỏng ngày thứ 28 sau bỏng 119 Hình 3.31 Tổn thương vi thể vết bỏng vùng rìa tổn thương, ngày thứ sau bỏng 122 Hình 3.32 Tổn thương vi thể vết bỏng vùng rìa tổn thương, ngày thứ sau bỏng 124 Hình 3.33 Hình ảnh mơ học chỗ tổn thương bỏng ngày thứ 14 sau bỏng 127 Hình 3.34 Hình ảnh mơ học mơ gan mô thận 130 10 KẾT LUẬN Từ kết thu chúng tơi có số kết luận sau: Xây dựng thành cơng quy trình cơng nghệ phân lập, nhận biết, ni cấy bảo quản dài ngày tế bào gốc từ màng ối người – Phân lập tế bào gốc màng ối: Sử dụng enzym phân cắt mô trypsin 0.25% collagenase B 0,1% phối hợp với máy lắc dao động 20 lần/phút Ly tâm 1200 vòng/phút với percoll 40,8% 58,5% thời gian 30 phút Tế bào gốc phân lớp thứ từ đáy ống nghiệm – Nhận biết tế bào gốc màng ối marker tế bào gốc phôi: OCT-4, SSEA-4, SCF, NCAM – Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc màng ối: Nuôi cấy mơi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s medium) có bổ sung thêm penicillin (50 U/ml), streptomycin (50 µg/ml), L-glutamin (2 x 10-3M), huyết bào thai bê (10%), hai ngày thay môi trường lần đồng thời cấy chuyển tế bào tuần lần để trì phịng thí nghiệm – Bảo quản tế bào gốc màng ối môi trường DMEM, 10% huyết bào thai bê, 10% DMSO nhiệt độ - 196oC Thành công bước đầu việc nghiên cứu lựa chọn mơi trường, điều kiện để: – Ni cấy biệt hóa tế bào gốc thành tế bào giống tế bào biểu bì: Mơi trường DMEM có bổ sung thêm penicillin (50 U/ml), streptomycin (50 µg/ml), L-glutamin (2 x 10-3M), huyết bào thai bê (10%), µg/ml insulin, µM hydrocortison, 0,5 nM BMP-4 50 µg/ml vitamin C – Ni cấy biệt hóa tế bào gốc thành tế bào giống tế bào beta tụy đảo: Mơi trường DMEM có bổ sung thêm penicillin (50 U/ml), streptomycin (50 µg/ml), L-glutamin (2 x 10-3M), huyết bào thai bê (10%), 10mM nicotinamide, 55 àM ò- mercaptoethanol, 1mM sodium pyruvate Xõy dựng quy trình kỹ thuật chế tạo số chế phẩm sinh học từ màng ối người bao gồm tế bào gốc màng ối đông lạnh tế bào gốc màng ối – Xây dựng quy trình bảo quản đông lạnh kiểm tra phục hồi nuôi cấy thành công 30 mẫu tế bào gốc màng ối phục vụ cho nghiên cứu chế tạo tế bào gốc màng ối – Xây dựng thành cơng quy trình chế tạo tế bào gốc màng ối: Tấm tế bào gốc màng ối người kết hợp màng ối người đông khô chiếu xạ, đảm bảo vô trùng tế bào gốc màng ối người phân lập, định danh, nuôi cấy tăng sinh, định danh lại bảo quản DMSO 10%, mật độ tế bào trước chuyển lên màng ối người đông khô 107 tế bào/ml/10cm2 Nghiên cứu ứng dụng thành công đánh giá hiệu tế bào gốc màng ối điều trị bỏng da nhiệt động vật thực nghiệm – Tấm tế bào gốc màng ối có tác dụng che phủ vết thương bỏng tốt, có khả bám vết thương, hút thấm dịch làm khơ vết bỏng hạn chế nhiễm khuẩn, góp phần thúc đẩy trình liền vết thương bỏng thu hẹp nhanh diện bỏng, giảm phù viêm, nhanh liền vết thương lành sẹo – Kết thúc thử nghiệm sau 34 ngày che phủ chỗ vết thương bỏng tế bào gốc màng ối khơng thấy có tác dụng gây phản ứng đặc biệt có hại chỗ tồn thân Xây dựng thành cơng tiêu chuẩn sở để đánh giá sản phẩm sinh học tế bào gốc màng ối – Tiêu chuẩn chất lượng áp dụng cho tế bào gốc màng ối Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân - Học viện Quân y nghiên cứu sản xuất Sản phẩm khác đề tài • Các qui trình cơng nghệ, bảng số liệu, báo cáo • Các báo đăng tạp chí nước: Phạm Hồng Thái, Đỗ Minh Trung, Nguyễn Duy Bắc, Nguyễn Lĩnh Toàn, Trần Hải Anh, Phạm Văn Trân (2010) Ni cấy, biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào gan Tạp chí Sinh ly học Việt Nam Số 14(4), tr 61-66 Lê Thanh Hà, Trần Hải Anh, Đỗ Minh Trung, Nguyễn Duy Bắc, Trần Ngọc Tuấn, Toshio Nikaido, Phạm Văn Trân (2011) Nghiên cứu qui trình sản xuất tế bào gốc màng ối người đông khơ Tạp chí Sinh ly học Việt Nam Số 15(1), tr 3135 Phạm Văn Trân, Đỗ Minh Trung, Lê Thanh Hà, Trần Hải Anh, Phạm Minh Đàm, Toshio Nikaido (2011) Ni cấy biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào tụy Tạp chí Y Dược học Quân Số 36(5) Tr 