Chuyển gen bar kháng thuốc trừ cỏ và gen gna kháng côn trùng vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn agrobacterium

BÁO CÁO NGHIỆM THU Tên đề tài: Chuyển gen bar (kháng thuốc trừ cỏ) gen gna (kháng côn trùng) vào thuốc thông qua vi khuẩn Agrobacterium Chủ nhiệm đề tài: Phạm Thị Hạnh Cơ quan chủ trì: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ Thời gian thực đề tài: 18 tháng Kinh phí duyệt: 50.000.000 đ Kinh phí cấp: 45.000.000 đ theo TB số : TB-SKHCN ngày 13 /12 /05 Thực đề tài có hổ trợ hố chất, vật tư thiết bị Phịng Cơng nghệ gen (Viện Sinh học Nhiệt đới) Phịng Thí nghiệm Trọng điểm phía Nam Cơng nghệ Tế bào thực vật Mục tiêu: Với đề tài này, muốn bước sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử tái tổ hợp ADN để tạo vector plasmid mang gen kháng côn trùng biến nạp gen vào để tạo dòng thuốc mang gen kháng rầy rệp chích hút Nội dung: (Theo đề cương duyệt hợp đồng ký) Công việc dự kiến Công việc thực - Sử dụng kỹ thuật sinh - Đã thành công việc tái cấu trúc học phân tử cắt, lắp ghép plasmid mang gen bar , gusA gen enzyme giới hạn gna tạo vector (plasmid) - Tạo 10 dòng thuốc kháng mang gen gna thích hợp cho thuốc trừ cỏ côn trùng phương việc chuyển gen vào trồng pháp gián tiếp thông qua vi khuẩn - Tạo thuốc kháng Agrobacterium tumefaciens chứa plasmid thuốc trừ cỏ côn trùng mang gen bar , gusA gna phương pháp gián tiếp thông - Đã kiểm tra diện gen gus qua vi khuẩn Agrobacterium phản ứng mơ hóa Kiểm tra hiên tumefaciens diện gen bar gen gna phản - Phân tích đánh giá ứng PCR với mồi chuyệt biệt Kiểm tra thuốc mang gen kháng thuốc biểu gen kháng thuốc trừ cỏ trừ cỏ kháng côn trùng gna phương pháp nuôi cấy thuốc chuyển gen môi trường chứa chất chọn lọc phun thuốc trừ cỏ Basta vườn ươm Sản phẩm nghiên cứu STT Tên sản phẩm Sản phẩm thực - Tối thiểu 10 dòng thuốc - Đã tạo 11 dòng thuốc lá chuyển gen chuyển gen - Một báo đăng Tạp - Đã gửi đăng báo Hội nghị chí nước Hội nghị Nghiên cứu khoa học khoa học công nghệ sinh học sống ngày 10/ 8/2007(đang in toàn quốc xuất vào tháng 12/2007) MỤC LỤC Trang PHẦN MỞ ĐẦU Tên đề tài Chủ nhiệm đề tài: Cơ quan chủ trì: Thời gian thực hiện: Kinh phí duyệt: Kinh phí cấp: theo TB số: TB-SKHCN ngày / Mục tiêu Nội dung Sản phẩm đề tài Mục lục Danh sách chữ viết tắt Danh sách bảng Danh sách hình Bảng tốn CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 1.1 1.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước Tính cần thiết đề tài CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 10 14 15 2.1 VẬT LIỆU 15 2.1.1 Chủng vi khuẩn 15 2.1.2 Plasmid 15 2.1.3 Enzyme cắt nối tạo DNA tái tổ hợp 16 2.1.4 Thang chuẩn 16 2.1.5 Ngun liệu thực vật 17 2.1.6 Hố chất mơi trường 17 2.1.7 Một số thiết bị, dụng cụ dùng nghiên cứu 17 2.2 PHƯƠNG PHÁP 19 2.2.1 Cấu trúc plasmid 19 2.2.1.1 Chuẩn bị DNA plasmid (pCAMBIA3301) DNA gen 19 mục tiêu (gna) cho cấu trúc vector tái tổ hợp 2.2.1.2 Phương pháp nối kết plasmid gốc pCAMBIA3301 21 cassette gen gna để tạo plasmid tái tổ hợp 2.2.2 Biến nạp vào vi khuẩn E coli khảo sát diện 22 plasmid 2.2.2.1 Phương pháp tạo E coli có khả biến nạp 22 2.2.2.2 Phương pháp biến nạp plasmid vào vi khuẩn E coli 23 2.2.2.3 Chọn khuẩn lạc kiểm tra