Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu này nhằm mục đích xác định hoạt tính kháng oxi hóa và kháng khuẩn của cao chiết ethanol từ cây Tía tô được trồng tại huyện Tây Hòa, tỉnh Phú Yên. Đồng thời, nghiên cứu này cũng thử nghiệm cảm ứng tạo rễ tơ Tía tô với chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 nhằm tạo tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực nuôi cấy rễ tơ Tía tô để thu nhận hợp chất thứ cấp có giá trị.
Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(1):975-983 Open Access Full Text Article Hoạt tính kháng oxi hóa, kháng khuẩn cao chiết ethanol từ tía tơ (Perilla frutescens) thử nghiệm cảm ứng tạo rễ tơ chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Trà Đông Phương1,2, Lê Thị Mộng Vương2, Quách Ngô Diễm Phương1,2,* TÓM TẮT Use your smartphone to scan this QR code and download this article Tía tơ (Perilla frutescens) – lồi thực vật thuộc họ Hoa mơi (Lamiaceae) – sử dụng phổ biến y học cổ truyền để chữa nhiều loại bệnh thường gặp (cảm lạnh, đau đầu, ho, đầy bụng, chướng bụng, ngộ độc, …) chứa nhiều hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học Khi tiến hành điều chế cao ethanol từ quan rễ, thân khảo sát khả kháng oxi hóa phương pháp bắt gốc tự DPPH khả kháng khuẩn phương pháp đục lỗ thạch, kết cho thấy cao chiết ethanol từ quan Tía tơ có hoạt tính kháng oxi hóa kháng khuẩn Bằng phản ứng đặc trưng, tất cao chiết ethanol từ rễ, thân Tía tơ có chứa nhóm phenol, flavonoid, saponin, alkaloid glycoside, triterpenoid có Các hợp chất thứ cấp có liên quan đến hoạt tính kháng oxi hóa kháng khuẩn Tía tơ Bên cạnh đó, thử nghiệm khả cảm ứng tạo rễ tơ chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 quan Tía tơ quan tạo rễ tơ tốt (67,67 ± 3,51% số mẫu cảm ứng tạo rễ tơ) Hiệu tạo rễ tơ cao với thời gian ngâm mẫu 20 phút đồng nuôi cấy 72 Các kết tiền đề cho nghiên cứu liên quan đến nuôi cấy rễ tơ để thu nhận hợp chất có hoạt tính sinh học Từ khố: Hợp chất thứ cấp, kháng khuẩn, kháng oxi hóa, rễ tơ, Tía tơ PTN Cơng nghệ Sinh học Phân tử, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Khoa Sinh học – Công nghệ sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Liên hệ Quách Ngô Diễm Phương, Khoa Sinh học – Công nghệ sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM PTN Công nghệ Sinh học Phân tử, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Email: qndphuong@hcmus.edu.vn Lịch sử • Ngày nhận: 2020-05-28 • Ngày chấp nhận: 2020-12-21 • Ngày đăng: 2021-1-28 DOI : 10.32508/stdjns.v5i1.917 Bản quyền © ĐHQG Tp.HCM Đây báo công bố mở phát hành theo điều khoản the Creative Commons Attribution 4.0 International license TỔNG QUAN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Tía tơ (Perilla frutescens) lồi thực vật thuộc họ Hoa mơi (Lamiaceae) Tía tơ trồng chủ yếu nước châu Á từ 2000 năm trước loài trồng quan trọng nơng nghiệp 1,2 Ngồi việc dùng Tía tơ loại thực phẩm thơng thường, Tía tơ cịn sử dụng loại thuốc y học cổ truyền châu Á để chữa nhiều loại