Hoạt tính kháng oxi hóa, kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ cây tía tô (Perilla frutescens) và thử nghiệm cảm ứng tạo rễ tơ bằng chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

Các kết quả kháng oxi hóa (ở các công trình đã đề cập và trong nghiên cứu này) cho thấy hoạt tính kháng oxi hóa của Tía tô phụ thuộc vào các hợp chất thứ cấp được tích lũy khi được trồng[r]

(1)

TạpchíPháttriểnKhoahọcvàCơngnghệ–Khoa học Tự nhiên, 5(1):975-983 Open Access Full Text Article

1PTN Công nghệ Sinh học Phân tử, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM

2

Khoa Sinh học – Công nghệ sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM

Liên hệ

Quách Ngô Diễm Phương, Khoa Sinh học – Công nghệ sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM

PTN Công nghệ Sinh học Phân tử, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Email: qndphuong@hcmus.edu.vn

Lịch sử

•Ngày nhận: 2020-05-28 •Ngày chấp nhận: 2020-12-21 •Ngày đăng: 2021-1-28 DOI: 10.32508/stdjns.v5i1.917

Bản quyền

Hoạt tính kháng oxi hóa, kháng khuẩn cao chiết ethanol từ cây

tía tơ (

Perilla frutescens

) thử nghiệm cảm ứng tạo rễ tơ bằng

chủng vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes

Trà Đông Phương

1,2

, Lê Thị Mộng Vương

2

, Quách Ngô Diễm Phương

1,2,*

Use your smartphone to scan this QR code and download this article

TĨM TẮT

Tía tơ (Perilla frutescens) – lồi thực vật thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae) – sử dụng phổ biến y học cổ truyền để chữa nhiều loại bệnh thường gặp (cảm lạnh, đau đầu, ho, đầy bụng, chướng bụng, ngộ độc, …) chứa nhiều hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học Khi tiến hành điều chế cao ethanol từ quan rễ, thân khảo sát khả kháng oxi hóa phương pháp bắt gốc tự DPPH khả kháng khuẩn phương pháp đục lỗ thạch, kết cho thấy cao chiết ethanol từ quan Tía tơ có hoạt tính kháng oxi hóa kháng khuẩn Bằng phản ứng đặc trưng, tất cao chiết ethanol từ rễ, thân Tía tơ có chứa nhóm phenol, flavonoid, saponin, alkaloid glycoside, triterpenoid có Các hợp chất thứ cấp có liên quan đến hoạt tính kháng oxi hóa kháng khuẩn Tía tơ Bên cạnh đó, thử nghiệm khả cảm ứng tạo rễ tơ chủng vi khuẩnAgrobacterium rhizogenesATCC 15834 quan Tía tơ quan tạo rễ tơ tốt (67,67±3,51% số mẫu cảm ứng tạo rễ tơ) Hiệu tạo rễ tơ cao với thời gian ngâm mẫu 20 phút đồng nuôi cấy 72 Các kết tiền đề cho nghiên cứu liên quan đến nuôi cấy rễ tơ để thu nhận hợp chất có hoạt tính sinh học

Từ khoá:Hợp chất thứ cấp, kháng khuẩn, kháng oxi hóa, rễ tơ, Tía tơ

TỔNG QUAN

Tía tơ (Perilla frutescens) lồi thực vật thuộc

họ Hoa mơi (Lamiaceae) Tía tơ trồng chủ yếu nước châu Á từ 2000 năm trước loài trồng quan trọng nơng

nghiệp1,2 Ngồi việc dùng Tía tơ loại

thực phẩm thơng thường, Tía tơ cịn sử dụng loại thuốc y học cổ truyền châu Á để chữa nhiều loại bệnh thường gặp (cảm lạnh, đau đầu, ho, đầy bụng, chướng bụng, ngộ độc, …)