plasmid 23 2.2.3 Biến nạp plasmid vào Agrobacterium tumefaciens 24 chuẩn bị cho thao tác chuyển gen 2.2.3.1 Quy trình tạo vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens khả biến 24 2.2.3.2 Quy trình chuyển plasmid vào vi khuẩn Agrobacterium 25 tumefaciens khả biến 2.2.3.3 Sơ chọn khuẩn lạc để kiểm tra plasmid 25 2.2.3.4 Phân tích PCR để xác định diện gen gna 25 plasmid 2.2.4 Phương pháp chuyển gen vào thuốc (Nicotiana 26 tabacum L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 2.2.4.1 Xác định nồng độ chọn lọc tối ưu chuẩn bị cho thí 27 nghiệm chuyển gen 2.2.4.2 Chuyển gen vào thuốc nhờ vi khuẩn Agrobacterium 27 tumefaciens 2.2.5 Khảo sát diện biểu gen 29 chuyển thuốc chuyển gen 2.2.5.1 Khảo sát diện gen thị gusA kỹ 29 thuật hóa mơ 2.2.5.2 Tái kiểm tra (in vitro) biểu gen chọn lọc bar 29 2.2.5.3 Thử tính kháng thuốc trừ cỏ Basta chuyển gen 29 vườn ươm 2.2.5.4 Kiểm tra diện gen bar gna phân 29 tích PCR CHƯƠNG III: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 CẤU TRÚC PLASMID MỚI 32 3.1.1 Tách chiết DNA plasmid từ hai dòng vi khuẩn E coli 32 DH5 mang pBluescript SK+ pCAMBIA3301 Kiểm tra enzyme cắt giới hạn điện di gel agarose 3.1.2 Kết nối tạo plasmid tái tổ hợp tạo dòng E coli mang 33 plasmid 3.1.2.1 Kết nối tạo plasmid 33 3.1.2.2 Biến nạp nhân plasmid E coli 34 3.1.3 Tách chiết plasmid từ E coli biến nạp kiểm 34 tra diện gen gna plasmid 3.2 TẠO DÒNG AGROBACTERIUM TUMEFACIENS 36 MANG PLASMID MỚI pCAMBIA3301GNA 3.2.1 Biến nạp pCAMBIA3301GNA vào A tumefaciens 36 LBA4404 3.2.2 Phân tích PCR gen gna plasmid tách chiết từ dòng 37 A tumefaciens LBA4404 biến nạp 3.3 NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC 37 TRỪ CỎ VÀ CÔN TRÙNG VÀO CÂY THUỐC LÁ 3.3.1 Khảo sát tính chống chịu tự nhiên Phosphinothricin đối 38 với giống thuốc K326 3.3.2 Kết chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens 39 LBA4404 3.3.3 Kiểm tra diện biểu gen 41 chuyển thuốc giả định chuyển gen 3.3.3.1 Kiểm tra biểu gen bar (gen kháng thuốc trừ cỏ 42 Basta) chuyển gen in vitro vườn ươm 3.3.3.2 Sự biểu gen thị gusA chuyển gen 43 3.3.3.3 Sự diện của gen bar gna thuốc 44 chuyển gen phân tích PCR CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 PHỤ LỤC 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT ATP : Adenosine 5’- triphosphate bar : gen kháng Phosphinothricin Bp : Base pair, cặp base Bt : Bacillus thuringiensis CAMBIA :Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture CAMV : Cauliflower Mosaic Virus CG : Chuyển gen Cry : Crystal (gen) dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate DNA : Deoxyribonucleic acid ĐC : Đối chứng EDTA : Ethylenediamine tetraacetic acid EtBr : Ethidium bromide GNA : Galanthus Nivalis Agglutinin gusA : Gen tạo enzyme -D-glucuronidase GUS : -D-glucuronidase (enzyme) hph : Hygromycin phosphotransferase (gen) HPH : Hygromycin phosphotransferase (enzyme) IPTG : Isopropyl thio--D-galactoside KB : Kilobase KDa : Kilodalton LB : Luria-Bertani MS : Murashige Skoog nptII : Neomycin phosphotransferase (gen) NPT II : Neomycin phosphotransferase (enzyme) PAT : enzym phosphinothricin acetyl transferase PPT : Phosphinothricin RE : Restriction enzyme RNA : Ribonucleic