Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho chuyển gen trên cây đậu nành glycine max l sử dụng vi khuẩn agrobacterium rhizogenes

Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho chuyển gen trên cây đậu nành glycine max l sử dụng vi khuẩn agrobacterium rhizogenes Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho chuyển gen trên cây đậu nành glycine max l sử dụng vi khuẩn agrobacterium rhizogenes Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho chuyển gen trên cây đậu nành glycine max l sử dụng vi khuẩn agrobacterium rhizogenes

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP CHO CHUYỂN GEN TRÊN CÂY ĐẬU NÀNH (Glycine max L.) SỬ DỤNG VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes TÔN BẢO LINH CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRẺ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2017 ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP CHO CHUYỂN GEN TRÊN CÂY ĐẬU NÀNH (Glycine max L.) SỬ DỤNG VI KHUẨN Agrobacterium rhizogenes CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2017 MỤC LỤC MỤC LỤC TÓM TẮT ABSTRACT DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG PHẦN MỞ ĐẦU CHƯƠNG MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan đậu nành 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.1.2 Đặc điểm thực vật học đậu nành 2.1.3 Tầm quan trọng đậu nành 10 2.2 Chọn tạo giống đậu nành 11 2.3 Ứng dụng A rhizogenes nghiên cứu công nghệ sinh học thực vật 12 2.3.1 Giới thiệu vi khuẩn A rhizogenes 12 2.3.2 Plasmid Ri A rhizogenes 13 2.3.3 Cơ chế chuyển T-DNA từ vi khuẩn Agrobacterium vào tế bào thực vật 15 2.3.4 Cơ sở phân tử sinh lý hình thành rễ tơ 15 2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình chuyển gen 16 2.4.1 Sự phù hợp kiểu gen thực vật chủng vi khuẩn Agrobacterium 16 2.4.2 Môi trường 16 2.4.3 Lây nhiễm A rhizogenes lên mẫu thực vật 17 2.4.4 Mật độ vi khuẩn A rhizogenes lây nhiễm 18 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 19 3.2 Vật liệu nghiên cứu 19 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 3.2.2 Dụng cụ thiết bị 20 3.2.3 Hóa chất mơi trường 20 3.3 Phương pháp nghiên cứu 22 3.3.1 Tạo nguồn mẫu đậu nành in vitro chuẩn bị A rhizogenes 22 3.3.2 Xác định chủng vi khuẩn A rhizogenes mẫu đậu nành phù hợp cho việc cảm ứng tạo rễ tơ 24 3.3.3 Xác định hiệu diệt vi khuẩn loại kháng sinh 25 3.3.4 Ảnh hưởng tuổi mẫu đậu nành đến cảm ứng tạo rễ tơ 26 3.3.5 Ảnh hưởng cách thức lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes đến trình cảm ứng tạo rễ tơ mẫu đậu nành 27 3.3.6 Xác định mật độ vi khuẩn phù hợp cho trình cảm ứng tạo rễ tơ 28 3.3.7 Duy trì dòng rễ giả định chuyển gen 28 3.3.8 Khẳng định mẫu chuyển gen phương pháp PCR 29 3.3.9 Đánh giá hình thái, tăng trưởng rễ cảm ứng A rhizogenes 30 3.3.10 Phương pháp xử lý thống kê 30 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Giai đoạn chuẩn bị vật liệu thí nghiệm 31 4.1.1 Chuẩn bị mẫu đậu nành vô trùng in vitro 31 4.1.2 Chuẩn bị vi khuẩn cho trình lây nhiễm 31 4.2 Thí nghiệm Xác định chủng A rhizogenes loại mẫu phù hợp cảm ứng tạo rễ tơ đậu nành 33 4.3 Hiệu diệt khuẩn loại kháng sinh 38 4.4 Ảnh hưởng tuổi mẫu đậu nành đến khả cảm ứng tạo rễ tơ 41 4.4 Ảnh hưởng cách thức lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes đến khả cảm ứng tạo rễ mẫu đậu nành 43 4.5 Xác định mật độ A rhizogenes phù hợp cho trình cảm ứng tạo rễ tơ 44 4.6 Duy trì dịng rễ giả định chuyển gen 45 4.7 Khẳng định mẫu chuyển gen phương pháp PCR 46 4.8 Đánh giá hình thái, tăng trưởng rễ cảm ứng A rhizogenes 48 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 TÓM TẮT Chuyển gen đậu nành (Glycine max L.) thường thực phương pháp bắn gen sử dụng Agrobacterium tumefaciens Tuy nhiên thành công hiệu việc chuyển gen sử dụng hai phương pháp phụ thuộc phần lớn vào khả tái sinh