chứa nhiều hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học3

Tại Việt Nam, Tía tơ tập trung nghiên cứu để phát hợp chất thứ cấp

và hoạt tính sinh học tiềm năng4–6, có sự

khác hoạt tính sinh học lẫn hợp chất thứ cấp tích lũy Tía tơ trồng khu vực địa lý khác Do đó, nghiên cứu nhằm mục đích xác định hoạt tính kháng oxi hóa kháng khuẩn cao chiết ethanol từ Tía tơ trồng huyện Tây Hòa, tỉnh Phú Yên Đồng thời, nghiên cứu thử nghiệm cảm ứng tạo rễ tơ Tía tơ

với chủng vi khuẩnAgrobacterium rhizogenesATCC

15834 nhằm tạo tiền đề cho nghiên cứu lĩnh vực ni cấy rễ tơ Tía tơ để thu nhận hợp chất thứ cấp có giá trị

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu sinh học

Hạt giống Tía tơ mua từ cơng ty TNHH TM Trang Nơng Cây Tía tơ tháng tuổi (trồng thị trấn Phú Thứ, huyện Tây Hòa, tỉnh Phú Yên) thu hoạch vào buổi sáng để điều chế cao chiết ethanol

Các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus,

Bacil-lus subtilis, Acetobacterium sp., Streptococus sp.,

Salmonella typhi, Escherichia coli vàPseudomonas aeruginosado phịng thí nghiệm Vi sinh (khoa Sinh học – Công nghệ Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG – HCM) cung cấp

ChủngAgrobacterium rhizogenesATCC 15834

mua từ ngân hàng RIKEN-BRC thông qua dự án MEXT Nhật Bản

Môi trường điều kiện nuôi cấy

Mơi trường Luria-Bertani (LB) có pH 7,0±0,1 dùng

để nuôi cấy chủng vi khuẩnS aureus,B subtilis,

Acetobacteriumsp.,Streptococussp.,S typhi,E coli

vàP aeruginosa Môi trường Yeast Mannitol Broth

(YMB) có pH 7,0±0,1 dùng để ni cấy vi khuẩnA.

rhizogenesATCC 15834 Môi trường Murashige and Skoog (MS) bổ sung đường sucrose 30 g/L, agar g/L

(2)

Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(1):975-983

và pH 5,80±0,05 dùng cho ni cấy mơ Tía tơ

Tất môi trường hấp khử trùng

15 phút nồi hấp nhiệt độ 121oC, atm.

Các chủng vi khuẩn tăng sinh mơi

trường lỏng thích hợp máy lắc 37oC, tốc độ lắc

130 vịng/phút khơng có ánh sáng Các mẫu mơ thực vật ni phịng ni cấy nhiệt độ 25oC.

Phương pháp điều chế cao chiết ethanol

Phương pháp điều chế cao chiết ethanol thực

hiện theo Basri Fan (2005)7, có số thay

đổi Mỗi quan rễ, thân Tía tơ sau thu

hoạch sấy khơ 37oC trọng lượng

không thay đổi Sau đó, 500 gam bột khơ quan ngâm chìm lít ethanol nhiệt độ phòng Sau 48 ngâm, dịch chiết quan lọc qua giấy lọc Whatman Phần bã thực vật lại tiếp tục sử dụng cho lần chiết kế tiếp, lần chiết sử dụng lít ethanol ngâm 48 Tồn dịch chiết thu sau lần chiết

cô đặc lại thiết bị cô quay chân không 50oC,

thu cao chiết ethanol (cao chiết thô) Cao chiết ethanol quan làm khô tủ Hood (ở nhiệt độ phòng) đạt khối lượng không đổi

Phương pháp DPPH

Hoạt tính kháng oxi hóa cao chiết ethanol đánh giá cách sử dụng phương pháp DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl hydrate)