bệnh thường gặp (cảm lạnh, đau đầu, ho, đầy bụng, chướng bụng, ngộ độc, …) chứa nhiều hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học Tại Việt Nam, Tía tơ tập trung nghiên cứu để phát hợp chất thứ cấp hoạt tính sinh học tiềm 4–6 , có khác hoạt tính sinh học lẫn hợp chất thứ cấp tích lũy Tía tơ trồng khu vực địa lý khác Do đó, nghiên cứu nhằm mục đích xác định hoạt tính kháng oxi hóa kháng khuẩn cao chiết ethanol từ Tía tơ trồng huyện Tây Hịa, tỉnh Phú Yên Đồng thời, nghiên cứu thử nghiệm cảm ứng tạo rễ tơ Tía tơ với chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 nhằm tạo tiền đề cho nghiên cứu lĩnh vực nuôi cấy rễ tơ Tía tơ để thu nhận hợp chất thứ cấp có giá trị Vật liệu sinh học Hạt giống Tía tô mua từ công ty TNHH TM Trang Nông Cây Tía tơ tháng tuổi (trồng thị trấn Phú Thứ, huyện Tây Hòa, tỉnh Phú Yên) thu hoạch vào buổi sáng để điều chế cao chiết ethanol Các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Acetobacterium sp., Streptococus sp., Salmonella typhi, Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa phịng thí nghiệm Vi sinh (khoa Sinh học – Cơng nghệ Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG – HCM) cung cấp Chủng Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 mua từ ngân hàng RIKEN-BRC thông qua dự án MEXT Nhật Bản Môi trường điều kiện nuôi cấy Mơi trường Luria-Bertani (LB) có pH 7,0 ± 0,1 dùng để nuôi cấy chủng vi khuẩn S aureus, B subtilis, Acetobacterium sp., Streptococus sp., S typhi, E coli P aeruginosa Mơi trường Yeast Mannitol Broth (YMB) có pH 7,0 ± 0,1 dùng để nuôi cấy vi khuẩn A rhizogenes ATCC 15834 Môi trường Murashige and Skoog (MS) bổ sung đường sucrose 30 g/L, agar g/L Trích dẫn báo này: Phương T D, Vương L T M, Phương Q N D Hoạt tính kháng oxi hóa, kháng khuẩn cao chiết ethanol từ tía tơ (Perilla frutescens) thử nghiệm cảm ứng tạo rễ tơ chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Sci Tech Dev J - Nat Sci.; 5(1):975-983 975 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(1):975-983 pH 5,80 ± 0,05 dùng cho nuôi cấy mô Tía tơ Tất mơi trường hấp khử trùng 15 phút nồi hấp nhiệt độ 121o C, atm Các chủng vi khuẩn tăng sinh mơi trường lỏng thích hợp máy lắc 37o C, tốc độ lắc 130 vòng/phút khơng có ánh sáng Các mẫu mơ thực vật ni phịng ni cấy nhiệt độ 25o C Phương pháp điều chế cao chiết ethanol Phương pháp điều chế cao chiết ethanol thực theo Basri Fan (2005) , có số thay đổi Mỗi quan rễ, thân Tía tơ sau thu hoạch sấy khô 37o C trọng lượng khơng thay đổi Sau đó, 500 gam bột khô quan ngâm chìm lít ethanol nhiệt độ phịng Sau 48 ngâm, dịch chiết quan lọc qua giấy lọc Whatman Phần bã thực vật lại tiếp tục sử dụng cho lần chiết kế tiếp, lần chiết sử dụng lít ethanol ngâm 48 Toàn dịch chiết thu sau lần chiết cô đặc lại thiết bị cô quay chân không 50o C, thu cao chiết ethanol (cao chiết thô) Cao chiết ethanol quan làm khô tủ Hood (ở nhiệt độ phịng) đạt khối lượng khơng đổi Phương pháp DPPH Hoạt tính kháng oxi hóa cao chiết ethanol đánh giá cách sử dụng phương