thời gian tạo chuyển gen Chuyển gen tạo rễ tơ thông qua Agrobacterium rhizogenes khắc phục hạn chế hỗ trợ đắc lực cho nghiên cứu chức gen vùng rễ Nghiên cứu xác định số điều kiện thích hợp cho việc chuyển gen đậu nành (G max L.) sử dụng A rhizogenes nhằm thiết lập qui trình tạo rễ tơ đậu nành giống HLĐN29 DT84 Ở hai giống đậu nành HLĐN29 DT84, mẫu mầm cảm ứng tạo rễ tốt so với trụ hạ diệp Chủng ATCC11325 ATCC15834 cho hiệu tạo rễ cao giống đậu nành HLĐN29, tỉ lệ mẫu tạo rễ khoảng 96% – 100%, số rễ trung bình khoảng rễ/mẫu) với hình thái rễ tương tự đặc điểm rễ tơ chuyển gen Trong chủng ATCC15834 cho hiệu tạo rễ tốt giống đậu nành DT84 Mẫu sau giai đoạn đồng nuôi cấy loại khuẩn hiệu với cefotaxime 500 mg/L carbenicillin 400 mg/L trì mơi trường bổ sung cefotaxime 500 mg/L Lá mầm đậu nành 6-8 ngày sau gieo cảm ứng tạo rễ tốt Hai cách lây nhiễm trực tiếp đồng nuôi cấy vi khuẩn cho kết tỉ lệ mẫu tạo rễ số rễ trung bình tương đương hai giống đậu nành HLĐN29 DT84 Tỉ lệ mẫu tạo rễ đậu nành DT84 không khác biệt đáng kể sử dụng dịch khuẩn ATCC15834 OD600nm =0,5; 0,7; 1,0 1,3 Trong đó, số rễ trung bình cao (~ rễ/mẫu) sử dụng dịch khuẩn có giá trị OD 600nm từ 0,5 đến 1,0 Ba mẫu rễ chuyển gen xác định thơng qua phân tích PCR đặc điểm hình thái trì mẫu môi trường nuôi không bổ sung hormon tăng trưởng ABSTRACT Soybean (Glycine max L.) transformation has been performed via particle bombardment and Agrobacterium tumefaciens However, the success and efficiency of these transformation methods mainly rely on the ability and time to generate transgenic plants To overcome these limitations, transformation using Agrobacterium rhizogenes has become a useful tool for functional research on plant root systems This study was undertaken to determine some conditions for transformation via A rhizogenes for hairy root induction on soybean cultivars HLDN29 and DT84 Cotyledonary explants were more efficient in hairy root production in both cultivars HLDN29 and DT84 The highest root induction rate and average root number were observed in HLDN29 explants infected with bacterial strain ATCC11325 and ATCC15834 (96% – 100% and roots/explant) and in DT84 explants infected with ATCC15834 Morphology of these roots showed similarities with description for transgenic roots Successful bacterial remove from the cotyledonary explants was achieved by rinsing the explants in the culture media supplemented with 500 mg/L cefotaxime and 400 mg/L carbenicillin before placing them on MXB plates containing 500 mg/L cefotaxime Cotyledonary leaves after sowing 6-8 days were optimal for hairy root induction The two infection methods (direct inoculation and immersion) showed no significant difference in root induction rate and average root number in both soybean cultivars There was no significant difference in root formation rate of soybean DT84 infected with ATCC15834 suspension from OD 600nm =0.5 to OD600nm =1.3, while the highest average root number (~7 roots/explant) was obtained with the suspension OD600nm =0.5 to OD600nm =1.0 Three transgenic root lines were identified based on their morphological characteristics on hormon – free media during subcultures and PCR analysis DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATCC: American Type Culture Collection Aux: auxin B5: Gamborg medium bp: base pair DNA: Deoxyribonucleic acid C: carbenicillin CC: carbenicillin and cefotaxime Cf: cefotaxime CCM: Co-culture medium FAO: Food and Agriculture Organization Gus: β-glucuronidase ICPB: International Collection of Phytopathogenic Bacteria LB: Left Boder LCCM: liquid co-culture medium MS: Murashige and Skoog MXB: MS basal nutrient salts (Murashige and Skoog 1962), B5 vitamins (Gamborg et al 1968), sucrose and cefotaxime LMXB: liquid MXB NT: Nghiệm thức OD: Optical Density PCR: Rolymerase