Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và khả năng trị tiêu chảy của cao chiết ethanol từ cây elephantopus sp ​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐ T NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG TRỊ TIÊU CHẢY CỦA CAO CHIẾT ETHANOL TỪ CÂY ELEPHANTOPUS SP Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn : ThS Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực MSSV: 1151110051 : Trƣơng Thị Minh Hiền Lớp: 11DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2015 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đồ án nghiên cứu riêng đƣợc thực sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dƣới hƣớng dẫn ThS Phạm Minh Nhựt Các số liệu, kết đồ án trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình nghiên cứu khác Tơi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan Tp Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng năm 2015 Sinh viên Trƣơng Thị Minh Hiền Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Trƣớc hết, em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, ngƣời giúp đỡ, định hƣớng tận tình hƣớng dẫn em suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Cảm ơn thầy truyền đạt cho em nhiều kiến thức kinh nghiệm quý báu Em xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM, quý thầy cô giảng dạy làm việc Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trƣờng truyền dạy nhiều kiến thức tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành đề tài tốt nghiệp Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè anh chị ln động viên giúp đỡ em vƣợt qua khó khăn suốt thời gian học tập nghiên cứu Tp Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng năm 2015 Sinh viên Trƣơng Thị Minh Hiền Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Trang MỤC LỤC i DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC HÌNH vii DANH SÁCH CÁC BẢNG ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục đích nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Elephantopus sp 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Phân loại khoa học 1.1.3 Đặc điểm phân bố 1.1.4 Thành phần hóa học thƣờng có thực vật 1.1.4.1 Alkaloid 1.1.4.2 Carbohydrate 1.1.4.3 Flavonoid 1.1.4.4 Tannin 1.1.4.5 Hợp chất phenolic 10 1.1.4.6 Glycoside 11 1.1.4.7 Steroid 14 1.1.5 Công dụng 15 1.2 Tổng quan chế kháng khuẩn hợp chất thực vật 16 1.2.1 Khái niệm hoạt tính kháng khuẩn 16 1.2.2 Cơ chế kháng khuẩn 16 1.2.3 Tình hình nghiên cứu kháng khuẩn thực vật giới Việt Nam i Đồ án tốt nghiệp 19 1.2.3.1 Tình hình kháng khuẩn Thế Giới 19 1.2.3.2 Tình hình kháng khuẩn Việt Nam 20 1.3 Giới thiệu bệnh tiêu chảy 20 1.3.1 Khái niệm 20 1.3.2 Nguyên nhân gây bệnh 21 1.3.2.1 Do virus 21 1.3.2.2 Do vi khuẩn 22 1.3.2.3 Do ký sinh trùng 22 1.3.2.4 Do nguyên nhân khác 23 1.3.3 Cơ chế gây bệnh tiêu chảy 23 1.3.3.1 Tiêu chảy thẩm thấu 23 1.3.3.2 Tiêu chảy xuất tiết 24 1.3.3.3 Tiêu chảy tăng nhu động ruột 24 1.3.3.4 Tiêu chảy tổn thƣơng niêm mạc ruột 24 1.4 Đặc điểm số vi sinh vật gây bệnh tiêu chảy điển hình 24 1.4.1 Nhóm vi khuẩn Escherichia coli 24 1.4.1.1 Đặc điểm 25 1.4.1.2 Độc tính 25 1.4.2 Nhóm vi khuẩn Salmonella spp 26 1.4.2.1 Đặc điểm 26 1.4.2.2 