pháp DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl hydrate) BrandWilliams cộng , có số biến đổi Hồ 0,5 mL cao chiết ethanol nồng độ khác (mg/mL) vào 3,5 mL dung dịch DPPH 0,09 mM (pha ethanol) Ethanol vitamin C tương ứng sử dụng chứng âm chứng dương phản ứng Dung dịch giữ điều kiện tối 30 phút, nhiệt độ phịng Sau đó, độ hấp thụ dung dịch đo bước sóng 517 nm Hoạt tính kháng oxi hóa biểu thị % ức chế DPPH theo công thức [(Ao – Am )/Ao ]×100%, Ao độ hấp thụ mẫu chứng âm Am độ hấp thụ mẫu thử nghiệm Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Phương pháp đục lỗ thạch sử dụng để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn (kháng S aureus, B subtilis, Acetobacterium sp., Streptococus sp., S typhi, E coli P aeruginosa) cao chiết ethanol từ Tía tô Môi trường LB-agar (LB bổ sung 15 gam agar, pH 7,0 ± 0,1) chuẩn bị đĩa vô trùng 976 cho thử nghiệm Dịch khuẩn hoạt hóa mơi trường LB lỏng qua đêm, điều chỉnh độ đục cho giá trị OD620 = 0,10 ± 0,01 (tương đương 108 tế bào vi khuẩn/mL) Vi khuẩn trải bề mặt đĩa mơi trường (100 µ l/đĩa) trước đục lỗ thạch cách sử dụng que trải vô trùng Cao chiết ethanol quan (rễ, thân lá) Tía tơ pha DMSO 10% để đạt đến nồng độ mg/mL Sau đó, 50 µ l cao chiết thêm vào lỗ thạch (mỗi lỗ thạch có đường kính mm cách 30 mm) Sau 24 khảo sát (ở 37o C, điều kiện hiếu khí), khả ức chế phát triển vi khuẩn ghi nhận cách đo đường kính vịng vơ khuẩn (lấy đường kính vịng vơ khuẩn đo đĩa trừ đường kính lỗ thạch) theo đơn vị mm Chloramphenicol (1 mg/mL) DMSO 10% tương ứng sử dụng chứng dương chứng âm cho thử nghiệm Phương pháp định tính hợp chất thứ cấp Định tính phenol 10 : cao chiết ethanol trộn với mL dung dịch FeCl3 2% Sự xuất màu xanh lam đen dung dịch cho thấy có phenol mẫu Định tính flavonoid 10 : Tác dụng với H2 SO4 đậm đặc: nhỏ từ từ 0,5 mL H2 SO4 đậm đặc vào mL dung dịch cao chiết ethanol Nếu dung dịch xuất màu vàng đậm, cam, đỏ xanh đỏ sậm mẫu có chứa flavonoid Tác dụng với tác nhân kiềm: cao chiết ethanol hòa tan mL dung dịch NaOH 2% Màu vàng xuất dung dịch sau trở thành khơng màu thêm vài giọt acid lỗng chứng tỏ có hiện flavonoid mẫu Định tính saponin 10 : cao chiết ethanol trộn với mL dung dịch HCl 0,1 N NaOH 0,1 N, lắc mạnh Sự hình thành cột bọt bền dấu hiệu cho thấy có diện saponin mẫu Định tính steroid – triterpenoid 10 : Phản ứng Rosenhein: hòa 0,2 mL acid tricloroacetic vào mL dung dịch cao chiết ethanol quan sát 20 phút Phản ứng dương tính (có saponin triterpenoid) dung dịch chuyển sang màu xanh dương Định tính alkaloid 10 : gam KI 100 mL nước cất) Sự xuất kết tủa màu nâu lơ lửng chứng minh diện alkaloid mẫu thử Định tính glycoside 10 : Phản ứng Salkowski: cao chiết ethanol trộn với mL chloroform, sau đó, mL H2 SO4 đậm đặc thêm vào từ từ lắc nhẹ Màu đỏ gạch nâu xuất dung dịch cho thấy có diện vòng steroid, phần aglycone glycoside Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(1):975-983 Phản ứng với thuốc thử Molisch: cao chiết ethanol trộn với mL H2 SO4 đậm đặc 0,5 mL dung dịch