acid Rnase : Enzyme thủy giải RNA SDS : Sodium dodecyl sulphate PCR : Polymerase chain reaction Taq : Thermus aquaticus T-DNA : Transferred - DNA Ubi : Ubiquitin (gen) X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside X-gluc : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronide DANH SÁCH BẢNG TÊN BẢNG SỐ LIỆU SỐ TRANG Kích thước Thang -Hind III 15 Kích thước Thang 1Kb 15 Tỷ lệ tái sinh chồi (cây con) từ mẫu môi 40 trường chọn lọc Phosphinothricin DANH SÁCH HÌNH TÊN HÌNH ẢNH SỐ TRANG Sơ đồ1: Cấu trúc plasmid pCAMBIA3301 46 Sơ đồ 2: Trình tự nhận biết vị trí cắt hai enzyme 46 giới hạn Sac I Kpn I Sơ đồ 3: tạo dòng gen mục tiêu gna vào pCAMBIA3301 47 Sơ đồ 4: Quy trình tạo thuốc chuyển gen kháng 48 thuốc trừ cỏ trùng Hình điện di chọn lọc thuốc chuyển gen 48 Hình biểu gen gus kết PCR 49 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước Sự phát triển cơng nghệ gen tạo bước đột phá mới, đặc biệt lĩnh vực công nghệ sinh học Công nghệ gen cho phép đưa gen hữu dụng vào thực vật, từ tạo trồng thể tính trạng mong muốn Cách khoảng ba thập kỷ, kể từ báo cáo công bố thành công việc chuyển gen trồng, phương pháp đưa gen lạ trực tiếp vào tế bào thực vật khơng thơng qua lai hữu tính phát triển dần với tốc độ tiến ngày nhanh Thuốc lá, với cà chua khoai tây trồng sử dụng để chuyển gen Bt từ năm 1987 Trong đối tượng đó, thuốc nguyên liệu tốt cho nghiên cứu di truyền người ta dễ dàng kiểm sốt thụ phấn thu số lượng lớn hạt giống Bên cạnh đó, thuốc thích hợp cho ni cấy mơ chuyển gen nhờ khả hẳn việc tái sinh chồi phân hóa thành hồn chỉnh từ mơ sẹo, tế bào huyền phù tế bào trần Cây trồng mang gen kháng sâu Bt (Bacillus thuringiensis) ứng dụng công nghệ sinh học việc cải tiến trồng từ sớm Cây mang gen tạo độc tố có khả kháng với sâu hại thuộc họ Lepidoptera, Coleoptera Diptera Nhiều phịng thí nghiệm Việt Nam giới chuyển nạp thành công gen vào thuốc như: - Nguyễn Hữu Hổ & ctv (1998): chuyển gen kháng sâu CryIIB, gen kháng hygromycin hpt, gen thị gusA nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens - Strizkov (1996): chuyển gen CryIC vào thuốc qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium, với gen chitinase chiAII (có nguồn gốc từ Serratia marcescens) nhằm nâng cao hiệu độc tố Bt chitinase có 10 khả phá hủy màng chitin ruột côn trùng Kết gây chết 100% sâu Spodoptera exigua giai đoạn phát triển khác - Kota & ctv (1999): nhận thấy gen Cry2Aa2 chuyển vào lục lạp thuốc gây tử vong hồn tồn cho sâu Heliothis virescens, Heliothis zea, Spodoptera exigua vốn xác định khơng cịn mẫn cảm với Cry1A Cry2Aa2 Lá chuyển gen biểu tiền độc tố Cry2Aa2 mức - 3% protein hòa tan tổng số, cao gấp 20 đến 30 lần so với chuyển gen vào nhân tế bào Nghiên cứu chuyển gen năm gần có bước phát triển đáng kể nhờ vào việc đưa số gen có ý nghĩa quan trọng lĩnh vực nông nghiệp vào trồng Đối với nhiều loại côn trùng thuộc Homoptera rầy nâu loại rầy rệp khác truyền bệnh virus cho trồng, người ta ghi nhận hợp chất lectin có nguồn gốc từ thực vật có khả gây độc chúng (Powell ctv, 1993) số ấu trùng thuôc họ Lepidoptera họ Coleoptera (Shukle Murdock, 1983; Czaph Lang, 1990; Gatehouse cộng sự, 1995) Nhiều nghiên cứu thí nghiệm giới cho thấy