Brand-Williams cộng sự8, có số biến đổi Hoà

0,5 mL cao chiết ethanol nồng độ khác (mg/mL) vào 3,5 mL dung dịch DPPH 0,09 mM (pha ethanol) Ethanol vitamin C tương ứng sử dụng chứng âm chứng dương phản ứng Dung dịch giữ điều kiện tối 30 phút, nhiệt độ phịng Sau đó, độ hấp thụ dung dịch đo bước sóng 517 nm Hoạt tính kháng oxi hóa biểu thị % ức chế DPPH theo cơng

thức [(Ao– Am)/Ao]×100%, Aolà độ hấp

thụ mẫu chứng âm Amlà độ hấp thụ mẫu

thử nghiệm

Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

Phương pháp đục lỗ thạch9được sử dụng để khảo

sát hoạt tính kháng khuẩn (khángS aureus,B

sub-tilis,Acetobacteriumsp.,Streptococussp.,S typhi,E. coli vàP aeruginosa) cao chiết ethanol từ Tía tơ Mơi trường LB-agar (LB bổ sung 15 gam agar,

pH 7,0±0,1) chuẩn bị đĩa vô trùng

cho thử nghiệm Dịch khuẩn hoạt hóa môi trường LB lỏng qua đêm, điều chỉnh độ

đục cho giá trị OD620= 0,10±0,01 (tương đương

108tế bào vi khuẩn/mL) Vi khuẩn trải

bề mặt đĩa mơi trường (100µl/đĩa) trước đục lỗ

thạch cách sử dụng que trải vô trùng Cao chiết ethanol quan (rễ, thân lá) Tía tơ pha DMSO 10% để đạt đến nồng độ

mg/mL Sau đó, 50µl cao chiết thêm vào

mỗi lỗ thạch (mỗi lỗ thạch có đường kính mm cách 30 mm) Sau 24 khảo sát (ở

37oC, điều kiện hiếu khí), khả ức chế sự

phát triển vi khuẩn ghi nhận cách đo đường kính vịng vơ khuẩn (lấy đường kính vịng vơ khuẩn đo đĩa trừ đường kính lỗ thạch) theo đơn vị mm Chloramphenicol (1 mg/mL) DMSO 10% tương ứng sử dụng chứng dương chứng âm cho thử nghiệm

Phương pháp định tính hợp chất thứ cấp Định tính phenol10: cao chiết ethanol trộn với

2 mL dung dịch FeCl32% Sự xuất màu xanh

lam đen dung dịch cho thấy có phenol mẫu

Định tính flavonoid10:

Tác dụng với H2SO4 đậm đặc: nhỏ từ từ 0,5 mL

H2SO4đậm đặc vào mL dung dịch cao chiết ethanol

Nếu dung dịch xuất màu vàng đậm, cam, đỏ xanh đỏ sậm mẫu có chứa flavonoid Tác dụng với tác nhân kiềm: cao chiết ethanol hòa tan mL dung dịch NaOH 2% Màu vàng xuất dung dịch sau trở thành khơng màu thêm vài giọt acid lỗng chứng tỏ có hiện flavonoid mẫu

Định tính saponin10:cao chiết ethanol trộn với mL dung dịch HCl 0,1 N NaOH 0,1 N, lắc mạnh Sự hình thành cột bọt bền dấu hiệu cho thấy có diện saponin mẫu

Định tính steroid – triterpenoid10:

Phản ứng Rosenhein: hòa 0,2 mL acid tricloroacetic vào mL dung dịch cao chiết ethanol quan sát 20 phút Phản ứng dương tính (có saponin triterpenoid) dung dịch chuyển sang màu xanh dương

Định tính alkaloid10:và gam KI 100 mL nước cất) Sự xuất kết tủa màu nâu lơ lửng chứng minh diện alkaloid mẫu thử

Định tính glycoside10:

Phản ứng Salkowski: cao chiết ethanol trộn với

2 mL chloroform, sau đó, mL H2SO4đậm đặc

(3)

Phản ứng với thuốc thử Molisch: cao chiết ethanol

được trộn với mL H2SO4đậm đặc 0,5 mL dung

dịch thuốc thử Molisch (α-napthol 1%

resorci-nol 5%, dung môi etharesorci-nol 80%) Sự xuất vịng màu tím đỏ mặt phân cách hai dung dịch chứng tỏ mẫu thử có diện đường aldose ketose