thuốc thử Molisch (α -napthol 1% resorcinol 5%, dung môi ethanol 80%) Sự xuất vịng màu tím đỏ mặt phân cách hai dung dịch chứng tỏ mẫu thử có diện đường aldose ketose Phương pháp khử trùng hạt tạo in vitro Hạt Tía tơ rửa nước xà phòng 30 phút, khử trùng ethanol 70% 1,5 phút nước Javel 20% 15 phút Sau khử trùng bề mặt, hạt Tía tơ rửa lần nước cất (đã hấp khử trùng), cấy trải hạt môi trường MS cho nảy mầm phịng ni cấy (cường độ ánh sáng 2500 lux, chiếu sáng 16 giờ/ngày) Phương pháp cảm ứng tạo rễ tơ Cây Tía tơ in vitro sau 45 ± ngày nảy mầm tách riêng quan (rễ, thân lá), tạo vết thương mẫu mô dao cấy, nhúng vào dịch khuẩn A rhizogenes ATCC 15834 (dịch khuẩn chuẩn bị cách tăng sinh vi khuẩn A rhizogenes ATCC 15834 môi trường YMB lỏng lắc giá trị OD600 dịch khuẩn đạt 0,50 ± 0,05) khoảng thời gian thích hợp Sau đó, mẫu mơ thấm bớt dịch khuẩn giấy thấm vô trùng đồng nuôi cấy môi trường MS (không chiếu sáng) khoảng thời gian thích hợp Sau thời kỳ đồng ni cấy, mẫu mô cấy chuyền sang môi trường MS (có bổ sung 250 mg/L cefotaxime) để loại bỏ vi khuẩn 11 Các rễ mọc từ vị trí vết thương giả định rễ tơ Phần trăm số mẫu tạo rễ tơ (%) = ((Số mẫu tạo rễ tơ)/(Tổng số mẫu xâm nhiễm))x100% Phương pháp PCR phát gen chuyển Rễ tơ giả định thu nhận để tách DNA gen theo phương pháp CTAB Doyle & Doyle 12 Mỗi phản ứng PCR tích 25 µ l (gồm 1U Taq polymerase, 0,5 µ M primer, µ l DNA dung dịch đệm 1X cho phản ứng PCR) thiết lập để phát gen rolB virG với trình tự primer liệt kê Bảng Phản ứng PCR thực gồm giai đoạn: giai đoạn biến tính ban đầu (95o C phút), 35 chu kỳ lặp lại (mỗi chu kỳ có bước: 94o C 0,5 phút, 54o C 0,5 phút 72o C phút) giai đoạn kéo dài sau (72o C phút) Sản phẩm thu sau kết thúc phản ứng PCR phân tích gel agarose 1% (w/v) Bảng gel sau điện di nhuộm với ethidium bromide soi bàn đèn UV để phát diện phân đoạn DNA mục tiêu Phương pháp xử lý số liệu thống kê Mỗi thí nghiệm lặp lại lần (với số mẫu từ 30 đến 35 mẫu cho lần lặp lại) Kết xử lý thống kê phần mềm SPSS 20.0 (phân nhóm giá trị phương pháp Duncan với độ tin cậy 95%) trình bày dạng Giá trị trung bình ± Độ lệch chuẩn Đồ thị vẽ phần mềm Microsoft Excel 2016 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hoạt tính kháng oxi hóa cao chiết ethanol từ quan Tía tơ Hoạt tính kháng oxi hóa cao chiết ethanol từ quan rễ, thân Tía tô đánh giá phương pháp DPPH Kết thu (Hình 1) cho thấy giá trị IC50 cao chiết ethanol thân (3,30 ± 0,30 mg/mL) cao cao chiết ethanol rễ (2,16 ± 0,16 mg/ml) (1,30 ± 0,63 mg/mL), điều chứng tỏ hợp chất chiết dung môi ethanol từ rễ Tía tơ có hoạt tính kháng oxi hóa cao so với hợp chất chiết từ thân Tía tơ lồi thực vật phổ biến Việt Nam châu Á Các nghiên cứu cho thấy Tía tơ nguồn ngun liệu tự nhiên chứa nhiều chất chống oxy hóa 13–15 Li cộng (2014) chứng minh cao chiết ethanol từ Tía tơ có khả bắt gốc tự DPPH với giá trị IC50 = 0,1482 mg/mL 16 Trong đó, cao chiết methanol thân Tía tơ có khả bắt gốc tự DPPH với giá trị IC50 tương ứng 5,92 µ g/mL 7,97 µ g/mL 17 Các kết kháng