lectin thực vật có hiệu tượng làm giảm sức sống, phát triển, đẻ trứng rầy nâu (Powell cộng sự., 1993), giảm tuổi thọ khả sinh dục rầy mềm, đặc biệt (Rahbe Febvay 1993, Sauvion cộng sự., 1996) nhiều loại rầy rệp gây hại khác Tuy nhiên tất lectin diệt côn trùng Người ta ghi nhận có nhiều mức độ hữu hiệu khác hợp chất lectin khác lồi trùng khác Nhóm lectin với thuật ngữ chun mơn “snowdrop lectin” (Galantus nivalis agglutinin - GNA) có độc tính mạnh (Powell cộng sự, 1995a) đặc biệt có độc tính trùng khơng ảnh hưởng loài động vật hữu nhũ (Pusztal 1991) Protein GNA gen mã hóa cho 11 Các mẫu sau lây nhiễm cấy lên môi trường tái sinh, đem nuôi tối khoảng ngày Giai đoạn giúp cho vi khuẩn sau tiếp xúc có điều kiện chuyển gen vào mẫu Giai đoạn diệt khuẩn: Sau ngày nuôi chung, vi khuẩn phát triển thành lớp mỏng mơi trường Để tránh tái nhiễm q trình chọn lọc, cần tiến hành loại bỏ gần hoàn toàn vi khuẩn Sự phát triển vi khuẩn lại mẫu thực vật thường xảy gây nhủn cho mẫu Do đó, rửa mẫu thật kỹ hai lần nước cất có kháng sinh diệt khuẩn Cefotaxim Nồng độ thích hợp để diệt vi khuẩn khơng gây tái nhiễm 500mg/l Giai đoạn chọn lọc: Các mảnh sau rữa thấm khô đặt vào mơi trường tái sinh có chất chọn lọc Phosphinothricin (PPT) 10mg/l bổ sung Cefotaxim 500mg/l diệt khuẩn Cấy chuyền tuần/lần theo dõi tái hình thành chồi Các kết ghi nhận sau:  Đối với mẫu đối chứng (không xử lý vi khuẩn chuyển gen): tượng màu diệp lục xảy ảnh hưởng chất chọn lọc Phosphinothricin (PPT) 10mg/l Chúng tơi khơng nhận thấy có biểu tái sinh Cũng kết khảo sát, mẫu chết dần từ tuần  Đối với mẫu xử lý Agrobacterium tumefaciens môi trường chọn lọc - Sau tuần nuôi cấy, phần lớn bắt đầu bị màu xanh diệp lục tố Tuy nhiên số mẫu có hình thành cụm mơ sẹo nhỏ xung quanh rìa vài ngày sau - Sau 3-4 tuần hình thành chồi từ rìa xung quanh mẫu lá, vết cắt Những chồi tái sinh có màu xanh dễ nhận biết mẫu màu vàng 40 - Có tăng trưởng chiều cao số lượng chồi ngày So sánh với kết đối chứng, tạm thời kết luận chồi tái sinh môi trường chọn lọc Phosphinothricin 10mg/l chồi giả định chuyển gen Tiếp tục giai đoạn chọn lọc chồi lớn khoảng 1015mm, tách riêng dịng mơi trường MS với chất chọn lọc Phosphinothricin 20mg/l chất diệt khuẩn Cefotaxim với nồng độ khơng đổi Sự hình thành rễ xảy vịng 7-14 ngày sau Sau vài chu kỳ chọn lọc, từ tuần 6-8, đợt thí nghiệm chuyển gen chúng tơi nhận khoảng mẫu tạo chồi giả định chuyển gen Trung bình mẫu tái sinh có từ 1-4 chồi (cây con) Từ chồi này, phải tiếp tục chọn lọc dịng có khả biểu mạnh nhất, thể qua sinh trưởng rễ tốt chúng môi trường chọn lọc so với dòng lại Cây cao 3cm trồng vườn ươm để chuẩn bị cho thí nghiệm Bảng 3: Tỷ lệ tái sinh chồi (cây con) từ mẫu mơi trường chọn lọc Phosphinothricin Thí nghiệm Chuyển gen Đối chứng Số mẫu thử nghiệm 120 20 Số lượng mẫu tái sinh chồi 11 Tần số chuyển gen ( %) 9,16 Kết đạt qua đợt thí nghiệm chuyển gen, chúng tơi thu nhận 11 mẫu tái sinh chồi giả định chuyển gen với tần số 9,16% Tuy nhiên, chúng tơi chọn số dịng có khả phát triển thân tốt tạo nhiều rễ môi trường chọn lọc cho thí nghiệm 3.3.3 Kiểm tra diện biểu gen chuyển thuốc giả định chuyển gen 41 Các thí nghiệm thực nhằm khẳng định chắn dòng nhận nhận gen