Các kết quả kháng oxi hóa (ở các công trình đã đề cập và trong nghiên cứu này) cho thấy hoạt tính kháng oxi hóa của Tía tô phụ thuộc vào các hợp chất thứ cấp được tích lũy khi được trồng[r]
(1)TạpchíPháttriểnKhoahọcvàCơngnghệ–Khoa học Tự nhiên, 5(1):975-983 Open Access Full Text Article
1PTN Công nghệ Sinh học Phân tử, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
2
Khoa Sinh học – Công nghệ sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
Liên hệ
Quách Ngô Diễm Phương, Khoa Sinh học – Công nghệ sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
PTN Công nghệ Sinh học Phân tử, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Email: qndphuong@hcmus.edu.vn
Lịch sử
•Ngày nhận: 2020-05-28 •Ngày chấp nhận: 2020-12-21 •Ngày đăng: 2021-1-28 DOI: 10.32508/stdjns.v5i1.917
Bản quyền
© ĐHQG Tp.HCM.Đây báo công bố mở phát hành theo điều khoản the Creative Commons Attribution 4.0 International license
Hoạt tính kháng oxi hóa, kháng khuẩn cao chiết ethanol từ cây
tía tơ (Perilla frutescens) thử nghiệm cảm ứng tạo rễ tơ bằng
chủng vi khuẩnAgrobacterium rhizogenes
Trà Đông Phương1,2, Lê Thị Mộng Vương2, Quách Ngô Diễm Phương1,2,*
Use your smartphone to scan this QR code and download this article
TĨM TẮT
Tía tơ (Perilla frutescens) – lồi thực vật thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae) – sử dụng phổ biến y học cổ truyền để chữa nhiều loại bệnh thường gặp (cảm lạnh, đau đầu, ho, đầy bụng, chướng bụng, ngộ độc, …) chứa nhiều hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học Khi tiến hành điều chế cao ethanol từ quan rễ, thân khảo sát khả kháng oxi hóa phương pháp bắt gốc tự DPPH khả kháng khuẩn phương pháp đục lỗ thạch, kết cho thấy cao chiết ethanol từ quan Tía tơ có hoạt tính kháng oxi hóa kháng khuẩn Bằng phản ứng đặc trưng, tất cao chiết ethanol từ rễ, thân Tía tơ có chứa nhóm phenol, flavonoid, saponin, alkaloid glycoside, triterpenoid có Các hợp chất thứ cấp có liên quan đến hoạt tính kháng oxi hóa kháng khuẩn Tía tơ Bên cạnh đó, thử nghiệm khả cảm ứng tạo rễ tơ chủng vi khuẩnAgrobacterium rhizogenesATCC 15834 quan Tía tơ quan tạo rễ tơ tốt (67,67±3,51% số mẫu cảm ứng tạo rễ tơ) Hiệu tạo rễ tơ cao với thời gian ngâm mẫu 20 phút đồng nuôi cấy 72 Các kết tiền đề cho nghiên cứu liên quan đến nuôi cấy rễ tơ để thu nhận hợp chất có hoạt tính sinh học
Từ khoá:Hợp chất thứ cấp, kháng khuẩn, kháng oxi hóa, rễ tơ, Tía tơ
TỔNG QUAN
Tía tơ (Perilla frutescens) lồi thực vật thuộc
họ Hoa mơi (Lamiaceae) Tía tơ trồng chủ yếu nước châu Á từ 2000 năm trước loài trồng quan trọng nơng
nghiệp1,2 Ngồi việc dùng Tía tơ loại
thực phẩm thơng thường, Tía tơ cịn sử dụng loại thuốc y học cổ truyền châu Á để chữa nhiều loại bệnh thường gặp (cảm lạnh, đau đầu, ho, đầy bụng, chướng bụng, ngộ độc, …)
chứa nhiều hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học3
Tại Việt Nam, Tía tơ tập trung nghiên cứu để phát hợp chất thứ cấp
và hoạt tính sinh học tiềm năng4–6, có sự