Chain Reaction RB: Right Boder Ri-plasmid: Root inducing plasmid Rol: root locus TBE: Tris /borate/EDTA T-DNA: Transfer Deoxyribonucleic Acid Ti-plasmid: Tumor inducing plasmid TL/TR-DNA: left and right T-DNA Vir: Virulence YEB: yeast extract -nutrient borth YEP: yeast extract pepton YMB: yeast mannitol broth w/v: weight/volume µM: micromolar DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Thành phần loại môi trường sử dụng cảm ứng tạo rễ tơ……21 Bảng 3.2 Các cặp primer sử dụng nghiên cứu…………………………………21 Bảng 3.3 Các nghiệm thức thí nghiệm xác định chủng A rhizogenes …………25 Bảng 3.4 Các nghiệm thức khảo sát hiệu diệt khuẩn………………………… 26 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng PCR 29 Bảng 3.6 Chương trình nhiệt phản ứng PCR 29 Bảng 4.1 Tỉ lệ (%) mẫu tạo rễ mầm trụ hạ diệp 34 Bảng 4.2 Số rễ tạo thành từ loại mẫu đậu nành in vitro 35 Bảng 4.3 Mức độ tái nhiễm A rhizogenes mẫu mầm đậu nành DT84 39 Bảng 4.4 Số rễ tạo thành tỉ lệ tạo rễ mầm đậu nành 41 Bảng 4.5 Số rễ trung bình tỉ lệ tạo rễ mẫu mầm đậu nành 43 Bảng 4.6 Số rễ tạo thành tỉ lệ mẫu tạo rễ đậu nành DT84 sau lây nhiễm 44 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 2.3 Cấu trúc Ri plasmid 14 Sơ đồ 3.1 Qui trình thực lây nhiễm A rhizogenes đậu nành 23 Hình 4.1 Hạt đậu nành nảy mầm 31 Hình 4.2 Khuẩn lạc chủng Agrobacterium rhizogenes 32 Hình 4.3 Lá mầm trụ hạ diệp đậu nành HLDN29 sau lây nhiễm 36 Hình 4.4 Rễ mẫu mầm đậu nành HLDN29 sau lây nhiễm 37 Hình 4.5 Mẫu mầm đậu nành ngày sau rửa với carbenicillin cefotaxime 40 Hình 4.6 Hạt đậu nành DT84 gieo môi trường B5 42 Hình 4.7 Rễ đậu nành HLĐN29 môi trường MXB 46 Hình 4.8 Kết phân tích PCR kiểm tra diện gen 47 Hinh 4.9 Các mẫu rễ chuyển gen sau tuần trì mơi trường B5 48 đến trình chuyển gen đậu nành ex vitro sử dụng A rhizogenes cho thấy mẫu đậu nành từ – ngày tuổi tạo rễ sau lây nhiễm vi khuẩn từ -9 ngày; chồi đậu nành ngày sau gieo hạt có tỉ lệ mẫu tạo rễ thấp so với mẫu - ngày, nhiên khác biệt ý nghĩa mặt thống kê AL-Yozbaki ctv (2015) sử dụng mầm đậu nành từ – 10 ngày sau gieo hạt để tạo rễ tơ sử dụng A rhizogenes R1000 a b c d f e Hình 4.6 Hạt đậu nành DT84 gieo môi trường B5 ngày tuổi khác (a) ngày tuổi; (b) ngày tuổi; (c) ngày tuổi; (d) ngày tuổi; (e)8 ngày tuổi; (f)10 ngày tuổi Chồi đậu nành sử dụng chất dinh dưỡng dự trữ hai mầm để tăng trưởng, từ hạt nảy mầm, chất dinh dưỡng hai mầm giảm dần Hiệu mặt thời gian cảm ứng tạo rễ phụ thuộc vào độ tuổi mẫu Mẫu giai đoạn sớm 42 thường khuyến khích sử dụng (Cao ctv 2009) Bên cạnh đó, giai đoạn ngày tuổi, lượng chất dinh dưỡng thấp so với mầm giai đoạn sớm Hạt đậu nành ngày sau gieo bắt đầu trương to, hai mầm nứt bọc vỏ hạt Từ ngày thứ 4, mầm đậu nành chuyển từ màu vàng sang mày xanh Từ ngày thứ trở đi, lớp vỏ hạt bắt đầu tách (hình 4.6) Do thực tế, xử lí mẫu để lây nhiễm, sử dụng hạt đậu nành từ ngày thứ trở tạo thuận lợi thao tác, làm tổn thương mẫu tách vỏ hạt rút ngắn thời gian thực giai đoạn Vì hạt đậu nành - ngày sau gieo mẫu thích hợp để cảm ứng tạo rễ sử dụng A rhizogenes 4.5 Ảnh hưởng cách thức lây nhiễm vi khuẩn A rhizogenes đến khả cảm ứng tạo rễ mẫu đậu nành Cách thức lây nhiễm vi khuẩn Agrobacterium lên mẫu thực vật cho kết cảm ứng tạo rễ khác Thí nghiệm thực đậu nành HLĐN29 DT84 nhằm tìm cách lây nhiễm phù hợp mẫu mầm Số rễ trung bình tỉ lệ mẫu tạo rễ ghi nhận sau lây nhiễm A rhizogenes 14 ngày Bảng 4.5 Số rễ trung bình tỉ lệ tạo rễ mẫu mầm đậu nành sau lây nhiễm A rhizogenes theo cách khác HLĐN29 Cách lây nhiễm Số rễ TB DT84 Tỉ lệ mẫu tạo rễ (%) Số rễ TB Tỉ lệ mẫu tạo rễ (%) Trực tiếp 8,74a 98,33a 7,07a 95,00a ĐC1 3,79b 70,00c 5,28b 78,33b Ngâm mẫu 6,68a 91,67ab 7,26a 91,67a ĐC2 4,15b 71,67bc 4,54c 76,67b CV(%)=14,06; F = 24,07** CV(%)=13,37; F = 6,76* CV(%)=2,88 ; CV(%)= 3,57 ; F = 177,43** F = 6,99* Số liệu giá trị trung bình lần