chuyển 3.3.3.1 Kiểm tra biểu gen chọn lọc bar (gen kháng thuốc trừ cỏ Basta) chuyển gen in vitro ngồi vườn ươm Với mục đích khẳng định cách chắn diện gen bar, kiểm tra lại khả kháng chất chọn lọc PPT giả định chuyển gen đối chứng môi trường chọn lọc Cắt giả định chuyển gen thành mẫu 1cm2 thí nghiệm chuyển gen đặt mơi trường tái sinh có chứa 10mg/l PPT Chỉ sau hai đến ba tuần, chúng tơi nhận thấy tồn mảnh đối chứng bị màu chết ngưỡng chọn lọc Ngược lại, mảnh cắt từ chuyển gen giữ màu xanh diệp lục có dấu hiệu tái sinh: cụm mô sẹo nhỏ sau chồi xuất Tương tư giả định chuyển gen đối chứng không chuyển gen đặt vào mơi trường MS có chứa 20mg/l PPT sau 2-3 tuần từ giả định chuyển gen tiếp phát triển xanh tốt đối chứng hồn tồn khơng phát triển màu xanh chết sau tuần Sự diện gen bar kiểm tra qua phân tích PCR Kết cho thấy mẫu ADN chuyển gen xuất băng ADN với kích thước khoảng 0,5kb kết việc khuếch đại gen bar (do sử dụng cặp mồi chuyên biệt gen bar) Do đó, chúng tơi khẳng định gen bar chuyển vào nhiễm sắc thể thuốc Như vậy, tính kháng chất PPT gen bar quy định khẳng định in vitro Tuy nhiên, muốn tiếp tục chứng minh biểu gen môi trường tự nhiên, sau đưa vườn ươm Chúng kiểm tra nồng độ gây chết thuốc đối chứng với thuốc trừ cỏ BASTA (AgroEvo, nồng độ 150 g/l) có dược chất glufosinate amonium (tính chất tương tư Phosphinothricin) cho thấy nồng độ g/l đủ gây chết câythuốc Sau phun dung dịch thuốc trừ cỏ BASTA nồng độ g/l 42 PPT thuốc chuyển gen Chúng nhận thấy sau 2-3 tuần: Cây đối chứng bị cháy hoàn toàn chết sau phun thuốc Basta, chuyển gen vết nhăn xuất sau thời gian không tiếp tục lan rộng tiếp tục sinh trưởng phát triển bình thường Thí nghiệm lần khẳng định nhận gen chuyển Cây chuyển gen biểu tính kháng cao với thuốc trừ cỏ BASTA môi trường vườn ươm Thực tế cho thấy, mô phát triển tốt môi trường chọn lọc với nồng độ chọn lọc cao mô chuyển gen thực qua kiểm tra phân tích sau 3.3.3.2 Sự biểu gen thị gusA Chúng đem chồi phiến giả định chuyển gen xử lý với dung dịch X-Gluc 24h Sau tẩy diệp lục tố cồn 96 %, kết cho thấy mẫu có màu xanh chàm đặc trưng Trong đó, mẫu đối chứng khơng có màu Như vậy, diện gen gusA nhiễm sắc thể chuyển gen khẳng định Kết hóa mơ GUS lần giúp kết luận thuốc chuyển gen 3.3.3.3 Sự diện của gen bar gna thuốc chuyển gen phân tích PCR Để xác định diện gen bar gna nhiễm sắc thể cây, tách chiết DNA nhiễm sắc thể chuyển gen và đối chứng để làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR Phản ứng PCR thực với cặp mồi đặc hiệu cho gen bar gna Đối chứng dương plasmid đối chứng âm DNA gen tách chiết từ nhiễm sắc thể đối chứng không chuyển gen Kết phân tích gen bar nhiễm sắc thể sau chạy điện di phản ứng PCR cho thấy dịng chuyển gen có diện có đoạn ADN khuyếch đại : 0,5 Kb 43 Kết phân tích gen gna PCR cho thấy dòng chuyển gen có diện vạch DNA mong đợi Các vạch khuyếch đại có kích thước với kích thước vạch đối chứng dương tính PC 0,47 Kb so với thang chuẩn Không thấy vạch trường hợp thuốc đối chứng (giếng ký hiệu NC) Kết chứng minh T-DNA mang gen bar gna từ plasmid vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chuyển nhập vào gen Như vậy, tạo thuốc la chuyển mang gen kháng thuốc trừ cỏ Basta gen kháng côn