Phương pháp khử trùng hạt tạo in vitro

Hạt Tía tơ rửa nước xà phịng 30 phút, khử trùng ethanol 70% 1,5 phút nước Javel 20% 15 phút Sau khử trùng bề mặt, hạt Tía tô rửa lần nước cất (đã hấp khử trùng), cấy trải hạt môi trường MS cho nảy mầm phịng ni cấy (cường độ ánh sáng 2500 lux, chiếu sáng 16 giờ/ngày)

Phương pháp cảm ứng tạo rễ tơ

Cây Tía tôin vitrosau 45±5 ngày nảy mầm

tách riêng quan (rễ, thân lá), tạo vết thương mẫu mô dao cấy, nhúng vào dịch khuẩn

A rhizogenesATCC 15834 (dịch khuẩn chuẩn

bị cách tăng sinh vi khuẩnA rhizogenesATCC

15834 môi trường YMB lỏng lắc

giá trị OD600của dịch khuẩn đạt 0,50±0,05)

một khoảng thời gian thích hợp Sau đó, mẫu mơ thấm bớt dịch khuẩn giấy thấm vô trùng đồng nuôi cấy môi trường MS (không chiếu sáng) khoảng thời gian thích hợp Sau thời kỳ đồng nuôi cấy, mẫu mô cấy chuyền sang mơi trường MS (có bổ sung 250 mg/L

ce-fotaxime) để loại bỏ vi khuẩn11 Các rễ mọc từ vị

trí vết thương giả định rễ tơ

Phần trăm số mẫu tạo rễ tơ (%) = ((Số mẫu tạo rễ tơ)/(Tổng số mẫu xâm nhiễm))x100%

Phương pháp PCR phát gen chuyển

Rễ tơ giả định thu nhận để tách DNA gen

theo phương pháp CTAB Doyle & Doyle12 Mỗi

phản ứng PCR tích 25µl (gồm 1U Taq

poly-merase, 0,5µM primer, 2µl DNA dung dịch đệm

1X cho phản ứng PCR) thiết lập để phát

các genrolBvàvirGvới trình tự primer liệt kê

Bảng1

Phản ứng PCR thực gồm giai đoạn:

giai đoạn biến tính ban đầu (95oC phút), 35

chu kỳ lặp lại (mỗi chu kỳ có bước: 94oC 0,5

phút, 54oC 0,5 phút 72oC phút) 1

giai đoạn kéo dài sau (72oC phút) Sản

phẩm thu sau kết thúc phản ứng PCR

phân tích gel agarose 1% (w/v) Bảng gel sau điện di nhuộm với ethidium bromide soi bàn đèn UV để phát diện phân đoạn DNA mục tiêu

Phương pháp xử lý số liệu thống kê

Mỗi thí nghiệm lặp lại lần (với số mẫu từ 30 đến 35 mẫu cho lần lặp lại) Kết xử lý thống kê phần mềm SPSS 20.0 (phân nhóm giá trị phương pháp Duncan với độ tin cậy 95%) trình bày dạng Giá trị trung bình

±Độ lệch chuẩn Đồ thị vẽ phần mềm

Microsoft Excel 2016

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Hoạt tính kháng oxi hóa cao chiết ethanol từ quan Tía tơ

Hoạt tính kháng oxi hóa cao chiết ethanol từ quan rễ, thân Tía tơ đánh giá

phương pháp DPPH Kết thu (Hình1) cho

thấy giá trị IC50ở cao chiết ethanol thân (3,30±

0,30 mg/mL) cao cao chiết ethanol rễ (2,16

±0,16 mg/ml) (1,30±0,63 mg/mL), điều

chứng tỏ hợp chất chiết dung môi ethanol từ rễ Tía tơ có hoạt tính kháng oxi hóa cao so với hợp chất chiết từ thân