oxi hóa (ở cơng trình đề cập nghiên cứu này) cho thấy hoạt tính kháng oxi hóa Tía tơ phụ thuộc vào hợp chất thứ cấp tích lũy trồng vùng địa lý khác loại dung môi dùng để chiết Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanol từ quan Tía tơ Cao chiết ethanol từ quan Tía tơ thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn phương pháp đục lỗ thạch Kết cho thấy loại cao chiết ethanol từ quan Tía tơ có khả kháng khuẩn (Bảng Hình 2), với đường kính vịng kháng khuẩn dao động từ khoảng 3,33 mm đến 7,50 mm Cao chiết Tía tơ có khả kháng khuẩn thấp (đối với S aureus Streptococus sp.) (B subtilis, Acetobacterium sp., S typhi, E coli P aeruginosa) so với thân rễ Tính kháng S aureus 977 Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(1):975-983 Bảng 1: Trình tự primer dùng để phát gen rolB virG Trình tự primer (5’ → 3’) Gen Tên primer rolB rolB F GCT CTT GCA GTG CTA GAT TT rolB R GAA GGT GCA AGC TAC CTC TC virG F TTA TCT GAG TGA AGT CGT CTC virG R CGT CGC CTG AGA TTA AGT GTC virG Hình 1: Khả bắt gốc tự DPPH (giá trị IC50 ) cao chiết ethanol từ quan rễ, thân Tía tơ Ký hiệu a, b c thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mức α = 0,05 loại cao chiết ethanol nhóm thí nghiệm cao chiết từ rễ thân cao đáng kể so với lá, cịn tính kháng Streptococus sp cao chiết từ rễ lại cao đáng kể so với quan cịn lại Dung mơi DMSO 10% sử dụng để hịa tan cao chiết ln cho kết âm tính (khơng xuất vịng kháng khuẩn), cho thấy dung mơi khơng ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn cao chiết thử nghiệm Một số nghiên cứu trước cho thấy Tía tơ có hoạt tính kháng khuẩn Kim cộng (2007) nhận thấy cao chiết ethanol từ Tía tơ có hoạt tính kháng S aureus, B subtilis P aeruginosa, khơng có khả kháng E coli 18 Cao chiết ethanol thể hoạt tính kháng khuẩn yếu Aeromonas hydrophila Edwardsiella ictaluri 19 Như vậy, tùy thuộc vào loài vi khuẩn mà cao chiết Tía tơ thể hoạt tính kháng khuẩn khác Sự diện hợp chất thứ cấp cao chiết ethanol từ quan Tía tơ Cao chiết ethanol từ quan Tía tơ phân tích định tính hợp chất, kết cho thấy tất cao chiết có chứa phenol, flavonoid, saponin, glycoside alkaloid, triterpenoid có (Bảng 3) Thơng thường, hợp chất thứ cấp biết có hoạt tính sinh học để bảo vệ thể thực vật chống chịu stress sinh học phi sinh học 978 Hoạt tính kháng oxi hóa Tía tơ cao quan cịn lại đóng góp triterpenoid diện (nhưng khơng có thân rễ) Trong nghiên cứu in vitro, phenol, flavonoid, saponin, triterpenoid alkaloid báo cáo có hoạt tính kháng oxi hóa kháng khuẩn 20,21 Hoạt tính chống oxi hóa chất có khả cho nguyên tử hidro, electron tạo phức với ion kim loại 22–24 , ngồi ra, chúng có khả làm thay đổi tính thấm màng tế bào liên kết với enzyme để làm thay đổi số chức nội bào vi sinh vật, đó, chúng có hoạt tính kháng khuẩn 25–27 Như vậy, diện hợp chất thứ cấp cao chiết ethanol tạo nên hoạt tính kháng oxi hóa kháng khuẩn in vitro Ảnh hưởng loại quan khác đến hiệu tạo rễ tơ Tía tơ Một cách thức để tăng cường sản xuất hợp chất thứ cấp nuôi cấy