trùng IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Trong phạm vi giới hạn đề tài, đã: - Tái cấu trúc để tạo plasmid có mang gen bar kháng thuốc trừ cỏ Basta, gen thị gusA gen gna kháng trùng chích hút Biến nạp plasmid vào vi khuẩn Agrobacterium tumefacien - Đã sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefacien vào chuyển nạp gen tạo số dòng thuốc mang kháng thuốc trừ cỏ Basta gen kháng côn trùng - Đã kiểm tra biểu gen thị gusA phản ứng hóa mô thuốc chuyển gen Sự diện gen bar gna phân tích PCR, kiểm tra tính kháng Phosphinothricin ống nghiệm tính kháng thuốc trừ cỏ Basta vườn ươm ĐỀ NGHỊ - Chuyển gen kết hợp gna + cry để tạo thuốc chuyển gen có tính kháng cao phổ kháng rộng - Ứng dụng nghiên cứu để chuyển nạp gen vào trồng khác 44 Phụ Lục MÔI TRƯỜNG MS (Murashige Skooge, 1962) Khoáng đa lượng (mg/l) NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O FeSO4.7H2O Na2EDTA 1650 1900 440 370 27.3 37.3 Khoáng vi lượng (mg/l) H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.4H2O KI Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O 6.2 22.3 8.6 0.83 0.25 0.025 0.025 Vitamin (mg/l) Glycine B1 B6 Acid nicotinic Inositol 0.1 0.5 0.5 100 Đường sucrose (g/l) Agar (g/l) pH 30 9.5 5.8 45 MÔI TRƯỜNG AB (Chilton ctv., 1974) Dung dịch đệm AB 20X (g/l): - K2HPO4 30 - NaH2PO4 Dung dịch muối khoáng 20X (g/l): - NH4Cl 20 - MgSO4 - KCl - CaCl2.2H2O - FeSO4.7H2O 0,005 Chuẩn bị 100 ml môi trường AB: - ml dung dịch muối khoáng AB - ml dung dịch đệm AB - 0,5 g glucose - thêm nước cất đủ 100 ml MÔI TRƯỜNG LB (Luria Bertoni) - Cao nấm men 5g/l - Bactotryptone 10g/l Chỉnh pH 7,5 46 Sơ đồ1: Cấu trúc plasmid pCAMBIA3301 - Enzyme giới hạn Sac I, Kpn I 5’-G-C- G-A-G-C-T-C- T-A-3’ Sac - G-C - G-A - G-C-T- 5’-C-G- C-T-G-C-A-G- A-T-3’ - C-G - C- - C-T - A- 3’-T-G-C-A-G-A - T- Sơ đồ2: Trình tự nhận biết vị trí cắt hai enzyme giới hạn Sac I Kpn I 47 48 Nhân giống vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens môi trường AB Nhiễm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào mãnh ngày môi trường tái sinh Rửa vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bám mãnh Nuôi cấy mãnh môi trường tái sinh có bổ sung 10 mg/l chất chọn lọc PPT 500 mg/l kháng sinh diệt khuẩn Cefotaxime 4- tuần Chuyển chồi tái sinh sang môi trường MS có bổ sung 20 mg/l chất chọn lọc PPT 500 mg/l kháng sinh diệt khuẩn Cefotaxime tạo rễ tuần Chuyển thuốc chuyển gen in-vitro vườn ươm Sơ đồ 4: Quy trình tạo thuốc chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ côn trùng 49 Hình Kết điện di sản phẩm cắt cặp enzyme SacI KpnI L: Thang chuẩn Lamda HindIII; 1: Sản phẩm cắt pCAMBIA3301; 2: Sản phẩm cắt pBluescriptSK Hình Kết kiểm chứng diện gen gna plasmid L: Thang chuẩn Lamda HindIII; 1: Sản phẩm cắt pCAMBIA3301; 2: Sản phẩm cắt p3301GNA cặp enzyme Sac I Kpn I Hình Kết biến nạp plasmid vào E.coli DH5 Các khuẩn lạc màu trắng biểu âm tính môi trường X-gal, khuẩn lạc mang plasmid Hình Ảnh hưởng chất chọn lọc PPT mãnh thuốc đối chứng Hình Ảnh hưởng chất chọn lọc PPT thuốc đối chứng Hình Mãnh sau xử lý chuyển gen tái sinh chồi môi trường có chất chọn lọc PPT 50 51 Hình Mãnh thuốc chuyển gen tái sinh môi trường có chất chọn lọc PPT