khác hoạt tính sinh học lẫn hợp chất thứ cấp tích lũy Tía tơ trồng khu vực địa lý khác Do đó, nghiên cứu nhằm mục đích xác định hoạt tính kháng oxi hóa kháng khuẩn cao chiết ethanol từ Tía tơ trồng huyện Tây Hòa, tỉnh Phú Yên Đồng thời, nghiên cứu thử nghiệm cảm ứng tạo rễ tơ Tía tơ
với chủng vi khuẩnAgrobacterium rhizogenesATCC
15834 nhằm tạo tiền đề cho nghiên cứu lĩnh vực ni cấy rễ tơ Tía tơ để thu nhận hợp chất thứ cấp có giá trị
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu sinh học
Hạt giống Tía tơ mua từ cơng ty TNHH TM Trang Nơng Cây Tía tơ tháng tuổi (trồng thị trấn Phú Thứ, huyện Tây Hòa, tỉnh Phú Yên) thu hoạch vào buổi sáng để điều chế cao chiết ethanol
Các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus,
Bacil-lus subtilis, Acetobacterium sp., Streptococus sp.,
Salmonella typhi, Escherichia coli vàPseudomonas aeruginosado phịng thí nghiệm Vi sinh (khoa Sinh học – Công nghệ Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG – HCM) cung cấp
ChủngAgrobacterium rhizogenesATCC 15834
mua từ ngân hàng RIKEN-BRC thông qua dự án MEXT Nhật Bản
Môi trường điều kiện nuôi cấy
Mơi trường Luria-Bertani (LB) có pH 7,0±0,1 dùng
để nuôi cấy chủng vi khuẩnS aureus,B subtilis,
Acetobacteriumsp.,Streptococussp.,S typhi,E coli
vàP aeruginosa Môi trường Yeast Mannitol Broth
(YMB) có pH 7,0±0,1 dùng để ni cấy vi khuẩnA.
rhizogenesATCC 15834 Môi trường Murashige and Skoog (MS) bổ sung đường sucrose 30 g/L, agar g/L
(2)Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(1):975-983
và pH 5,80±0,05 dùng cho ni cấy mơ Tía tơ
Tất môi trường hấp khử trùng
15 phút nồi hấp nhiệt độ 121oC, atm.
Các chủng vi khuẩn tăng sinh mơi
trường lỏng thích hợp máy lắc 37oC, tốc độ lắc
130 vịng/phút khơng có ánh sáng Các mẫu mơ thực vật ni phịng ni cấy nhiệt độ 25oC.
Phương pháp điều chế cao chiết ethanol
Phương pháp điều chế cao chiết ethanol thực
hiện theo Basri Fan (2005)7, có số thay
đổi Mỗi quan rễ, thân Tía tơ sau thu
hoạch sấy khơ 37oC trọng lượng
không thay đổi Sau đó, 500 gam bột khơ quan ngâm chìm lít ethanol nhiệt độ phòng Sau 48 ngâm, dịch chiết quan lọc qua giấy lọc Whatman Phần bã thực vật lại tiếp tục sử dụng cho lần chiết kế tiếp, lần chiết sử dụng lít ethanol ngâm 48 Tồn dịch chiết thu sau lần chiết
cô đặc lại thiết bị cô quay chân không 50oC,
thu cao chiết ethanol (cao chiết thô) Cao chiết ethanol quan làm khô tủ Hood (ở nhiệt độ phòng) đạt khối lượng không đổi
Phương pháp DPPH
Hoạt tính kháng oxi hóa cao chiết ethanol đánh giá cách sử dụng phương pháp DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl hydrate)
Brand-Williams cộng sự8, có số biến đổi Hoà
0,5 mL cao chiết ethanol nồng độ khác (mg/mL) vào 3,5 mL dung dịch DPPH 0,09 mM (pha ethanol) Ethanol vitamin C tương ứng sử dụng chứng âm chứng dương phản ứng Dung dịch giữ điều kiện tối 30 phút, nhiệt độ phịng Sau đó, độ hấp thụ dung dịch đo bước sóng 517 nm Hoạt tính kháng oxi hóa biểu thị % ức chế DPPH theo cơng
thức [(Ao– Am)/Ao]×100%, Aolà độ hấp
thụ mẫu chứng âm Amlà độ hấp thụ mẫu