Tía tơ lồi thực vật phổ biến Việt Nam châu Á Các nghiên cứu cho thấy Tía tơ nguồn nguyên

liệu tự nhiên chứa nhiều chất chống oxy hóa13–15 Li

và cộng (2014) chứng minh cao chiết ethanol từ

Tía tơ có khả bắt gốc tự DPPH với giá trị IC50

= 0,1482 mg/mL16 Trong đó, cao chiết methanol

của thân Tía tơ có khả bắt gốc tự

DPPH với giá trị IC50tương ứng 5,92µg/mL

7,97µg/mL17 Các kết kháng oxi hóa (ở cơng trình đề cập nghiên cứu này) cho thấy hoạt tính kháng oxi hóa Tía tơ phụ thuộc vào hợp chất thứ cấp tích lũy trồng vùng địa lý khác loại dung mơi dùng để chiết Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanol từ quan Tía tơ

Cao chiết ethanol từ quan Tía tơ thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn phương pháp đục lỗ thạch Kết cho thấy loại cao chiết ethanol từ quan Tía tơ có khả kháng

khuẩn (Bảng2và Hình2), với đường kính vịng kháng

khuẩn dao động từ khoảng 3,33 mm đến 7,50 mm Cao chiết Tía tơ có khả kháng khuẩn thấp

hơn (đối vớiS aureusvàStreptococussp.)

(4)

Bảng 1: Trình tự primer dùng để phát genrolBvàvirG

Gen Tên primer Trình tự primer (5’→3’)

rolB rolB F GCT CTT GCA GTG CTA GAT TT

rolB R GAA GGT GCA AGC TAC CTC TC

virG virG F TTA TCT GAG TGA AGT CGT CTC

virG R CGT CGC CTG AGA TTA AGT GTC

Hình 1:Khả bắt gốc tự DPPH (giá trị IC50) của cao chiết ethanol từ quan rễ, thân lá Tía tơ Ký hiệu a, b c thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mứcα= 0,05 loại cao chiết ethanol nhóm thí nghiệm.

của cao chiết từ rễ thân cao đáng kể so với lá,

cịn tính khángStreptococussp cao chiết từ rễ lại

cao đáng kể so với quan cịn lại Dung mơi DMSO 10% sử dụng để hịa tan cao chiết ln cho kết âm tính (khơng xuất vịng kháng khuẩn), cho thấy dung môi không ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn cao chiết thử nghiệm

Một số nghiên cứu trước cho thấy Tía tơ có hoạt tính kháng khuẩn Kim cộng (2007) nhận thấy cao chiết ethanol từ Tía tơ có hoạt tính kháng

S aureus,B subtilisvàP aeruginosa, khơng có

khả khángE coli18 Cao chiết ethanol thể

hiện hoạt tính kháng khuẩn yếu đối vớiAeromonas

hydrophilavàEdwardsiella ictaluri19 Như vậy, tùy thuộc vào lồi vi khuẩn mà cao chiết Tía tơ thể hoạt tính kháng khuẩn khác

Sự diện hợp chất thứ cấp trong cao chiết ethanol từ quan Tía tơ Cao chiết ethanol từ quan Tía tơ phân tích định tính hợp chất, kết cho thấy tất cao chiết có chứa phenol, flavonoid, saponin, glycoside alkaloid, triterpenoid có

(Bảng3) Thông thường, hợp chất thứ cấp

được biết có hoạt tính sinh học để bảo vệ thể thực vật chống chịu stress sinh học phi sinh học

Hoạt tính kháng oxi hóa Tía tơ cao quan cịn lại đóng góp triterpenoid diện (nhưng khơng có thân rễ)

Trong nghiên cứu in vitro, phenol, flavonoid,

saponin, triterpenoid alkaloid báo cáo

có hoạt tính kháng oxi hóa kháng khuẩn20,21 Hoạt

tính chống oxi hóa chất có khả cho nguyên tử hidro, electron tạo phức với ion

kim loại22–24, ngồi ra, chúng có khả làm thay

đổi tính thấm màng tế bào liên kết với enzyme để làm thay đổi số chức nội bào vi sinh vật, đó, chúng có hoạt tính kháng

khuẩn25–27 Như vậy, diện hợp chất

thứ cấp cao chiết ethanol tạo nên hoạt tính

kháng oxi hóa kháng khuẩnin vitro

Ảnh hưởng loại quan khác nhau đến hiệu tạo rễ tơ Tía tơ

Một cách thức để tăng cường sản xuất hợp chất thứ cấp nuôi cấy mô tế bào thực vật

sử dụngA rhizogenesđể cảm ứng tạo rễ tơ thực

vật Rễ tơ – sản phẩm chuyển gen tự nhiên bởiA.