lặp lại; CV:hệ số biến thiên; Trong cột, kí tự a, b, c theo sau khác biểu khác biệt mặt thống kê; “*” khác biệt có ý nghĩa; “**” khác biệt có ý nghĩa Số liệu tỉ lệ mẫu rễ (x) chuyển đổi theo công thức y = arcsin(x) 1/2 trước xử lí thống kê 43 Kết bảng 4.5 cho thấy số rễ trung bình tỉ lệ mẫu tạo rễ nghiệm thức lây nhiễm trực tiếp ngâm mẫu dịch khuẩn hai giống đậu nành cao so với nghiệm thức đối chứng (ĐC1 ĐC2), khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê Ở giống HLĐN29 DT84, nghiệm thức lây nhiễm trực tiếp, dùng dao nhúng vào dịch khuẩn sau tạo vết thương cho tỉ lệ mẫu tạo rễ cao 98,33% 95%, nhiên, khác biệt khơng có ý nghĩa so với nghiệm thức ngâm mẫu tạo vết thương dịch khuẩn Kết tương tự với nghiên cứu AL-Yozbaki cộng tác viên (2015) tạo rễ tơ đậu nành sử dụng A rhizogenes R1000; tỉ lệ mẫu mầm đậu nành tạo rễ lây nhiễm trực tiếp 76,9% phương pháp ngâm dịch khuẩn 60% Số rễ trung bình hai cách lây nhiễm khơng khác biệt mặt thống kê 4.6 Xác định mật độ A rhizogenes phù hợp cho trình cảm ứng tạo rễ tơ Mật độ vi khuẩn yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu lây nhiễm Vi khuẩn Agrobacterium giai đoạn tăng trưởng xem có khả lây nhiễm cao (Zhou ctv, 2011) Bảng 4.6 Số rễ trung bình tỉ lệ mẫu tạo rễ đậu nành DT84 sau lây nhiễm A rhizogenes nồng độ khác NT Giá trị OD600nm Số rễ TB Tỉ lệ mẫu tạo rễ (%) 0,2 6,20b 73,33b 0,5 7,40a 96,67a 0,7 7,11a 96,67a 1,0 7,30a 100,00a 1,3 6,22b 86,67a CV (%) = 6,87; F = 4,704* CV (%) = 2,91; F = 13,61* Số liệu giá trị trung bình lần lặp lại; CV: hệ số biến thiên; Các kí tự a, b theo sau cột khác biểu khác biệt mặt thống kê; “*” khác biệt có ý nghĩa Số liệu tỉ lệ mẫu rễ (x) chuyển đổi theo cơng thức y = (x)1/2 trước xử lí thống kê 44 Kết khảo sát khả tạo rễ mẫu mầm đậu nành DT84 cho thấy nồng độ A rhizogenes mức OD600 từ 0,5 đến 1,0 cho tỉ lệ mẫu tạo rễ số rễ trung bình cao, nằm khoảng 96,67 % - 100% 7,30 – 7,40 (bảng 4.6) Mật độ Agrobacterium sử dụng để lây nhiễm đậu nành thay đổi tùy theo chủng vi khuẩn giống đậu nành sử dụng Cao ctv (2009) nhận thấy khác biệt thời gian cảm ứng tạo rễ mật độ A rhizogenes K 599 khác (OD600 từ 0,2 – 1,3) lây nhiễm lên đậu nành Zigongdongdou điều kiện ex vitro Trong đó, ALYozbaki, Rasheed Salih (2015) sử dụng dịch khuẩn A rhizogenes R1000 với OD600 từ 0,5 – 1,0 để lây nhiễm lên giống đậu nành địa phương 4.7 Duy trì dịng rễ giả định chuyển gen Các mẫu rễ từ mẫu mầm có khơng lây nhiễm với A rhizogenes cắt thành đoạn cấy môi trường MXB không chứa hormon thực vật Tuy nhiên, đoạn rễ ngắn cm sống mơi trường khoảng 10 ngày, khơng có dấu hiệu tăng trưởng chuyển sang màu đen Các mẫu rễ dài khoảng 10 cm tồn tăng trưởng môi trường nuôi cấy Mẫu đối chứng tăng trưởng chậm phần rễ chuyển sang màu đen Trong đó, rễ từ mẫu mầm lây nhiễm A rhizogenes tăng trưởng mạnh, rễ phân nhánh lan hết diện tích đĩa cấy Sự khác biệt cho thấy khả mẫu rễ rễ chuyển gen Các gen nằm vùng T-DNA pRi giúp rễ chuyển gen tự tổng hợp auxin cần thiết cho phát triển 45 a b c d Hình 4.7 Rễ đậu nành HLĐN29 môi trường B5 không bổ sung o chất điều hịa tăng trưởng thực vật sau tuần ni 25 C điều kiện tối Rễ từ mẫu không lây nhiễm vi khuẩn vừa cấy chuyền (a) sau tuần (c); rễ từ mẫu lây nhiễm vi khuẩn vừa cấy chuyền (b) sau tuần (d) Thanh ngang = cm 4.8 Khẳng định mẫu chuyển gen phương pháp PCR Gen rolC tồn vùng T-DNA A rhizogenes tồn mẫu rễ chuyển gen Gen virD tồn Ri plamsid, nhiên nằm vùng T-DNA không chuyển vào gen thực vật Các mẫu rễ giả định chuyển gen ly trích DNA thực PCR kiểm tra diện gen rolC virD để kiểm tra kết chuyển gen 46 M1 3 - M2 + - M1 + bp bp 600 bp 400 200 100 400 A B 300 C Hình 4.8 Kết phân tích PCR kiểm tra diện gen Golgin 84 (A), gen rolC (B) gen virD (C) dòng rễ biến đổi gen A rhizogenes (giếng 1, 2, 3) rễ không chuyển gen (giếng “—”), DNA plasmid A rhizogenes ATCC15834 (đối chứng dương, ” +”); M1, M2: Hyper ladder 100 bp 1kb (Bioline) Sản phẩm PCR điện di gel agarose 2% hiệu điện 80V Gen Golgin 84 gen thường trực đậu nành sản phẩm khuếch đại từ gen có kích thước 121 bp (Marcolino-Gomes ctv 2015) Hình 4.8A cho thấy mẫu DNA ly trích từ dịng rễ tơ có nguồn gốc từ đậu nành sử dụng cho phản ứng khuếch đại DNA Các mẫu DNA tiếp tục khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu cho gen rolC để kiểm tra kết chuyển gen (hình 4.8B) Kết điện di cho thấy mẫu rễ tơ phân tích xuất băng nằm vạch 600 bp 400 bp thang chuẩn tương tự sản phẩm PCR từ plasmid A rhizogenes ATCC15834, phù hợp với kích thước sản phẩm dự kiến 535 bp Trong đó, khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu cho gen virD, có mẫu đối chứng dương tạo sản 47 phẩm PCR (~438 bp) mẫu phân tích cho kết âm tính Kết phân tích DNA cho thấy mẫu rễ kiểm tra chuyển gen từ A rhizogenes ATCC15834 4.9 Đánh giá hình thái, tăng trưởng rễ cảm ứng A rhizogenes Ba mẫu rễ xác định mang gen chuyển từ A rhizogenes ATCC 15834 trì mơi trường B5 (Hình 4.9) Do hạn chế thời gian, nên nhóm nghiên cứu chưa thu thập đầy đủ số liệu tiêu tốc độ tăng trưởng rễ chuyển gen C A B Hình 4.9 Rễ chuyển gen từ mầm đậu nành sau lây nhiễm A rhizogenes ATCC15834 tăng sinh tuần môi trường B5 Rễ từ mầm đậu nành HLĐN 29 (A B) DT 84 (C) Thanh ngang = cm Các mẫu rễ có khả tăng sinh môi trường B5 không bổ sung hormon tăng trưởng Từ đoạn rễ 10 cm ban đầu, mẫu rễ tăng trưởng phát sinh nhánh Rễ có màu từ vàng đến nâu, rễ phát sinh có màu trắng Ở hình 4.9A dịng rễ thứ từ mầm đậu nành HL29 cho thấy khả tăng trưởng mạnh, rễ nhánh phát sinh từ rễ có đường kính to dày so với hình 4.9B C Tuy có nguồn gốc từ đậu nành giống HL29 dòng rễ thứ hình 4.9B có mật độ rễ phát sinh cao, phần rễ khơng tăng trưởng nhiều Hình 4.9C cho thấy dòng rễ từ đậu nành DT84, rễ tăng trưởng mạnh chiều dài, rễ nhánh phân tán theo chiều dài rễ Sự khác biệt hình thái dịng rễ chuyển gen phản ứng kiểu gen đậu nành khác với vi khuẩn hay biểu biểu khác gen vùng T-DNA chuyển vào gen thực vật (Cho, 1998) 48 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Một số kết luận từ kết nghiên cứu điều kiện cảm ứng tạo rễ tơ đậu nành HLĐN 29 DT84 sử dụng A rhizogenes sau: Mẫu mầm tạo rễ tốt so với trụ hạ diệp sau lây nhiễm vi khuẩn Chủng ATCC11325 15834 cho hiệu tạo rễ tơ cao giống HLĐN 29, chủng ATCC15834 cho hiệu tạo rễ cao đậu nành DT84 Rửa mẫu dung dịch cefotaxime 500 mg/L carbenicillin 400 mg/L 30 phút bổ sung cefotaxime 500 mg/L vào môi trường nuôi cấy cho hiệu diệt khuẩn cao Mẫu mầm - ngày sau gieo hạt cho số rễ trung bình cao Hai cách lây nhiễm trực tiếp ngâm mẫu dịch vi khuẩn cho hiệu tạo rễ tương đương Dịch khuẩn mức OD600nm từ 0,5 đến 1,3 cho tỉ lệ mẫu tạo rễ tương đương (96,67% - 100%) Trong đó, dịch khuẩn mức OD600nm từ 0,5 đến 1,0 cho số rễ trung bình cao (7,3 – 7,4) Qua phân tích PCR với primer đặc hiệu cho gen rolC virD xác định dòng rễ tơ chuyển gen Do giới hạn thời gian kinh phí thực nghiên cứu, số điều kiện liên quan đến trình tạo rễ tơ đậu nành A rhizogenes khả ứng dụng rễ tơ cần làm rõ nghiên cứu sau: - Môi trường tăng sinh rễ tơ chuyển gen mức độ bền vững gen chuyển từ vi khuẩn dòng rễ chuyển gen - Tạo rễ tơ mang gen kháng hay liên quan đến tính kháng tuyến trùng đậu nành - Khả sử dụng rễ tơ nhân nuôi tuyến trùng điều kiện in vitro 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Aarrouf, J., Castro-Quezada, P., Mallard, S., Caromel, B., Lizzi, Y., Lefebvre, V 2012 Agrobacterium rhizogenes-dependent production of transformed roots from foliar explants of pepper ( Capsicum annuum): a new and efficient tool for functional analysisof genes Plant Cell Reports 31:391–401 Alpizar, E., Dechamp, E., Espeout, S., Lecouls, A C., Nicole, M., Bertrand, B., Lashermes, P., Etienne, H 2006 Efficient production