thử nghiệm
Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
Phương pháp đục lỗ thạch9được sử dụng để khảo
sát hoạt tính kháng khuẩn (khángS aureus,B
sub-tilis,Acetobacteriumsp.,Streptococussp.,S typhi,E. coli vàP aeruginosa) cao chiết ethanol từ Tía tơ Mơi trường LB-agar (LB bổ sung 15 gam agar,
pH 7,0±0,1) chuẩn bị đĩa vô trùng
cho thử nghiệm Dịch khuẩn hoạt hóa môi trường LB lỏng qua đêm, điều chỉnh độ
đục cho giá trị OD620= 0,10±0,01 (tương đương
108tế bào vi khuẩn/mL) Vi khuẩn trải
bề mặt đĩa mơi trường (100µl/đĩa) trước đục lỗ
thạch cách sử dụng que trải vô trùng Cao chiết ethanol quan (rễ, thân lá) Tía tơ pha DMSO 10% để đạt đến nồng độ
mg/mL Sau đó, 50µl cao chiết thêm vào
mỗi lỗ thạch (mỗi lỗ thạch có đường kính mm cách 30 mm) Sau 24 khảo sát (ở
37oC, điều kiện hiếu khí), khả ức chế sự
phát triển vi khuẩn ghi nhận cách đo đường kính vịng vơ khuẩn (lấy đường kính vịng vơ khuẩn đo đĩa trừ đường kính lỗ thạch) theo đơn vị mm Chloramphenicol (1 mg/mL) DMSO 10% tương ứng sử dụng chứng dương chứng âm cho thử nghiệm
Phương pháp định tính hợp chất thứ cấp Định tính phenol10: cao chiết ethanol trộn với
2 mL dung dịch FeCl32% Sự xuất màu xanh
lam đen dung dịch cho thấy có phenol mẫu
Định tính flavonoid10:
Tác dụng với H2SO4 đậm đặc: nhỏ từ từ 0,5 mL
H2SO4đậm đặc vào mL dung dịch cao chiết ethanol
Nếu dung dịch xuất màu vàng đậm, cam, đỏ xanh đỏ sậm mẫu có chứa flavonoid Tác dụng với tác nhân kiềm: cao chiết ethanol hòa tan mL dung dịch NaOH 2% Màu vàng xuất dung dịch sau trở thành khơng màu thêm vài giọt acid lỗng chứng tỏ có hiện flavonoid mẫu
Định tính saponin10:cao chiết ethanol trộn với mL dung dịch HCl 0,1 N NaOH 0,1 N, lắc mạnh Sự hình thành cột bọt bền dấu hiệu cho thấy có diện saponin mẫu
Định tính steroid – triterpenoid10:
Phản ứng Rosenhein: hòa 0,2 mL acid tricloroacetic vào mL dung dịch cao chiết ethanol quan sát 20 phút Phản ứng dương tính (có saponin triterpenoid) dung dịch chuyển sang màu xanh dương
Định tính alkaloid10:và gam KI 100 mL nước cất) Sự xuất kết tủa màu nâu lơ lửng chứng minh diện alkaloid mẫu thử
Định tính glycoside10:
Phản ứng Salkowski: cao chiết ethanol trộn với
2 mL chloroform, sau đó, mL H2SO4đậm đặc
(3)Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(1):975-983
Phản ứng với thuốc thử Molisch: cao chiết ethanol
được trộn với mL H2SO4đậm đặc 0,5 mL dung
dịch thuốc thử Molisch (α-napthol 1%
resorci-nol 5%, dung môi etharesorci-nol 80%) Sự xuất vịng màu tím đỏ mặt phân cách hai dung dịch chứng tỏ mẫu thử có diện đường aldose ketose
Phương pháp khử trùng hạt tạo in vitro
Hạt Tía tơ rửa nước xà phịng 30 phút, khử trùng ethanol 70% 1,5 phút nước Javel 20% 15 phút Sau khử trùng bề mặt, hạt Tía tô rửa lần nước cất (đã hấp khử trùng), cấy trải hạt môi trường MS cho nảy mầm phịng ni cấy (cường độ ánh sáng 2500 lux, chiếu sáng 16 giờ/ngày)
Phương pháp cảm ứng tạo rễ tơ
Cây Tía tôin vitrosau 45±5 ngày nảy mầm
tách riêng quan (rễ, thân lá), tạo vết thương mẫu mô dao cấy, nhúng vào dịch khuẩn