rhizogenes– có khả tăng trưởng không giới hạn môi trường nuôi cấy mà khơng cần chất điều hịa sinh trưởng thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp tương đương chí lớn

mẹ28,29 Do đó, bước nghiên cứu này

đã tiến hành cảm ứng tạo rễ tơ Tía tơ chủng vi

khuẩnA rhizogenesATCC 15834 quan rễ,

thân Tía tơ (ngâm mẫu 20 phút đồng nuôi cấy 72 giờ) Kết cho thấy tất quan rễ, thân

và cảm ứng tạo rễ tơ (Bảng4và Hình3),

trong quan có khả tạo rễ tơ cao

(67,67±3,51% số mẫu cảm ứng tạo rễ tơ) Hiệu

tạo rễ tơ có phụ thuộc vào quan màA rhizogenes

xâm nhiễm, quan có hiệu xâm

nhiễm cao nhất30–32 Do đó, Tía tơ sử dụng

để làm vật liệu cho thí nghiệm

Ảnh hưởng thời gian ngâm mẫu trong dịch khuẩnA rhizogenesATCC 15834 đến hiệu tạo rễ tơ

Lá Tía tơ ngâm dịch khuẩnA rhizogenes

(5)

Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(1):975-983

Bảng 2: Đường kính vịng kháng khuẩn cao chiết ethanol từ quan rễ, thân Tía tơ Đường kính vịng kháng khuẩn (mm)

Chứng âm

Chứng dương Cao chiết ethanol rễ Cao chiết ethanol thân Cao chiết ethanol lá

– 26,83±0,58 7,33±0,29a 6,67±0,29a 5,67±0,76b

– 25,17±1,53 6,17±0,58a 4,83±0,29a 5,50±0,20a

– 22,50±0,87 4,33±1,53a 3,33±1,53a 3,50±0,50a

– 25,33±0,58 7,50±1,00a 5,00±1,32b 5,00±0,87b

– 22,50±1,00 4,83±0,76a 4,00±0,50a 4,83±1,04a

– 21,83±0,76 4,17±1,26a 3,83±1,26a 4,33±1,44a

– 22,67±1,53 3,83±2,36a 4,17±1,61a 4,17±0,58a

Ghi chú: ký hiệu a b thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mứcα= 0,05 loại cao chiết ethanol nhóm thí nghiệm

Hình 2: Khả kháng khuẩn cao chiết từ rễ (R), thân (T) (L) Tía tơ với loài vi khuẩnS aureus(A),B. subtilis (B),Acetobacteriumsp (C),Streptococussp (D),S typhi(E),E coli (F) vàP aeruginosa(G) khảo sát phương pháp đục lỗ thạch.Chloramphenicol đối chứng dương (+) DMSO 10% đối chứng âm (–) Thước đơn vị (thanh ngang màu trắng): cm

Bảng 3: Một số hợp chất có cao chiết ethanol từ quan rễ, thân Tía tơ Cao chiết ethanol của

rễ

Cao chiết ethanol thân Cao chiết ethanol lá

Phenol + + +

Flavonoid + + +

Saponin + + +

Triterpenoid – – +

Alkaloid + + +

Glycoside + + +

(6)

Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(1):975-983

Bảng 4: Tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ quan rễ, thân Tía tơ cảm ứng bằngAgrobacterium rhizogenes ATCC 15834

Cơ quan Rễ Thân Lá

Tỉ lệ mẫu tạo rễ tơ (%) 30,33±4,51c 53,33±3,06b 67,67±3,51a

Ghi chú: ký hiệu a, b c thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mứcα= 0,05 nghiệm thức nhóm thí nghiệm.