Độc tính 27 1.4.3.Nhóm vi khuẩn Shigella spp 27 1.4.3.1 Đặc điểm 27 1.4.3.2 Độc tính 28 1.4.4 Nhóm vi khuẩn Vibrio spp 28 1.4.4.1 Đặc điểm 28 1.4.4.2 Độc tính 29 1.5 Một số mơ hình đánh giá hiệu trị tiêu chảy thực vật động vật ii Đồ án tốt nghiệp 30 1.5.1 Mơ hình đánh giá khả trị tiêu chảy 30 1.5.1.1 Mơ hình castor oil 30 1.5.1.2 Mô hình magnesium sulfate (MgSO4) 31 1.5.1.3 Mơ hình serotonin 31 1.5.2 Mơ hình khảo sát enteropooling 32 1.5.2.1 Mơ hình prostaglandin E2 32 1.5.2.2 Mô hình irinotecan 33 1.5.2.3 Mơ hình sử dụng Heat-labile toxin 33 1.5.2.4 Mơ hình castor oil 34 1.5.3 Mơ hình khảo sát di chuyển ruột non 34 1.5.3.1 Mơ hình castor oil 35 1.5.3.2 Mơ hình prostaglandin E2 35 1.5.3.3 Mơ hình irinotecan 35 CHƢƠNG NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 Địa điểm thời gian 36 2.1.1 Địa điểm thu mẫu 36 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 36 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 36 2.2 Vật liệu 36 2.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 36 2.2.2 Vật liệu nghiên cứu 36 2.2.2.1 Vi sinh vật thị 36 2.2.2.2 Động vật thí nghiệm 36 2.2.3 Mơi trƣờng, hóa chất thuốc 37 2.2.4 Dụng cụ thiết bị 37 2.2.4.1 Dụng cụ 37 2.2.4.2 Thiết bị 37 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 37 iii Đồ án tốt nghiệp 2.3.1 Phƣơng pháp tách chiết hợp chất từ thực vật 37 2.3.2 Phƣơng pháp tăng sinh vi sinh vật thị 38 2.3.3 Phƣơng pháp cấy truyền giữ giống vi sinh vật 38 2.3.4 Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào 39 2.3.5 Phƣơng pháp pha loãng mẫu 39 2.3.6 Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết 39 2.3.7 Phƣơng pháp gây tiêu chảy castor oil mơ hình chuột 40 2.3.8 Phƣơng pháp đánh giá khả di chuyển ruột 40 2.3.9 Phƣơng pháp khảo sát enteropooling 41 2.3.10 Phƣơng pháp xử lý số liệu 41 2.4 Bố trí thí nghiệm 42 2.4.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu quy trình tách chiết cao ethanol 70% từ Elephantopus sp 42 2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn EEE 43 2.4.3 Đánh giá độc tính EEE mơ hình chuột 45 2.4.4 Thí nghiệm 3: Đánh giá hiệu trị tiêu chảy EEE mơ hình chuột 45 2.4.4.1 Chuẩn bị chuột trƣớc thí nghiệm 45 2.4.4.2 Thí nghiệm 3.1: Thử nghiệm khả trị tiêu chảy EEE mơ hình chuột 45 2.4.4.3 Thí nghiệm 3.2: Thử nghiệm enteropooling 46 2.4.4.4 Thí nghiệm 3.3: Khảo sát di chuyển ruột non 46 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 3.1 Kết hiệu suất thu hồi cao 48 3.2 Kết đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanol 70% nhóm vi khuẩn gây tiêu chảy 48 3.2.1 Kết mức độ kháng khuẩn nhóm Vibrio spp EEE 49 3.2.2 Kết kháng khuẩn vi khuẩn khác 50 3.3 Kết đánh giá độc tính cao ethanol 70% mơ hình chuột 53 iv Đồ án tốt nghiệp 3.4 Kết đánh giá hiệu trị tiêu chảy cao ethanol 70% mơ hình chuột 54 3.4.1 Kết đánh giá khả trị tiêu chảy EEE dầu thầu dầu mơ hình chuột 54 3.4.2 Kết thử nghiệm enteropooling 57 3.4.3 Kết khả di chuyển ruột non 60 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 65 4.1 Kết luận 65 4.2 Đề nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ HIỆU SUẤT THU HỒI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ VỀ KHẢ NĂNG TRỊ TIÊU CHẢY TRÊN MƠ HÌNH CHUỘT v Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATP: Andenozin Triphotphat cAMP: Cyclic Adenosine Monophosphate Cip 500: Ciprofloxacin 500 µg/ml Cip 8: Ciprofloxacin µg/ml DNA: Deoxyribo Nucleic Acid EEE: Ethanolic extract of Elephantopus sp EHEC: Enterohaemorrhagic E.coli ETEC: Enterotoxigenic E.coli HUS: Haemolytic Uraemic Syndrom PABA: p Aminobenzoic Acid SD: Standard Deviation STEC: Shiga Toxin-producing E.coli vi Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình thái Elephantopus sp (Mercadante, 2013) Hình 1.2 Một số loại alkaloid (A) Samandarin, (B) Samanin Hình 1.3 Cấu trúc chung flavonoid (A) dạng flavonoid, (B) Euflavonoid, (C) Isoflavonoid, (D) Neoflavonoid Hình 1.4 Caffeic acid Hình 1.5 Những vị trí vi khuẩn bị tác động hợp chất thực vật (Burt, 2004) Hình 1.6 Cơ sở đánh giá loại phân (Thompson, 2006) Hình 1.7 Hình thái Rotavirus (De Junio Del, 2013) Hình 1.8 E.coli quan sát dƣới kính hiển vi với kích thƣớc µm (Bact, 2005) Hình 1.9 Hình thái vi khuẩn Salmonella spp (Taragui, 2005) Hình 1.10 Hình thái vi khuẩn Shigella spp (Reynolds, 2011) Hình 1.11 Hình thái vi khuẩn Vibrio spp (Microscopy, 2004) Hình 2.1 Phƣơng pháp pha lỗng mẫu Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Hình 2.3 Quy trình tách chiết cao EEE Hình 2.4 Quy trình đánh giá hoạt tính kháng khuẩn EEE vi khuẩn thị Hình 3.1 Dịch Elephantopus sp qua lần ngâm ethanol 70% Hình 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn EEE Ciprofloxacin nhóm Vibrio spp.49 Hình 3.3 Đƣờng kính vịng ức chế EEE V.alginolyticus Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn EEE kháng sinh Ciprofloxacin chủng vi khuẩn khác Hình 3.5 Đƣờng kính vịng kháng EEE E.coli Hình 3.6 Đƣờng kính vịng kháng khuẩn EEE S.flexneri Hình 3.7 Kết đánh giá độc tính EEE chuột Hình 3.8 Tỷ lệ chuột bị tiêu chảy nghiệm thức vii Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Phƣơng Hà Linh Linh Cấu tạo, tính chất vai trị carbohydrate, 2011, http://tailieu.vn/doc/cau-tao-tinh-chat-va-vai-tro-cua-carbohydrate887289.html Nguyễn Tấn Thịnh (2013) Tìm hiểu thành phần hợp chất thứ cấp lược vàng Callisia fragrans (lindl) Wood, Khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Cơng Nghệ TP.HCM Nguyễn Thị Khánh Nhƣ (2009) Xác định gen kháng Ceftriaxone vi khuẩn Shigella sonnei phân lập từ mẫu bệnh phẩm, Luận văn thạc sĩ, Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM Nguyễn Thị Quỳnh Hoa (2012) Phân lập hợp chất phenolic từ số thực vật, Luận văn thạc sĩ, Trƣờng Đại học Hà Nội Nguyễn thị Yến, Khi trẻ tiêu chảy bất dung nạp lactose, 2011, http://baosuckhoe.org/suc-khoe-tre-em/khi-tre-tieu-chay-do-bat-dung-naplastose.html Phạm Minh Nhựt (2013) Thực hành vi sinh đại cương, Trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM Phạm Thanh Kỳ (1998) Bài giảng dược liệu – tập II Nhà xuất Trung tâm thông tin thƣ viện - Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội Phạm Thị Bích Ngọc (2011) Tìm hiểu quy trình phát Vibrio thủy hải sản đơng lạnh, Khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM Phạm Thị Cẩm Hà Bệnh nhiễm khuẩn Salmonella - Một số vấn đề cần quan tâm, Viện vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng, 