A rhizogenesATCC 15834 (dịch khuẩn chuẩn
bị cách tăng sinh vi khuẩnA rhizogenesATCC
15834 môi trường YMB lỏng lắc
giá trị OD600của dịch khuẩn đạt 0,50±0,05)
một khoảng thời gian thích hợp Sau đó, mẫu mơ thấm bớt dịch khuẩn giấy thấm vô trùng đồng nuôi cấy môi trường MS (không chiếu sáng) khoảng thời gian thích hợp Sau thời kỳ đồng nuôi cấy, mẫu mô cấy chuyền sang mơi trường MS (có bổ sung 250 mg/L
ce-fotaxime) để loại bỏ vi khuẩn11 Các rễ mọc từ vị
trí vết thương giả định rễ tơ
Phần trăm số mẫu tạo rễ tơ (%) = ((Số mẫu tạo rễ tơ)/(Tổng số mẫu xâm nhiễm))x100%
Phương pháp PCR phát gen chuyển
Rễ tơ giả định thu nhận để tách DNA gen
theo phương pháp CTAB Doyle & Doyle12 Mỗi
phản ứng PCR tích 25µl (gồm 1U Taq
poly-merase, 0,5µM primer, 2µl DNA dung dịch đệm
1X cho phản ứng PCR) thiết lập để phát
các genrolBvàvirGvới trình tự primer liệt kê
Bảng1
Phản ứng PCR thực gồm giai đoạn:
giai đoạn biến tính ban đầu (95oC phút), 35
chu kỳ lặp lại (mỗi chu kỳ có bước: 94oC 0,5
phút, 54oC 0,5 phút 72oC phút) 1
giai đoạn kéo dài sau (72oC phút) Sản
phẩm thu sau kết thúc phản ứng PCR
phân tích gel agarose 1% (w/v) Bảng gel sau điện di nhuộm với ethidium bromide soi bàn đèn UV để phát diện phân đoạn DNA mục tiêu
Phương pháp xử lý số liệu thống kê
Mỗi thí nghiệm lặp lại lần (với số mẫu từ 30 đến 35 mẫu cho lần lặp lại) Kết xử lý thống kê phần mềm SPSS 20.0 (phân nhóm giá trị phương pháp Duncan với độ tin cậy 95%) trình bày dạng Giá trị trung bình
±Độ lệch chuẩn Đồ thị vẽ phần mềm
Microsoft Excel 2016
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Hoạt tính kháng oxi hóa cao chiết ethanol từ quan Tía tơ
Hoạt tính kháng oxi hóa cao chiết ethanol từ quan rễ, thân Tía tơ đánh giá
phương pháp DPPH Kết thu (Hình1) cho
thấy giá trị IC50ở cao chiết ethanol thân (3,30±
0,30 mg/mL) cao cao chiết ethanol rễ (2,16
±0,16 mg/ml) (1,30±0,63 mg/mL), điều
chứng tỏ hợp chất chiết dung môi ethanol từ rễ Tía tơ có hoạt tính kháng oxi hóa cao so với hợp chất chiết từ thân
Tía tơ lồi thực vật phổ biến Việt Nam châu Á Các nghiên cứu cho thấy Tía tơ nguồn nguyên
liệu tự nhiên chứa nhiều chất chống oxy hóa13–15 Li
và cộng (2014) chứng minh cao chiết ethanol từ
Tía tơ có khả bắt gốc tự DPPH với giá trị IC50
= 0,1482 mg/mL16 Trong đó, cao chiết methanol
của thân Tía tơ có khả bắt gốc tự
DPPH với giá trị IC50tương ứng 5,92µg/mL
7,97µg/mL17 Các kết kháng oxi hóa (ở cơng trình đề cập nghiên cứu này) cho thấy hoạt tính kháng oxi hóa Tía tơ phụ thuộc vào hợp chất thứ cấp tích lũy trồng vùng địa lý khác loại dung mơi dùng để chiết Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanol từ quan Tía tơ
Cao chiết ethanol từ quan Tía tơ thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn phương pháp đục lỗ thạch Kết cho thấy loại cao chiết ethanol từ quan Tía tơ có khả kháng
khuẩn (Bảng2và Hình2), với đường kính vịng kháng
khuẩn dao động từ khoảng 3,33 mm đến 7,50 mm Cao chiết Tía tơ có khả kháng khuẩn thấp
hơn (đối vớiS aureusvàStreptococussp.)