mô tế bào thực vật sử dụng A rhizogenes để cảm ứng tạo rễ tơ thực vật Rễ tơ – sản phẩm chuyển gen tự nhiên A rhizogenes – có khả tăng trưởng khơng giới hạn môi trường nuôi cấy mà không cần chất điều hịa sinh trưởng thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp tương đương chí lớn mẹ 28,29 Do đó, bước nghiên cứu tiến hành cảm ứng tạo rễ tơ Tía tơ chủng vi khuẩn A rhizogenes ATCC 15834 quan rễ, thân Tía tơ (ngâm mẫu 20 phút đồng nuôi cấy 72 giờ) Kết cho thấy tất quan rễ, thân cảm ứng tạo rễ tơ (Bảng Hình 3), quan có khả tạo rễ tơ cao (67,67 ± 3,51% số mẫu cảm ứng tạo rễ tơ) Hiệu tạo rễ tơ có phụ thuộc vào quan mà A rhizogenes xâm nhiễm, quan có hiệu xâm nhiễm cao 30–32 Do đó, Tía tơ sử dụng để làm vật liệu cho thí nghiệm Ảnh hưởng thời gian ngâm mẫu dịch khuẩn A rhizogenes ATCC 15834 đến hiệu tạo rễ tơ Lá Tía tơ ngâm dịch khuẩn A rhizogenes ATCC 15834 khoảng thời gian khác Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(1):975-983 Bảng 2: Đường kính vịng kháng khuẩn cao chiết ethanol từ quan rễ, thân Tía tơ Đường kính vịng kháng khuẩn (mm) Chứng âm Chứng dương Cao chiết ethanol rễ Cao chiết ethanol thân Cao chiết ethanol – 26,83 ± 0,58 7,33 ± 0,29a 6,67 ± 0,29a 5,67 ± 0,76b – 25,17 ± 1,53 6,17 ± 0,58a 4,83 ± 0,29a 5,50 ± 0,20a – 22,50 ± 0,87 4,33 ± 1,53a 3,33 ± 1,53a 3,50 ± 0,50a – 25,33 ± 0,58 7,50 ± 1,00a 5,00 ± 1,32b 5,00 ± 0,87b – 22,50 ± 1,00 4,83 ± 0,76a 4,00 ± 0,50a 4,83 ± 1,04a – 21,83 ± 0,76 4,17 ± 1,26a 3,83 ± 1,26a 4,33 ± 1,44a – 22,67 ± 1,53 3,83 ± 2,36a 4,17 ± 1,61a 4,17 ± 0,58a Ghi chú: ký hiệu a b thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mức α = 0,05 loại cao chiết ethanol nhóm thí nghiệm Hình 2: Khả kháng khuẩn cao chiết từ rễ (R), thân (T) (L) Tía tơ với loài vi khuẩn S aureus (A), B subtilis (B), Acetobacterium sp (C), Streptococus sp (D), S typhi (E), E coli (F) P aeruginosa (G) khảo sát phương pháp đục lỗ thạch Chloramphenicol đối chứng dương (+) DMSO 10% đối chứng âm (–) Thước đơn vị (thanh ngang màu trắng): cm Bảng 3: Một số hợp chất có cao chiết ethanol từ quan rễ, thân Tía tơ Cao chiết ethanol rễ Cao chiết ethanol thân Cao chiết ethanol Phenol + + + Flavonoid + + + Saponin + + + Triterpenoid – – + Alkaloid + + + Glycoside + + + Ghi chú: ký hiệu “+” “–” tương ứng thể phản ứng dương tính âm tính với thuốc thử 979 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(1):975-983 Bảng 4: Tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ quan rễ, thân Tía tơ cảm ứng Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 Cơ quan Tỉ lệ mẫu tạo rễ tơ (%) Rễ 30,33 ± Thân 53,33 ± 4,51c Lá 3,06b 67,67 ± 3,51a Ghi chú: ký hiệu a, b c thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mức α = 0,05 nghiệm thức nhóm thí nghiệm Hình 3: Sự tạo rễ tơ quan (A), thân (B) rễ (C) Tía tơ cảm ứng Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 Bảng 5: Phần trăm số mẫu tạo rễ tơ xử lý với vi khuẩn A rhizogenes ATCC 15834 khoảng thời gian khác Thời gian ngâm mẫu (phút) 10 20 30 Tỉ lệ mẫu tạo