2013, http://www.nihe.org.vn/newvn/hoi-dap-ve-dich-benh-dich-benh-khac/764/Benh-do-nhiem-khuanSalmonella Mot-so-van-de-can-quan-tam.vhtm Phùng Trung Hùng, Phan Nguyễn Hữu Trọng Nguyễn Phƣớc Long Đại cương Carbohydrate, 2013, http://docsachysinh.com/dsys-ebook/Phan1/chuong14/index.html 74 Đồ án tốt nghiệp Phùng Văn Phê (2014) Bước đầu nghiên cứu kiểu thảm thực vật khu bảo tồn thiên nhiên Ngọc Sơn, Ngổ Lng, tỉnh Hịa Bình Tạp chí Khoa học, Trƣờng ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 30 (4), 30-39 Quỳnh Ngọc (2011) Flavonoids-bảo vệ sức khỏe an tồn, Tạp chí thơng tin Khoa học Công nghệ số 1&2, Trung tâm thông tin KH&CN TP.HCM Tôn Nữ Minh Nguyệt ctv (2010) Chất kháng khuẩn thực vật, Tiểu luận môn CNCB rau trái, Trƣờng Đại học Bách khoa, TP.HCM Tôn Nữ Minh Nguyệt, Nguyễn Văn Bảy, Nguyễn Bảo Dƣ Đỗ Minh Hiển (2011) Sterol-nguồn gốc, cấu tạo tính sinh học, Báo cáo Tiểu luận, Trƣờng Đại học Bách Khoa TP.HCM Tuệ Tĩnh (1960) Nam dược thần hiệu, Nhà xuất Y học Trần Anh Văn, Tiêu chảy cấp, 2011, http://tailieu.vn/doc/tieu-chay-cap-521216.html Trần Nam Hà (2008) Nghiên cứu tác dụng bokashi trầu lên vi khuẩn gây bệnh đường ruột tôm sú nuôi, Tiểu luận tốt nghiệp, TP.HCM Trần Nhƣ Dƣơng Sự thật tác hại vi khuẩn E.coli., Báo Sức khỏe Đời sống, 2011, http://suckhoedoisong.vn/ban-can-biet-ve-y-hoc/su-that-ve-tac-hai-cua-vikhuan-ecoli-20110624104521436.htm Trần Trƣờng Hận Hợp chất thiên nhiên, 2010, http://baigiang.violet.vn/present/show/entry_id/4329903 Trung tâm liệu thực vật Việt Nam Thảm thực vật tự nhiên vườn quốc gia Hoàng Liên, 7/6/2008, http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=news&newsid=21 Trƣờng Đại học Y Dƣợc Hà Nội (1998) Bộ môn Dược lý, Dược lý học, Nhà xuất Y học, Hà Nội Võ thị Mai Hƣơng (2009) Thành phần hóa sinh khả kháng khuẩn dịch chiết Muồng trâu (Cassia alata L.), Tạp chí Khoa học số 52, Đại học Huế 75 Đồ án tốt nghiệp Võ Thị Mai Hƣơng Trần Thanh Phong (2013) Nghiên cứu số đặc trưng hoá sinh khả kháng khuẩn dịch chiết nhàu ((Morinda citrifolia L.), Báo cáo Khoa học Hội nghị Khoa học Quốc gia Quốc tế, 10731078 Vũ xuân Tạo (2013) Nghiên cứu alkaloid quy trình tách chiết số chất có chất alkaloid, Cơng nghệ tách chiết hợp chất thứ sinh 76 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ HIỆU SUẤT THU HỒI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN A.1.Kết hiệu suất thu hồi cao ethanol 70% Elephantopus sp A.2 Kết kháng khuẩn cao ethanol 70% (d = mm) Vi sinh E.coli O1 E.co S.flex V.algino V.chol V.harv V.parahaem A.3 Kết kháng khuẩn kháng sinh Ciprofloxacin (d = mm) nồng độ khác Đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp A.4 Kết so sánh khác biệt khả kháng khuẩn cao chiết ethanol 70% Ciprofloxacin chủng vi khuẩn A.4.1 So sánh cao ethanol 70% Ciprofloxacin µg/ml V.alginolyticus ANOVA Table for Col_2 by Col_1 Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for Col_2 by Col_1 Method: 95,0 percent Tukey HSD Col_1 V.alginolyticus EEE V.alginolyticus Cip8 A.4.2 So sánh cao ethanol 70% Ciprofloxacin µg/ml V.cholerea ANOVA Table for Col_2 by Col_1 Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for Col_2 by Col_1 Method: 95,0 percent Tukey HSD Col_1 V.cholerae EEE V.cholerae