(4)Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(1):975-983
Bảng 1: Trình tự primer dùng để phát genrolBvàvirG
Gen Tên primer Trình tự primer (5’→3’)
rolB rolB F GCT CTT GCA GTG CTA GAT TT
rolB R GAA GGT GCA AGC TAC CTC TC
virG virG F TTA TCT GAG TGA AGT CGT CTC
virG R CGT CGC CTG AGA TTA AGT GTC
Hình 1:Khả bắt gốc tự DPPH (giá trị IC50) của cao chiết ethanol từ quan rễ, thân lá Tía tơ Ký hiệu a, b c thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mứcα= 0,05 loại cao chiết ethanol nhóm thí nghiệm.
của cao chiết từ rễ thân cao đáng kể so với lá,
cịn tính khángStreptococussp cao chiết từ rễ lại
cao đáng kể so với quan cịn lại Dung mơi DMSO 10% sử dụng để hịa tan cao chiết ln cho kết âm tính (khơng xuất vịng kháng khuẩn), cho thấy dung môi không ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn cao chiết thử nghiệm
Một số nghiên cứu trước cho thấy Tía tơ có hoạt tính kháng khuẩn Kim cộng (2007) nhận thấy cao chiết ethanol từ Tía tơ có hoạt tính kháng
S aureus,B subtilisvàP aeruginosa, khơng có
khả khángE coli18 Cao chiết ethanol thể
hiện hoạt tính kháng khuẩn yếu đối vớiAeromonas
hydrophilavàEdwardsiella ictaluri19 Như vậy, tùy thuộc vào lồi vi khuẩn mà cao chiết Tía tơ thể hoạt tính kháng khuẩn khác
Sự diện hợp chất thứ cấp trong cao chiết ethanol từ quan Tía tơ Cao chiết ethanol từ quan Tía tơ phân tích định tính hợp chất, kết cho thấy tất cao chiết có chứa phenol, flavonoid, saponin, glycoside alkaloid, triterpenoid có
(Bảng3) Thông thường, hợp chất thứ cấp
được biết có hoạt tính sinh học để bảo vệ thể thực vật chống chịu stress sinh học phi sinh học
Hoạt tính kháng oxi hóa Tía tơ cao quan cịn lại đóng góp triterpenoid diện (nhưng khơng có thân rễ)
Trong nghiên cứu in vitro, phenol, flavonoid,
saponin, triterpenoid alkaloid báo cáo
có hoạt tính kháng oxi hóa kháng khuẩn20,21 Hoạt
tính chống oxi hóa chất có khả cho nguyên tử hidro, electron tạo phức với ion
kim loại22–24, ngồi ra, chúng có khả làm thay
đổi tính thấm màng tế bào liên kết với enzyme để làm thay đổi số chức nội bào vi sinh vật, đó, chúng có hoạt tính kháng
khuẩn25–27 Như vậy, diện hợp chất
thứ cấp cao chiết ethanol tạo nên hoạt tính
kháng oxi hóa kháng khuẩnin vitro
Ảnh hưởng loại quan khác nhau đến hiệu tạo rễ tơ Tía tơ
Một cách thức để tăng cường sản xuất hợp chất thứ cấp nuôi cấy mô tế bào thực vật
sử dụngA rhizogenesđể cảm ứng tạo rễ tơ thực
vật Rễ tơ – sản phẩm chuyển gen tự nhiên bởiA.