Hình Thuốc chuyển gen phát triển môi trường có chất chọn lọc PPT Hình Sự biểu gen gusA thuốc chuyển gen Hình 10 Kết phun thuốc trừ cỏ BASTA thuốc chuyển gen đối chứng Hình 11 Kết qủa PCR gen bar thuốc chuyển gen L: Thang chuẩn 1Kb PC: Đối chứng dương tính (plasmid) NC: Mẫu û đối chứng 1, 2, 4: Sản phẩm từ chuyển gen Hình 12: Kết qủa PCR gen gna thuốc chuyển gen L: Thang chuẩn 1Kb PC: Đối chứng dương tính (plasmid) NC: Mẫu đối chứng 1, 2, 4: Sản phẩm từ chuyển gen 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang 2000 Di truyền phân tử – Những nguyên tắc chọn giống trồng, II Nhà xuất Nông nghiệp Tp HCM 223 tr Jeffrey H Miller A short course in bacterial genetics Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992 Hilder VA, Gatehouse MR, Gatehouse JA, Van Damme E, Boulter D (1995) Expression of snowdrop lectin (GNA) in transgenic tobacco plants results in added protection against aphids Transgenic Research 4, 18-25 Kota M, Daniell H, Varma S, Garczynski SF, Gould F, Moar WJ 1999 Overexpression of the Bacillus thuringiensis (Bt) Cry2Aa(2) protein in chloroplasts confers resistance to plants against susceptible and Bt-resistance insects Proc Natl Acad Sci 96(5): 1840-1845 Kumar KK, Sudhakar D, Raija JA, Balasubramanian P (1999) Engineering resistance in elite indica rices to major diseases through Agrobacterium -mediated transformation General Meeting of The International Program on Rice Biotechnology, September, 1999 Phuket, Thailand Murashige T, Skoog F, A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture, Physiol Plant.15: 473-497, 1962 Nguyễn Hữu Hổ 1998 Chuyển gen kháng sâu cryII B gen kháng hygromycin (hpt) vào thuốc (Nicotiana tabacum L.) vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Tuyển tập công trình nghiên cứu khoa học( 1993-1998) Viện sinh học Nhiệt đới tr.505 Nguyễn Văn Uyển 1995 Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, tập Nxb Nông Nghiệp TpHCM 128 tr Powell KS, Gatehouse AMR, Hilder VA and Gatehouse JA (1993) Antimetabolic effects of plant lectins and plant and fungal enzymes on the nymphal stages of tow important rice pests, Nilaparvata lugens and Nephotettix cinciteps Entomol Exp Appl 66, 119-26 10.Powell KS, Gatehouse AMR, Hilder VA and Gatehouse JA (1995a) Antifeedant effects of plant lectins and an enzym on the adult stage of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens Entomol Exp Appl 75, 51-59 11.Rao KV, Christou P, Gatehouse MR, Gatehouse JA (1998) Expression of snowdrop lectin (GNA) in transgenic rice plants confers resistance to rice brown planthopper Plant Journal 15(4), pp 469-477 53 12 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press 13.Strizhov N, Keller M, Mathur J, Koncz-Kálmán Z, Bosch D, Prudovsley E, Schell J, Sneh B, Koncz C, Ziberstein A 1996 A synthetic CryIC gene, encoding a Bacillus thuringiensis endotoxin, confers Spodoptera resistance in alfalfa and tobacco Proc Natl Acad Sci 93: 15012-15017 14.Yang Z.N., Ingelbrecht I.L., LouzadaM Skaria E., Mirkov T.E (2000), “Agrobacterium-mediated transformation of the commercially important grapefruit cultivar Rio Red (Citrus paradisi Macf.)”, Plant Cell Reports, 19, pp 1203-1211 54