Hình 3: Sự tạo rễ tơ quan (A), thân (B) rễ (C) Tía tô cảm ứng bởiAgrobacterium rhizogenes ATCC 15834

Bảng 5: Phần trăm số mẫu tạo rễ tơ xử lý với vi khuẩnA rhizogenesATCC 15834 khoảng thời gian khác nhau

Thời gian ngâm mẫu (phút) 10 20 30

Tỉ lệ mẫu tạo rễ tơ (%) 6,67±1,15c 68,00±3,00a 22,67±1,53b

Ghi chú: ký hiệu a, b c thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mứcα= 0,05 nghiệm thức nhóm thí nghiệm.

(10, 20 30 phút) đồng nuôi cấy 72 Kết

(Bảng5) cho thấy ngâm mẫu 20 phút dịch

khuẩn hiệu tạo rễ tơ tốt (68,00±3,00 %

số mẫu tạo rễ tơ) Khi ngâm mẫu vào dịch khuẩn, tín hiệu giải phóng từ vị trí vết thương mẫu

giúp kích hoạt genvirtrong Ri-plasmid vi khuẩn

A rhizogenesATCC 15834, tạo điều kiện cho bám

của vi khuẩn lên vết thương mẫu Tía tơ33 Kết

quả nghiên cứu cho thấy 20 phút thời gian tốt

để ngâm mẫu Tía tơ dịch khuẩnA rhizogenes

ATCC 15834

Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu tạo rễ tơ

Lá Tía tơ sau tạo vết thương, ngâm dịch khuẩn 20 phút đồng nuôi cấy khoảng thời gian khác (24, 48, 72 96 giờ) Kết

(Bảng6) cho thấy đồng nuôi cấy 72 cho hiệu

quả tạo rễ tơ tốt (68,33±3,51 % số mẫu tạo rễ

tơ), đồng nuôi cấy 24 cho hiệu tạo rễ

tơ thấp (6,33±0,58 % số mẫu tạo rễ tơ) Các

kết thu chứng tỏ thời gian đồng ni cấy có ảnh hưởng đến hiệu tạo rễ tơ Sự chuyển T-DNA từ Ri-plasmid vào tế bào thực vật không hiệu thời gian đồng nuôi cấy ngắn (24 48 giờ),

ngược lại, đồng nuôi cấy dài (96 trở lên) gây tác động ngược đến việc tạo rễ tơ phát triển

mức vi khuẩn dẫn đến ức chế cạnh tranh34,35.

Chứng minh diện gen chuyển Khi thực phản ứng PCR cho DNA gen rễ tơ (được cảm ứng từ Tía tơ) với primer đặc

hiệu, kết PCR (Hình4) cho thấy có diện

của genrolB(423 bp) khơng có diện

của genvirG(1030 bp) Từ kết này, kết

luận rằng: T-DNA Ri-plasmid củaA rhizogenes

ATCC 15834 chèn thành công vào gen rễ tơ Tía tơ

KẾT LUẬN

Từ kết thí nghiệm, chúng tơi nhận thấy cao chiết ethanol từ quan Tía tơ có hoạt tính kháng oxi hóa hoạt tính kháng khuẩn Đồng thời, cao chiết ethanol chứa phenol, flavonoid, glycoside, saponin alkaloid định tính phản ứng đặc trưng, triterpenoid có Bên cạnh đó, quan rễ, thân Tía

tơ tạo rễ tơ cảm ứng bởiA

(7)

Bảng 6: Phần trăm số mẫu rễ tơ đồng nuôi cấy khoảng thời gian khác nhau

Thời gian đồng nuôi cấy (giờ) 24 48 72 96

Tỉ lệ mẫu tạo rễ tơ (%) 6,33±0,58d 17,33±2,31c 68,33±3,51a 50,33±6,81b

Ghi chú: ký hiệu a, b, c d thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mứcα= 0,05 nghiệm thức nhóm thí nghiệm.