Cip8 Đồ án tốt nghiệp A.4.3 So sánh cao ethanol 70% Ciprofloxacin µg/ml V.harveyi ANOVA Table for Col_2 by Col_1 Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for Col_2 by Col_1 Method: 95,0 percent Tukey HSD Col_1 V.harveyi EEE V.harveyi Cip8 A.4.4 So sánh cao ethanol 70% Ciprofloxacin µg/ml V.parahaemolyticus ANOVA Table for Col_2 by Col_1 Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for Col_2 by Col_1 Method: 95,0 percent Tukey HSD Col_1 V.parahaemolyticus Cip8 V.parahaemolyticus EEE Đồ án tốt nghiệp A.4.5 So sánh cao ethanol 70% Ciprofloxacin 500 µg/ml E.coli O157:H7 ANOVA Table for Col_2 by Col_1 Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for Col_2 by Col_1 Method: 95,0 percent Tukey HSD Col_1 E.coli O157:H7 EEE E.coli O157:H7 Cip500 A.4.6 So sánh cao ethanol 70% Ciprofloxacin 500 µg/ml E.coli ANOVA Table for Col_2 by Col_1 Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for Col_2 by Col_1 Method: 95,0 percent Tukey HSD Col_1 E.coli Cip500 E.coli EEE Đồ án tốt nghiệp A.4.7 So sánh cao ethanol 70% Ciprofloxacin 500 µg/ml S.flexneri ANOVA Table for Col_2 by Col_1 Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for Col_2 by Col_1 Method: 95,0 percent Tukey HSD Col_1 S.flexneri Cip500 S.flexneri EEE Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ VỀ KHẢ NĂNG TRỊ TIÊU CHẢY TRÊN MƠ HÌNH CHUỘT B.1 Kết hiệu trị tiêu chảy B.1.1 Thời gian bị tiêu chảy (phút) nhóm thơng qua lần lặp lại STT Trung bình SD B.1.2 Lượng phân tiêu chảy (g) nhóm thơng qua lần lặp lại STT Trung bình SD B.1.3 Phần trăm ức chế tiêu chảy (%) nhóm thơng qua lần lặp lại STT Trung bình SD Loper Đồ án tốt nghiệp B.1.4 So sánh thời gian bị tiêu chảy nhóm B.1.5 So sánh lượng phân tiêu chảy nhóm B.1.6 So sánh khả ức chế tiêu chảy nhóm Đồ án tốt nghiệp B.2 Kết thử nghiệm enteropooling B.2.1 Khối lượng dịch ruột (g) nhóm thơng qua lần lặp lại STT Trung bình SD B.2.2 Thể tích dịch ruột (ml) nhóm thơng qua lần lặp lại STT Trung bình SD Đồ án tốt nghiệp B.2.3 Phần trăm ức chế co bóp ruột (%) nhóm thơng qua lần lặp lại STT Trung bình SD B.2.4 So sánh thể tích dịch ruột nhóm B.2.5 So sánh khả ức chế nước nhóm 10 Đồ án tốt nghiệp B.3 Kết di chuyển ruột non B.3.1 Chiều dài ruột (cm) nhóm thơng qua lần lặp lại STT Trung bình SD B.3.2 Chiều dài than (cm) nhóm thơng qua lần lặp lại STT Trung bình SD 11 Đồ án tốt nghiệp B.3.3 Phần trăm ức chế di chuyển ruột (%) nhóm thơng qua lần lặp lại STT Trung bình SD B.3.4 So sánh khả ức chế di chuyển ruột nhóm 12 ... khả kháng khuẩn khả trị tiêu chảy Elephantopus sp tiến hành dung mơi ethanol 70% Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Elephantopus sp thực với nhóm vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột Hiệu trị tiêu chảy Elephantopus. .. cứu Đánh giá hoạt tính sinh học bao gồm hoạt tính kháng khuẩn vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột hoạt tính trị tiêu chảy mơ hình động vật từ cao chiết ethanol Elephantopus sp Nội dung nghiên cứu Khảo... Một số mơ hình đánh giá hiệu trị tiêu chảy thực vật động vật 1.5.1 Mơ hình đánh giá khả trị tiêu chảy Mục đích: Đánh giá khả chống tiêu chảy cao chiết so với thuốc đặc trị tiêu chảy đƣợc thử nghiệm