Nghiên cứu quy trình sản xuất ampelop từ chè dây ampelopsis cantoniensis planch vitaceae để điều trị viêm loét dạ dày hành tá tràng và tiếp tục đánh giá tác dụng lâm sàng của thuốc

BAO CAO TONG KET DE TALNGHIEN CUU KHOA HOC Cấp quản lý : BỘ Y TẾ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT THUỐC AMPELOP TỪ CHE, DAY (Ampelopsis cantoniensis Planch Vitaceae) DE DIEU TRI LOET DA DAY HANH TA TRANG VÀ TIẾP TỤC ĐÁNH GIÁ - TÁC DỤNG LÂM SÀNG CỦA THUỐC — {1998 - 2000) Chủ nhiệm để tài : G5 TS PHAM THANH KỲ Cơ quan chủ trì: TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI Năm 2001 15.61 a HAI 3] 9/04, :GS 1S PHAM THANH : GS TS Pham Thanh Kỳ TS Nguyễn Thị Lai ‘Ths, Nguyễn Huy Văn DS, Bao Dinh Khoa DS CKI, Nguyễn Thị Lam Ths Nguyễn Ngọc Chiến DS Nguyễn Quốc Huy Ths Nguyễn Kim Trung, BS Phan Quốc Hoàn GS TS Nguyén Khánh Trạch BS Mai Minh Huệ BS Nguyễn Trường Sơn "Tổng kinh phí duyệt : "Tổng kinh phí cấp : 134 tr KỲ I ĐẶT VẤN ĐỀ Loét da day hành tá tràng bệnh nhiều nước tỉ lệ mắc bệnh khoảng 10% dân số, [2, 5, 8, 9] Bên cạnh dùng thuốc có nguồn gốc thuốc, thuốc sắn có nước để hành tá tràng nhiều nhà khoa học tâm phố biến cộng đồng, Việt Nam khoảng - 7% hoá dược việc nghiên cứu điều trị bệnh loét dày sản xuất dược phẩm quan Chè thuốc chưa gh¡ vào đanh mục “Những thuốc vị thuốc Việt Nam" GS TS Đỗ Tất Lợi [4| Nhân đân địa phương miên núi có chè dây mọc hoang Cao Bằng Lào Cai, Hà Giang thường nấu nước uống nước chè Bệnh viện Y học dân tộc tỉnh Cao Bing bệnh viện Y học dân tộc quân đội dùng chè dây đế sắc hay hãm uống chữa đau đạ dày Chúng tiến hành nghiên cứu chè dây mặt thực vật, thành phần hố học, độc tính, số tác dung sinh học đưa chế phẩm AMPEI.OP điển trị loét dày - hành tá tràng giải doan | (R) nghiệm thu Để có chế phẩm đưa phục vụ rộng rãi cộng đồng, tiến hành nghiên cứu giai đoạn (RD) với tên đề tài : "Nghiên cứu quy tình sản xuất thuốc AMPELOP từ chè dày (Ampelopsis cantoniensis Planch - Vitaceae) để điển trị loét đầy - hành tá tràng tiếp tục đánh giá tác dụng lâm sàng thuốc." có n số KHYĐ- 02 - 17 1- MỤC TIÊU CUA DE TAI Theo đề cương đăng ký thực mục tiêu : 1- Nghiên cứu sản xuất thuốc AMPELOP từ chè dây 2- Tiếp tục đánh giá tác dụng lâm sàng chế phẩm 3- Hoàn thiện hồ sơ khoa học chế phẩm AMPELOP để xin phép Bộ Y tế cấp số đăng ký lưu bành Ngồi chúng tơi thử thêm tác dụng diệt vi khuẩn Helicobacter pylori thuốc AMPELOP môi trường nuôi cấy 1II- NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VẢ PHƯƠNG PHAP NGHIEN CUU 3.1- Thử tác dụng diệt xoắn khuẩn Helicobacter pylori (HP) -31.1- Chế phẩm thử: Bột AMPELOP chiết từ chè (ký hiệu KA) pha thành dung dịch 1% (10mg/1ml) 3.1.2- Môi trường trang thiết bị nuôi cấy - Môi trường canh thang Trytone Soya broth đùng để bảo quần vận chuyển mảnh sinh thiết Công thức : Pancreatic Digest of Casein Papaic Digest Sodium chloride Dibasic Potassium phosphate Dextrose i Nước cất vừa đủ 1000ml Cân 30g môi trường bột Trytone Soya broth hoà tan nước cất cho đủ 1000ml, điều chỉnh pH = 7,3 + 0,2, chia thành ống nhỏ hấp tiệt trùng & 121°C l5ph - Môi trường thạch máu (Helicobacler