of Agrobacterium rhizogenes-transformed roots and composite plants for studying gene expression in coffee roots Plant Cell Reports 25:959–967 AL-Yozbaki, G S H., Rasheed, J H., Salih, S M (2015) Transformation of Soybean (Glycine Max L.) Via GUS –Labeled Agrobacterium rhizogenes R1000 International Journal of Science and Technology, 4(6): 267 – 272 Bernard, R.L., and Weiss, M.G 1973 Qualitative genetics In Soybeans: Improvement, Production, and Uses, 1st Edn., B.E Caldwell Ed (Madison, WI: American Society of Agronomy), pp 117–154 Britton, M.T., Escobar, M.A., Dandekar, M 2008 The oncogenes of Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes In: Tzfira T, Citovsky V (eds) Agrobacterium: from biology to biotechnology Springer, Heidelberg, pp 525–563 Cao, D., Hou, W., Song, S et al 2009 Assessment of conditions affecting Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean Plant Cell, Tissue and Organ Culture 96: 45-52 https://doi.org/10.1007/s11240-008-9458-x Chen, L., Cai, Y., Liu, X., Guo, C., Sun, S., Wu, C., Hou, W 2017 Soybean hairy roots produced in vitro by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation The Crop Journal doi: https://doi.org/10.1016/j.cj.2017.08.006 Cho, H J., Farrand, S K., Noel, G R., and Widholm, J M 2000 High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode Planta, 210, 195 - 204 Cho, H.J., Widholm, J M., Tanaka, N., Nakanishi, Y and Murooka, Y 1998 Agrobacterium rhizogenes – mediated transformation and regeneration of the legume Astragalus sinicus (Chinese milk vetch) Plant Science 138: 53-65 Đậu tương HLĐN29 http://harc-ias.vn/san-pham-khcn/giong-cay-trong/dau-tuong/dau-tuong-hldn-29.html Truy cập ngày 12/11/ 2017 50 Viện di truyền Nông nghiệp Bộ môn Đột biến Ưu lai http://www.agi.gov.vn/vi/bo-mon-dot-bien-va-uu-the-lai/30/bo-mon-dot-bien-va-uuthe-lai Truy cập ngày 12/11/2017 Doran, P M.2002) Properties and applications of hairy root cultures In: Marja K, Caldentey K R Hakeem et al (eds.), Crop Improvement, DOI 10.1007/978-14614-7028-1_1, © Springer Science+Business Media, LLC Fattahi, M., Nazeri, V., Torras-Claveria, L., Sefidkon, F., Cusido, R M., Zamani, Z., and Palazon, J.2013 A new biotechnological source of rosmarinic acid and surface flavonoids: hairy root cultures of Dracocephalum kotschyi Boiss Industrial crops and Products 50:256-263 Fukuda, Y 1933 Cyto-genetical studies on the wild and cultivated Manchurian soy beans (Glycine L.) Japan Journal of Botany.6: 489–506 Gelvin, S B 2003 Improving plant genetic engineering by manipulating the host Trends in Biotechnology 21:95–98 Hansen, G., Das, A., Chilton, M D 1994 Constitutive expression of the virulence genes improves the efficiency of plant transformation by Agrobacterium Proceedings of the National Academy of Sciences 91:7603–7607 Hayashi T, Banba M, Shimoda Y, Kouchi H, Hayashi M, Imaizumi-Anraku H.2010 A dominant function of CCaMK in intracellular accommodation of bacterial and fungal endosymbionts The Plant Journal 63:141–154 Hernandez-Garcia, C M., Bouchard, R A., Rushton, P J., Jones, M L., Chen, X., Timko, M P., & Finer, J J 2010 High level transgenic expression of soybean (Glycine max) GmERF and Gmubi gene promoters isolated by a novel promoter analysis pipeline BMC Plant Biology, 10(1): 237 doi: 10.1186/1471-2229-10-237 Homrich, M S., Wiebke-Strohm, B., Weber, R L M., & Bodanese-Zanettini, M H 2012 Soybean genetic transformation: A valuable tool for the functional study of genes and the production of agronomically improved plants Genetics and Molecular Biology, 35(4 Suppl): 998-1010 Hymowitz, T and C A Newell 1981 Taxonomy of the genus Glycine, domestication and uses of soybeans Economic Botany 37: 371-379 ISAAA 2016 Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2016 ISAAA Brief No 52 ISAAA: Ithaca, NY 51 Jaiwal, P.K., Kumari, R., Ignacimuthu, S., Potrykus, I., Sautter, C 2001 Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of mungbean (Agrobacterium L Wilczek)-a recalcitrant grain legume Plant Science 161:239– 247 doi: 10.1016/S0168-9452(01)00352-1 Karmarkar, S H, Keshavachandran R, Nazeem P A and Girija D 2001 Hairy root induction in Adapathiyan (Holostemma ada-kodien K Schum.) Journal of Tropical Agriculture 39 : 102-107 Kereszt, A., Li, D., Indrasumunar, A., Nguyen, C D T, Nontachaiyapoom, S., Kinkema, M., Gresshoff, P M 2007 Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology Nature Protoctocols 2: 948–952 Kifle, S., Shao, M., Jung, C., Cai, D 1999 An improved transformation protocol for studying gene expression in hairy roots of sugar beet (Beta vulgaris L.) Plant Cell Reports 18:514–519 Krishnan, H B 2005 Engineering soybean for enhanced sulfur amino acid content Crop Science, 45(2), 454-461 doi: 10.2135/cropsci2005.0454 Kumar V, Jones B, Davey M R 1991 Transformation by Agrobacterium rhizogenes and regeneration of transgenic shoots of the wild soybean Glycine argyrea Plant Cell Reports 10: 135–138 Lee C.-W., Efetova, M., Engelmann, J C., Kramell, R., Wasternack, C., LudwigMuller J., et al 2010 Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogen defense in Arabidopsis thaliana Plant Cell 2: 2948–2962 Li, J., Todd, T T and Trick, H N 2010 Rapid in planta evaluation of root expressed transgenes in chimeric soybean plants Plant Cell Reports 29:13-123 Marcolino-Gomes, J., Rodrigues, F A., Fuganti-Pagliarini, R., Nakayama, T J., Ribeiro Reis, R., Bouỗas Farias, J R., Nepomuceno, A 2015 Transcriptome-wide identification of reference genes for expression analysis of soybean responses to drought stress along the day PLOS ONE, 10(9), e0139051 doi: 10.1371/journal.pone.0139051 Ngô Thế Dân 1999 Cây Đậu Tương Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội Trần Thượng Tuấn Nguyễn Phước Đằng, 1993 Nguyễn Như Nhứt Bùi Văn Lệ, 2016 Ảnh hưởng số yếu tố lên cảm ứng rễ tơ dừa cạn (Catharanthus roseus) chủng Agrobacterium rhizogenes C26 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 44b: 96-103 Nilsson, O., and Olsson, O 1997 Getting to the root: the role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots Physiol Plant 100:463–473 52 Olhoft,P M., Bernal, L M., Grist, L B., Hill, D S., Mankin, S.L., Shen, Y., Kalogerakis, M., Wiley, H., Toren, E., Song, H-S., Hillebrand, H., Jones, T 2007 A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant 43:536–549 Olhoft, P M., Flagel, L X., Donovan, C M., and Somers, D A 2003 Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method Planta 216 (5): 723–735 Olhoft, P., et al 2013 A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant 43(6): 536-549 Owen, L.D., and Cress, D E 1985 Genotypic variability of soybean response to Agrobacterium strains harboring the Ti or Ri plasmids Plant Physiology 11: 87-94 Ozyigit, I I., Dogan, I., & Artam Tarhan, E 2013 Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and its biotechnological applications in crops In K R Hakeem, P Ahmad & M Ozturk (Eds.), Crop Improvement: New Approaches and Modern Techniques (pp 1-48) Boston, MA: Springer US, pp 108 Paz, M.M., Martinez, J.C., Kalvig, A.B et al 2006 Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation Plant Cell Reports 25: 206 https://doi.org/10.1007/s00299-005-0048-7 Phạm Gia Thiều, 2000 Kỹ thuật trồng chế biến đậu tương NXB Nông nghiệp Hà Nội Rao, R S., and Ravishankar, G A 2002 Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites Biotechnology Advances, 20 (2), 101-153 Savka, M A., Ravillion, B., Noel, G R., and Farrand, S K.1990 Induction of hairy root on cultivated soybean genoptypes and their use to propagate soybean cyst nematode Phytochemistry 