rhizogenes– có khả tăng trưởng không giới hạn môi trường nuôi cấy mà khơng cần chất điều hịa sinh trưởng thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp tương đương chí lớn
mẹ28,29 Do đó, bước nghiên cứu này
đã tiến hành cảm ứng tạo rễ tơ Tía tơ chủng vi
khuẩnA rhizogenesATCC 15834 quan rễ,
thân Tía tơ (ngâm mẫu 20 phút đồng nuôi cấy 72 giờ) Kết cho thấy tất quan rễ, thân
và cảm ứng tạo rễ tơ (Bảng4và Hình3),
trong quan có khả tạo rễ tơ cao
(67,67±3,51% số mẫu cảm ứng tạo rễ tơ) Hiệu
tạo rễ tơ có phụ thuộc vào quan màA rhizogenes
xâm nhiễm, quan có hiệu xâm
nhiễm cao nhất30–32 Do đó, Tía tơ sử dụng
để làm vật liệu cho thí nghiệm
Ảnh hưởng thời gian ngâm mẫu trong dịch khuẩnA rhizogenesATCC 15834 đến hiệu tạo rễ tơ
Lá Tía tơ ngâm dịch khuẩnA rhizogenes
(5)Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(1):975-983
Bảng 2: Đường kính vịng kháng khuẩn cao chiết ethanol từ quan rễ, thân Tía tơ Đường kính vịng kháng khuẩn (mm)
Chứng âm
Chứng dương Cao chiết ethanol rễ Cao chiết ethanol thân Cao chiết ethanol lá
– 26,83±0,58 7,33±0,29a 6,67±0,29a 5,67±0,76b
– 25,17±1,53 6,17±0,58a 4,83±0,29a 5,50±0,20a
– 22,50±0,87 4,33±1,53a 3,33±1,53a 3,50±0,50a
– 25,33±0,58 7,50±1,00a 5,00±1,32b 5,00±0,87b
– 22,50±1,00 4,83±0,76a 4,00±0,50a 4,83±1,04a
– 21,83±0,76 4,17±1,26a 3,83±1,26a 4,33±1,44a
– 22,67±1,53 3,83±2,36a 4,17±1,61a 4,17±0,58a
Ghi chú: ký hiệu a b thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mứcα= 0,05 loại cao chiết ethanol nhóm thí nghiệm
Hình 2: Khả kháng khuẩn cao chiết từ rễ (R), thân (T) (L) Tía tơ với loài vi khuẩnS aureus(A),B. subtilis (B),Acetobacteriumsp (C),Streptococussp (D),S typhi(E),E coli (F) vàP aeruginosa(G) khảo sát phương pháp đục lỗ thạch.Chloramphenicol đối chứng dương (+) DMSO 10% đối chứng âm (–) Thước đơn vị (thanh ngang màu trắng): cm
Bảng 3: Một số hợp chất có cao chiết ethanol từ quan rễ, thân Tía tơ Cao chiết ethanol của
rễ
Cao chiết ethanol thân Cao chiết ethanol lá
Phenol + + +
Flavonoid + + +
Saponin + + +
Triterpenoid – – +
Alkaloid + + +
Glycoside + + +
(6)Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(1):975-983
Bảng 4: Tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ quan rễ, thân Tía tơ cảm ứng bằngAgrobacterium rhizogenes ATCC 15834
Cơ quan Rễ Thân Lá
Tỉ lệ mẫu tạo rễ tơ (%) 30,33±4,51c 53,33±3,06b 67,67±3,51a
Ghi chú: ký hiệu a, b c thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mứcα= 0,05 nghiệm thức nhóm thí nghiệm.
Hình 3: Sự tạo rễ tơ quan (A), thân (B) rễ (C) Tía tô cảm ứng bởiAgrobacterium rhizogenes ATCC 15834
Bảng 5: Phần trăm số mẫu tạo rễ tơ xử lý với vi khuẩnA rhizogenesATCC 15834 khoảng thời gian khác nhau
Thời gian ngâm mẫu (phút) 10 20 30
Tỉ lệ mẫu tạo rễ tơ (%) 6,67±1,15c 68,00±3,00a 22,67±1,53b
Ghi chú: ký hiệu a, b c thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mứcα= 0,05 nghiệm thức nhóm thí nghiệm.