Agar Stacker plates) đo hãng BBL* Becton Dickenson (Germany) sản xuất - Trang thiết bị, dựng cụ : Tủ ấm C0, 37°C "Túi tạo khí Campy-Pak hãng BBL", Mắy li tâm 3000 vòng/phút Micropipet loại 20,11 Kính hiển vi CD 50 OLYMPUS (Nhật) Đĩa petri đường kính 9em Bình Jaz cấy ky khí Các khoanh giấy tẩm sẵn kháng sinh chuẩn Amoxicilline (30g) hãng BBLẺ cịn hạn sử dụng Các khoanh giấy đường kính 7mm tiệt trùng để chế phẩm thử Kũt Pyloritek Test SERIM (USA) để chẩn đoán men urease hoạt động Helicobactcr pylori mảnh sinh thiết người mắc bệnh viêm loét đạ dày - tá trầng (DDTT) 3⁄1.3- Vý khuẩn thử: - Vi khudn Helicobacter pylori (HP) duge phan lap tir mau bệnh phẩm sinh thiết nội soi bệnh nhân mắc bệnh viêm loét DDTT hoạt động phịng r Í soi ni cấy khoa Vì sinh vật, bệnh viện Trung ương quản dọi 108 - Tiêu chuẩn mẫu sinh thiết : Mẫu phải lấy từ hang vị đầy bệnh nhân khơng phán liệt giới, lứa ruổi, có viêm lt DDTT hoạt động, khơng dùng kháng sinh vịng tháng viêm loét đùng chất none - sieroid, thử clortcst cho dương tính, đồng thời ghí rõ họ tên, tuổi cla bệnh nhân lấy mẫu Bảo quản ống nghiệm có mơi trường canh thang Trylone Soya broth phải ni cấy vịng 120 phút sau lấy 4- Phương pháp nghiên cứu› œ- Thữ sơ nãng ue chế FỊP chế phẩm phương pháp ức chế rực tiếp: Mẫu sinh khiết nghiền nát môi trường canh thang Trytone Soya broth, lấy mơi trường có vi khuẩn HP cấy ria lên môi trường Helicobacter Agar Lấy 0,5ml dung dịch chế phẩm thứ láng dễu lên mặt đĩa môi trường cấy HP, nuôi cấy 37°C tủ ấm có túi Campy - Pak 10% khí CŨ; Song song làm đĩa mẫu đối chứng chất thử Đánh giá kết sau ngày ni cấy, so sánh với mẫu đối chứng (thí nghiệm làm lặp laủ lần) b- Xác định nổng độ có khả úc chế vi khuẩn FÍP chế phẩm thứ Làm kháng sinh đồ theo phương pháp khuếch tán môi trường (phương pháp Kirby - Bauer) : dùng micropipet hút lượng dung dich chứa chất định thử có nồng độ định trước nhỏ lên khoanh giấy có đường kính 7mm tiệt trùng Dung dich Ampelop có hàm lượng : 200, 150, 100, 75, 50ng Các đĩa môi trường láng déu vi khuản HP phân lập với nỗng độ xấp xï IO* vị khuẩn/ Iml Sau đặt khoanh giấy chất thử nuôi cấy 37°C tủ ấm có 10% khí CW wong ni Campy - Pak Đọc kết sau ngày kể từ khí ni cấy Dùng khoanh giấy tắm kháng sinh chudn Amoxicillin 30g lam đối chứng Tất cá thí nghiệm làm lại lần Quy định đường kính vịng ức chế hãng BBLF với mẫu chuấn dối chitng Amoxicillin (Amo C-30) 30ug sau : - Đường kính $ > 18mm : nhạy cắm (S) - Đường kính ÿ = 14 - 17mm : trung gian (D) - Đường kính ÿ < L3mm : để kháng (R) 3.2- Nghiên cứu sẵn xuất thuốc AMPELOP từ chè dây 3.2 1- Nguyên liệu : Chè dây mua Cao đạt tiêu chuẩn sở (TCCS) -.22- Máy mốc, thiết bị ; - Bình ngấm kiệt ~ Nồi cất thu hồi dung môi - May hút chân không - Phếu lọc - Rây cỡ ~ May trộn - May nghién ERWEKA ~ Máy sát hạt - Máy đóng nang thủ cơng máy đóng nang tự động - Tủ sấy gió nồng - Thùng pha chế Inox 3.2.3- Phuong pháp nghiên cứu : - Chiết xuất hoạt chất chè dây phương pháp ngấm kiệt với cồn 70% - Định tính phản ứng hoá học sắc ký lớp mong dũng mỏng Silicapel GF›„, tráng sắn hãng MERCK, hệ dung môi khai triển : Toluen - Ethylacetat - acid formic [5: 6:1] ~ Định lượng [avonoid toàn phần phương pháp cân - Xác định độ ẩm theo phương pháp DĐVN II Thử dọ đồng đéu khỏi lượng theo DðVNIL - Thử độ heo DĐVNII (Thuốc nang) - Thử độ nhiễm khuẩn theo DĐVNI - Kiểm nghiệm nguyên liệu đóng nang : Bột AMPELOP viên nang AMPELOP theo tiêu chuẩn sở 3.3- Thứ tác dụng thuốc AMPELOP lâm sàng ‹33.1- Mục dích nghiên cứu : ~ Đánh giá tác dụng thuốc AMPELOP làm giảm triệu chứng lâm sàng loét đạ day 14 trang - Đánh giá tác dụng AMPELOP làm lành vết loét dày hành tá Tràng - Nghiên cứu tác đụng phụ thuốc AMPELOP điều trị loét dầy tá tràng 1.3.2- Đóï tượng nghiên cửu: - > 60 bệnh nhân tuổi từ 19 đến 70 tuổi Nội soi có loét dụ đầy loét hành tá tràng, loéi hai học - Xét nghiệm tìm H, pylori dương tính test urease mỏ bệnh Loại bỏ qgiiêp cứu : bệnh nhân bó dỡ thuốc hoạc uống thuốc khơng đủ theo quy định -3.3.1- Phương pháp nghiên cứu - - Bệnh nhân chọn vào nghiên cứu làm bệnh án theo mẫu nghiên cứu, thco đối diễn biến triệu chứng trước sau điều trị theo mức độ ~ Loét dày tá tràng chẩn đoán đánh giá qua nội soi trước sau điều trị theo : vị trí, số lượng ổ loét, kích thước tính chất loét - Xác định nhiễm H Pylori bang mẫu sinh thiết li\ từ vùng hang vị xác định phương pháp + Test urease (sử dụng dung địch uc - indol Viên vệ sinh dịch tẻ phá chế) + Dượng tính (+) : H.P chuyển màu san 2h + Dương tính (++) : Mức độ vừa, chuyển màu vòng 15ph 2h 15ph © Dương tính (+++) : Mức độ nặng, chuyển mâu vịng + Mơ bệnh học : Mức độ nhiễm H Pylori tiêu nhuộm Giemsa đánh giá theo số lượng vi khuẩn vỉ trường, IY- KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU 4.1- THU TAC DUNG DIET KHUAN HELICOBACTER PYLORI (HP) Từ năm ¡983 đến nhà khoa học xác định có mặt xoắn khuẩn Helicobacter pylori bệnh viêm loét dày tá tràng (DDTT), có nhiều nghiên cứu chứng minh HP có vai trị chủ yếu chế gày bệnh loét DDTT Vì cần chứng minh xem ché phim AMPELOP sản xuất từ chè có tác dung điệt khuẩn HP hay không Trong giai đoạn nghiên cứu trước chúng tơi chưa có ¡ kiện thử tác dụng này, Gần khoa Vị sinh vật - Bệnh viện TW Quân đội 108 triển khai kĩ thuật ni cấy HP đo chúng tơi làm bổ xung thêm phần thử tác dụng điệt HP cúa chế phẩm AMPELOP (Ký hiệu KA) 41.1- Thử sơ khả tức chế HP chế phẩm Tiến hành theo mực 3.1.4.a- Đánh giá kết sau ngày nuôi cấy so sánh với mẫu đối chứng khơng có chế phẩm AMI'ELOP, kết dược trình bay bảng | hình Bảng AMPELOP i I : Kết thử sơ khả ức chế HP chế phẩm (KA) Mẫu thử Luong chit thir [Ampelop(KA) TT tes chứng (Doi L Ghi chú: Smg” ee ee i Omg (+++): ức chếhồn tồn C-) : khơng ức chế L Ỉ | | Dung dich KA “Thử nghiệm tắc dựng đc chế lrết ví khuển coaster poe Hình ¡ : Tác dụng ức chế vi khuẩn EIP AMPELOP 4.12- Kếi thử xác định hầm lượng chế phẩm KA có dc chế ví khuẩn !FIP theo phương phần khuếch tần môi irvéng (Phuong phip Kirby - Bauer) “Tiến hành theo mục 3.1.4-b, Kết ghí bảng hình Bảng : Kết đường kính vịng vơ khuẩn chế phẩm thir (mm) 3` | 75 T 37] ! 150 [ T00 ” | 230 | 74 1201 94 ° |Ị | 25,5 | 2N poe Pt Hàm lượng (nạ) | KA [Amon 200 Gee we Hi” Si VẢ Đá tốt Ue ay ees a "` 10