80:503 – 508 Sevón, N., Oksman C, Kirsi M 2002 Agrobacterium rhizogenes mediated transformation: root cultures as a source of alkaloids Planta Medicine 68:859– 868 Shoemaker, R C., Schlueter, J A., Cregan, P., Vodkin, L 2003 The status of soybean genomics and its role in the development of soybean biotechnologies AgBioForum 6:4–7 53 Slightom, J L., Durand-Tardif, M., Jouanin, L., Tepfer, D (1986) Nucleotide sequence analysis of TLDNA of Agrobacterium rhizogenes agropine type plasmid Journal of Biology Chemistry 261:108–121 Stachel, S.E., and Zambryski, P C 1986.Agrobucterium tumefuciens and the susceptible plant cell: a nove1 adaptation of extracellular recognition and DNA conjugation The Cell 47: 155-157 Subramanian, A., Tamayo, P., Mootha, V K., Mukherjee, S., Ebert, B L., Gillette, M A., Mesirov, J P 2005 Gene set enrichment analysis: A knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles Proceedings of the National Academy of Sciences, 102(43), 15545-15550 doi: 10.1073/pnas.0506580102 Sudaric, A., Vrataric, M., Mladenovic Drinic,S And Matosa, M 2010 Biotechnology In Soybean Breeding Genetika 42 (1): 91-102 Suraninpong, P., Chanprame, S., Cho, H.-J , Widholm, J H., and Waranyuwat, A 2004 Agrobacterium-mediated Transformationof Mungbean [Vignaradiata(L.) Wilczek] Walailak Journal of Science and Technology 1(2):38-48 Tazeen, S., & Mirza, B 2004 Factors affecting Agrobacterium tumefaciens mediated genetictransformation of Vigna radiata (L.) Wilczek Pakistan Journal of Botany, 36(4), 887-896 Tóth, K., Batek, J., & Stacey, G 2016 Generation of Soybean (Glycine max) Transient Transgenic Roots Current Protocols in Plant Biology: John Wiley & Sons, Inc Trần Văn Điền.2007 Giáo trình đậu tương Đại học Nơng Lâm Thái Nguyên Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội Veena, V., and Taylor, G C 2007 Agrobacterium rhizogenes: recent developments and promissing applications In Vitro cell Dev Biol Plant 43: 383-403 Vilaine, F., Charbonnier, C., Casse-Delbart, F 1987 Further insight concerning the TL-region of the Ri plasmid of Agrobacterium rhizogenes strain A4: transfer of a 1.9 kb fragment is sufficient to induce transformed roots on tobacco leaf fragments Molecular Genomics and Genetics 210:111–115 Weber, R L M and Bodanese-Zanettini, M H 2011 Induction of transgenic hairy roots in soybean genotypes by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation Pesquisa Agropecuária Brasileira, 46(9):1070-1075 Winans S C., Ebert P R., Stachel S E., Gordon M P., Nester E W (1986) A gene essential for Agrobacterium virulence is homologous to a family of positive 54 regulatory loci Proceedings of the National Academy of Sciences 83: 8278–8282 doi: 10.1073/pnas.83.21.8278 Wise, A A., Liu, Z., and Binns, A N 2006 Culture and maintenance of Agrobacterium strains In K Wang (Ed.), Methods in Molecular Biology: Agrobacterium protocols (Vol 2/e, 1) Totowa, NJ: Humana Press Inc Yadav, S K., Katikala, S., Yellisetty, V., Kannepalle, A., Narayana, J L., Maddi, V., Bharadwaja, K P 2012 Optimization of Agrobacterium mediated genetic transformation of cotyledonary node explants of Vigna radiata SpringerPlus, 1(1), 59 doi: 10.1186/2193-1801-1-59 Zhou J., Wang C., Liu X., Tan Y 2011 A study on improving regeneration rate of Agrobacterium-mediated callus of mature embryo for indica rice Chinese Agricultural Science Bulletin 27: 1–5 Zia, M., Rizvi, Z F., Rehman,R.U and Chaudhary, M F 2010 Short communication Micropropagation of two Pakistani soybean (Glycine max L.) cultivars from cotyledonary nodes Spanish Journal of Agricultural Research 8(2): 448-453 Zupan, J.R., Zambryski, P., Citovsky, V 1996 Agrobacterium VirE2 protein mediates nuclear uptake of single-stranded DNA in plant cells Proceedings of the National Academy of Sciences 93:2392–23 55