149-154 Phạm Văn Trân, Đỗ Minh Trung,Nguyễn Duy Bắc, Trần Hải Anh, Toshio Nikaido (2011) Phân lập ni cấy biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào gan tế bào beta Tạp chí Y học Việt Nam Số 384(2), tr 38-43 Đỗ Minh Trung, Phạm Văn Trân, Nguyễn Bảo Trân, Trần Hải Anh, Toshiko Yoshida, Toshio Nikaido (2012) Nghiên cứu phân lập, nuôi cấy nhận biết tế bào gốc từ màng ối người Tạp chí Sinh ly học Việt Nam Số 16(1), tr 36-41 Phạm Văn Trân, Đỗ Minh Trung, Nguyễn Bảo Trân, Dương Thị Tuyết, Nguyễn Văn Hóa, Trần Ngọc Tuấn (2012) Phân lập tế bào gốc từ màng ối người: Tác dụng số enzym phân cắt mô biểu dấu ấn Oct-4 tế bào gốc màng ối Tạp chí Y Dược học Quân Số 37(3), tr 58-62 Đỗ Minh Trung, Trần Hải Anh, Nguyễn Bảo Trân, Toshio Nikaido, Phạm Văn Trân (2012) Nghiên cứu chế tạo xác định biểu số dấu ấn tế bào gốc màng ối người đơng khơ Tạp chí Y Dược học Quân Số 37(7) tr 29-34 Phạm Văn Trân, Đỗ Minh Trung (2012) Biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào da keratin Tạp chí Y học Việt Nam Số 394(2) tr 72-76 Báo cáo hội nghị: - Tham gia báo cáo Hội nghị Khoa học Đại hội Hóa sinh Y học Việt Nam lần thứ VI, từ 19-20/8/2011 Đồ Sơn, Hải Phòng - Tham gia báo cáo Hội nghị quốc tế Mekong – Sante tổ chức Hà nội Tháng năm 2012 - Tham gia báo cáo Hội nghị Khoa học lần thứ VIII Hội Hóa sinh Y Dược Hà Nội Các tỉnh phía bắc, từ 2425/8/2012 Cửa Lò, Nghệ An Kết đào tạo sau đại học • Đào tạo nghiên cứu sinh : - 02 Nghiên cứu sinh: Nguyễn Bảo Trân, Dương Thị Tuyết thực • Đào tạo cao học: - 01 Học viên cao học Phạm Hồng Thái bảo vệ thành công luận văn Thạc sỹ năm 2010 - 01 Học viên cao học hoàn thiện luận văn dự kiến bảo vệ quí III/2012 Đào tạo Đại học • Hướng dẫn 02 Sinh viên Đại học làm Khóa luận tốt nghiệp • Hướng dẫn 01 nhóm sinh viên nghiên cứu khoa học, đạt giải giải thưởng Sinh viên NCKH Học viện Quân y năm 2011 KẾT QUẢ HỢP TÁC QUỐC TẾ Đề tài hoàn thành với giúp đỡ hợp tác tích cực Trường Đại học Toyama – Nhật Bản CÁC NỘI DUNG HỢP TÁC CHÍNH VỚI ĐỐI TÁC • Xây dựng phịng thí nghiệm ni cấy tế bào – Tư vấn, dự trù trang thiết bị đặc chủng cho phịng thí nghiệm ni cấy tế bào; – Trao đổi khoa học – Cử chuyên gia giúp đỡ • Phương pháp kỹ phân lập, ni cấy biệt hóa tế bào gốc màng ối – Đối tác giúp đỡ đào tạo cán nghiên cứu tế bào gốc – Cử cán sang học tập kỹ thuật làm biệt hóa xác định tế bào gốc từ màng ối thành tế bào biểu mô da tế bào tụy đảo – Chuyển giao quy trình kỹ thuật, phương pháp phân lập, ni cấy định danh tế bào gốc từ màng ối người – Chuyển giao quy trình kỹ thuật biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào biểu mô da tế bào tụy đảo – Cử chuyên gia hướng dẫn • Phương pháp kỹ thuật tạo tế bào gốc màng ối – Chuyển giao quy trình kỹ thuật, phương pháp lựa chọn giá đỡ tế bào, chuyển tế bào gốc giá đỡ quy trình bảo quản tế bào gốc màng ối – Cử chuyên gia hướng dẫn KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC • 03 Cán Học viện Quân y học tập nhận chuyển giao kỹ thuật tế bào gốc Nhật năm 2010 2011 (đã cấp giấy chứng nhận Trường Đại học Toyama Nhật Bản) TS Phạm Văn Trân ThS Đỗ Minh Trung ThS Lê Thanh Hà • Đào tạo cán có kiến thức trình độ lĩnh vực nghiên cứu phân lập, biệt hóa tế bào gốc, kỹ thuật tạo tế bào gốc màng ối: – Trong trình học tập nhận chuyển giao cán Học viện Quân y học, hướng dẫn, chia sẻ kinh nghiệm đối tác kỹ thuật đại, kỹ thuật mạnh đối tác nghiên cứu tế bào gốc, kỹ thuật phân lập, ni cấy tế bào, biệt hóa tế bào, kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, kỹ thuật hóa mơ miễn dịch, kỹ thuật tạo tế bào gốc màng ối người – Được hỗ trợ nguyên vật liệu kháng thể dùng nghiên cứu định danh tế bào, xác định phân tích cấu trúc màng ối tế bào gốc màng ối Ngoài sản phẩm đề tài giáo sư, chuyên gia đối tác góp ý, chia sẻ thơng tin kiểm tra đánh giá • Trao đổi kinh nghiệm, thiết kế nghiên cứu, hướng dẫn kỹ thuật, xây dựng tiêu nghiên cứu tế bào gốc, khả biệt hóa ứng dụng y học tái tạo