(10, 20 30 phút) đồng nuôi cấy 72 Kết
(Bảng5) cho thấy ngâm mẫu 20 phút dịch
khuẩn hiệu tạo rễ tơ tốt (68,00±3,00 %
số mẫu tạo rễ tơ) Khi ngâm mẫu vào dịch khuẩn, tín hiệu giải phóng từ vị trí vết thương mẫu
giúp kích hoạt genvirtrong Ri-plasmid vi khuẩn
A rhizogenesATCC 15834, tạo điều kiện cho bám
của vi khuẩn lên vết thương mẫu Tía tơ33 Kết
quả nghiên cứu cho thấy 20 phút thời gian tốt
để ngâm mẫu Tía tơ dịch khuẩnA rhizogenes
ATCC 15834
Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu tạo rễ tơ
Lá Tía tơ sau tạo vết thương, ngâm dịch khuẩn 20 phút đồng nuôi cấy khoảng thời gian khác (24, 48, 72 96 giờ) Kết
(Bảng6) cho thấy đồng nuôi cấy 72 cho hiệu
quả tạo rễ tơ tốt (68,33±3,51 % số mẫu tạo rễ
tơ), đồng nuôi cấy 24 cho hiệu tạo rễ
tơ thấp (6,33±0,58 % số mẫu tạo rễ tơ) Các
kết thu chứng tỏ thời gian đồng ni cấy có ảnh hưởng đến hiệu tạo rễ tơ Sự chuyển T-DNA từ Ri-plasmid vào tế bào thực vật không hiệu thời gian đồng nuôi cấy ngắn (24 48 giờ),
ngược lại, đồng nuôi cấy dài (96 trở lên) gây tác động ngược đến việc tạo rễ tơ phát triển
mức vi khuẩn dẫn đến ức chế cạnh tranh34,35.
Chứng minh diện gen chuyển Khi thực phản ứng PCR cho DNA gen rễ tơ (được cảm ứng từ Tía tơ) với primer đặc
hiệu, kết PCR (Hình4) cho thấy có diện
của genrolB(423 bp) khơng có diện
của genvirG(1030 bp) Từ kết này, kết
luận rằng: T-DNA Ri-plasmid củaA rhizogenes
ATCC 15834 chèn thành công vào gen rễ tơ Tía tơ
KẾT LUẬN
Từ kết thí nghiệm, chúng tơi nhận thấy cao chiết ethanol từ quan Tía tơ có hoạt tính kháng oxi hóa hoạt tính kháng khuẩn Đồng thời, cao chiết ethanol chứa phenol, flavonoid, glycoside, saponin alkaloid định tính phản ứng đặc trưng, triterpenoid có Bên cạnh đó, quan rễ, thân Tía
tơ tạo rễ tơ cảm ứng bởiA
(7)Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(1):975-983
Bảng 6: Phần trăm số mẫu rễ tơ đồng nuôi cấy khoảng thời gian khác nhau
Thời gian đồng nuôi cấy (giờ) 24 48 72 96
Tỉ lệ mẫu tạo rễ tơ (%) 6,33±0,58d 17,33±2,31c 68,33±3,51a 50,33±6,81b
Ghi chú: ký hiệu a, b, c d thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mứcα= 0,05 nghiệm thức nhóm thí nghiệm.