Hình 4: Kết PCR sử dụng primer đặc cho gen rolB (423 bp) virG (1030 bp), đó: “–” đối chứng âm, “+” đối chứng dương “L” thang chuẩn 100 bp plus

cho hiệu tạo rễ tơ tốt Bằng primer đặc

hiệu cho genrol Bở phản ứng PCR, nghiên cứu

đã chứng minh genrol Bchèn thành công vào gen

rễ tơ Tía tơ Các kết làm tiền đề cho nghiên cứu việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy rễ tơ nhằm sản xuất hợp chất thứ cấp có giá trị

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl hydrate LB : Lysogeny broth

MS : Murashige and Skoog PCR : Polemerase chain reaction YMB : Yeast mannitol broth

XUNG ĐỘT LỢI ÍCH

Các tác giả tun bố họ khơng có xung đột lợi ích nghiên cứu

LỜI CẢM ƠN

Nghiên cứu tài trợ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM khuôn khổ đề tài cấp Trường mã số T2017-46

ĐÓNG GĨP CỦA CÁC TÁC GIẢ

Trà Đơng Phương đóng góp vào việc thu thập số liệu hoạt tính kháng oxi hóa, kháng khuẩn viết

thảo báo Lê Thị Mộng Vương đóng góp vào việc thu thập số liệu hoạt tính kháng oxi hóa, kháng khuẩn, định tính hợp chất thứ cấp cảm ứng tạo rễ tơ Qch Ngơ Diễm Phương đóng góp vào việc thu thập số liệu cảm ứng tạo rễ tơ góp ý chỉnh sửa thảo báo

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Lee JK, Kim NS Genetic diversity and relationships of cul-tivated and weedy types of Perilla frutescens collected from East Asia revealed by microsatellite markers Korean J Breed Sci 2007;39(4):491–499

2 Lee JK, Ohnishi O Geographic differentiation of morpholog-ical characters among Perilla crops and their weedy types in East Asia Breeding science 2001;51(4):247–255 Available from:https://doi.org/10.1270/jsbbs.51.247

3 Ahmed HM Ethnomedicinal, Phytochemical and Pharmaco-logical Investigations of Perilla frutescens (L.) Britt Molecules 2019;24(1):102 PMID:30597896 Available from:https://doi org/10.3390/molecules24010102

4 Thu DK Tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase hạ acid uric máu dịch chiết tía tơ (Perilla frutescens L.) Tạp chí Dược học 2018;57(11):65–67

5 Trinh HN, et al Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính chống oxy hóa in vitro cao chiết từ tía tô thu hái địa điểm khác Tạp chí Dược học 2019;59(5):47–51

6 Vân HTK, et al Nghiên cứu thành phần hóa học khảo sát hoạt tính sinh học tinh dầu tía tơ (Perilla frutescens (L.) Britt) Tạp chí Dược học 2019;59(9):65–68

7 Basri DF, Fan SH The potential of aqueous and acetone ex-tracts of galls of Quercus infectoria as antibacterial agents In-dian journal of Pharmacology 2005;37(1):26 Available from:

https://doi.org/10.4103/0253-7613.13851

8 Brand-Williams W, et al Use of a free radical method to eval-uate antioxidant activity LWT-Food science and Technology 1995;28(1):25–30 Available from: https://doi.org/10.1016/ S0023-6438(95)80008-5

9 Hufford CD, et al Two antimicrobial alkaloids from heart-wood of Liriodendron tulipifera L Journal of pharmaceutical sciences 1975;64(5):789–792 PMID:807704 Available from:

https://doi.org/10.1002/jps.2600640512

10 Phụng MKP Phương pháp cô lập hợp chất hữu NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh 2007;

11 Tra PD, et al Induction of Platycodon grandiflorum hairy roots through the mediation of four Agrobacterium rhizo-genes strains Science and Technology Development Journal 2016;19(4):64–75 Available from: https://doi.org/10.32508/ stdj.v19i4.624

12 Doyle JJ, Doyle JL A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochemical Bulllletin 1987;19:11 –15

13 Chou HJ, et al Comparative antioxidant properties of wa-ter extracts from different parts of Beefsteak plant (Perilla frutescens) Journal of Food & Drug Analysis 2009;17(6) Avail-able from:https://doi.org/10.38212/2224-6614.2581