Hình 4: Kết PCR sử dụng primer đặc cho gen rolB (423 bp) virG (1030 bp), đó: “–” đối chứng âm, “+” đối chứng dương “L” thang chuẩn 100 bp plus
cho hiệu tạo rễ tơ tốt Bằng primer đặc
hiệu cho genrol Bở phản ứng PCR, nghiên cứu
đã chứng minh genrol Bchèn thành công vào gen
rễ tơ Tía tơ Các kết làm tiền đề cho nghiên cứu việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy rễ tơ nhằm sản xuất hợp chất thứ cấp có giá trị
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CTAB : Cetyl trimethylammonium bromide DMSO : Dimethyl sulfoxide
DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl hydrate LB : Lysogeny broth
MS : Murashige and Skoog PCR : Polemerase chain reaction YMB : Yeast mannitol broth XUNG ĐỘT LỢI ÍCH
Các tác giả tun bố họ khơng có xung đột lợi ích nghiên cứu
LỜI CẢM ƠN
Nghiên cứu tài trợ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM khuôn khổ đề tài cấp Trường mã số T2017-46
ĐÓNG GĨP CỦA CÁC TÁC GIẢ
Trà Đơng Phương đóng góp vào việc thu thập số liệu hoạt tính kháng oxi hóa, kháng khuẩn viết
thảo báo Lê Thị Mộng Vương đóng góp vào việc thu thập số liệu hoạt tính kháng oxi hóa, kháng khuẩn, định tính hợp chất thứ cấp cảm ứng tạo rễ tơ Qch Ngơ Diễm Phương đóng góp vào việc thu thập số liệu cảm ứng tạo rễ tơ góp ý chỉnh sửa thảo báo
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Lee JK, Kim NS Genetic diversity and relationships of cul-tivated and weedy types of Perilla frutescens collected from East Asia revealed by microsatellite markers Korean J Breed Sci 2007;39(4):491–499
2 Lee JK, Ohnishi O Geographic differentiation of morpholog-ical characters among Perilla crops and their weedy types in East Asia Breeding science 2001;51(4):247–255 Available from:https://doi.org/10.1270/jsbbs.51.247
3 Ahmed HM Ethnomedicinal, Phytochemical and Pharmaco-logical Investigations of Perilla frutescens (L.) Britt Molecules 2019;24(1):102 PMID:30597896 Available from:https://doi org/10.3390/molecules24010102
4 Thu DK Tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase hạ acid uric máu dịch chiết tía tơ (Perilla frutescens L.) Tạp chí Dược học 2018;57(11):65–67
5 Trinh HN, et al Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính chống oxy hóa in vitro cao chiết từ tía tô thu hái địa điểm khác Tạp chí Dược học 2019;59(5):47–51
6 Vân HTK, et al Nghiên cứu thành phần hóa học khảo sát hoạt tính sinh học tinh dầu tía tơ (Perilla frutescens (L.) Britt) Tạp chí Dược học 2019;59(9):65–68
7 Basri DF, Fan SH The potential of aqueous and acetone ex-tracts of galls of Quercus infectoria as antibacterial agents In-dian journal of Pharmacology 2005;37(1):26 Available from:
https://doi.org/10.4103/0253-7613.13851
8 Brand-Williams W, et al Use of a free radical method to eval-uate antioxidant activity LWT-Food science and Technology 1995;28(1):25–30 Available from: https://doi.org/10.1016/ S0023-6438(95)80008-5
9 Hufford CD, et al Two antimicrobial alkaloids from heart-wood of Liriodendron tulipifera L Journal of pharmaceutical sciences 1975;64(5):789–792 PMID:807704 Available from:
https://doi.org/10.1002/jps.2600640512
10 Phụng MKP Phương pháp cô lập hợp chất hữu NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh 2007;
11 Tra PD, et al Induction of Platycodon grandiflorum hairy roots through the mediation of four Agrobacterium rhizo-genes strains Science and Technology Development Journal 2016;19(4):64–75 Available from: https://doi.org/10.32508/ stdj.v19i4.624
12 Doyle JJ, Doyle JL A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochemical Bulllletin 1987;19:11 –15
13 Chou HJ, et al Comparative antioxidant properties of wa-ter extracts from different parts of Beefsteak plant (Perilla frutescens) Journal of Food & Drug Analysis 2009;17(6) Avail-able from:https://doi.org/10.38212/2224-6614.2581
https://doi.org/10.1270/jsbbs.51.247 30597896 https://doi.org/10.3390/molecules24010102 https://doi.org/10.4103/0253-7613.13851 https://doi.org/10.1016/S0023-6438(95)80008-5 807704 https://doi.org/10.1002/jps.2600640512. https://doi.org/10.32508/stdj.v19i4.624 https://doi.org/10.38212/2224-6614.2581