rễ tơ (%) 6,67 ± 1,15c 68,00 ± 3,00a 22,67 ± 1,53b Ghi chú: ký hiệu a, b c thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mức α = 0,05 nghiệm thức nhóm thí nghiệm (10, 20 30 phút) đồng ni cấy 72 Kết (Bảng 5) cho thấy ngâm mẫu 20 phút dịch khuẩn hiệu tạo rễ tơ tốt (68,00 ± 3,00 % số mẫu tạo rễ tơ) Khi ngâm mẫu vào dịch khuẩn, tín hiệu giải phóng từ vị trí vết thương mẫu giúp kích hoạt gen vir Ri-plasmid vi khuẩn A rhizogenes ATCC 15834, tạo điều kiện cho bám vi khuẩn lên vết thương mẫu Tía tơ 33 Kết nghiên cứu cho thấy 20 phút thời gian tốt để ngâm mẫu Tía tơ dịch khuẩn A rhizogenes ATCC 15834 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu tạo rễ tơ Lá Tía tơ sau tạo vết thương, ngâm dịch khuẩn 20 phút đồng nuôi cấy khoảng thời gian khác (24, 48, 72 96 giờ) Kết (Bảng 6) cho thấy đồng nuôi cấy 72 cho hiệu tạo rễ tơ tốt (68,33 ± 3,51 % số mẫu tạo rễ tơ), đồng nuôi cấy 24 cho hiệu tạo rễ tơ thấp (6,33 ± 0,58 % số mẫu tạo rễ tơ) Các kết thu chứng tỏ thời gian đồng ni cấy có ảnh hưởng đến hiệu tạo rễ tơ Sự chuyển T-DNA từ Ri-plasmid vào tế bào thực vật không hiệu thời gian đồng nuôi cấy ngắn (24 48 giờ), 980 ngược lại, đồng nuôi cấy dài (96 trở lên) gây tác động ngược đến việc tạo rễ tơ phát triển mức vi khuẩn dẫn đến ức chế cạnh tranh 34,35 Chứng minh diện gen chuyển Khi thực phản ứng PCR cho DNA gen rễ tơ (được cảm ứng từ Tía tơ) với primer đặc hiệu, kết PCR (Hình 4) cho thấy có diện gen rolB (423 bp) khơng có diện gen virG (1030 bp) Từ kết này, kết luận rằng: T-DNA Ri-plasmid A rhizogenes ATCC 15834 chèn thành công vào gen rễ tơ Tía tơ KẾT LUẬN Từ kết thí nghiệm, chúng tơi nhận thấy cao chiết ethanol từ quan Tía tơ có hoạt tính kháng oxi hóa hoạt tính kháng khuẩn Đồng thời, cao chiết ethanol chứa phenol, flavonoid, glycoside, saponin alkaloid định tính phản ứng đặc trưng, triterpenoid có Bên cạnh đó, quan rễ, thân Tía tơ tạo rễ tơ cảm ứng A rhizogenes ATCC 15834, quan tạo rễ tơ tốt Ngâm mẫu 20 phút đồng ni cấy 72 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(1):975-983 Bảng 6: Phần trăm số mẫu rễ tơ đồng nuôi cấy khoảng thời gian khác Thời gian đồng nuôi cấy (giờ) Tỉ lệ mẫu tạo rễ tơ (%) 24 6,33 ± 0,58d 48 17,33 ± 2,31c 72 68,33 ± 3,51a 96 50,33 ± 6,81b Ghi chú: ký hiệu a, b, c d thể khác biệt có ý nghĩa thống kê mức α = 0,05 nghiệm thức nhóm thí nghiệm thảo báo Lê Thị Mộng Vương đóng góp vào việc thu thập số liệu hoạt tính kháng oxi hóa, kháng khuẩn, định tính hợp chất thứ cấp cảm ứng tạo rễ tơ Qch Ngơ Diễm Phương đóng góp vào việc thu thập số liệu cảm ứng tạo rễ tơ góp ý chỉnh sửa thảo báo TÀI LIỆU THAM KHẢO Hình 4: Kết PCR sử dụng primer đặc cho gen rolB (423 bp) virG (1030 bp), đó: “–” đối chứng âm, “+” đối chứng dương “L” thang chuẩn 100 bp plus cho hiệu tạo rễ tơ tốt Bằng primer đặc hiệu cho gen rol B phản ứng PCR, nghiên cứu chứng minh gen rol B chèn thành công vào gen rễ tơ Tía tơ Các kết làm tiền đề cho nghiên cứu việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy rễ tơ nhằm sản xuất hợp chất thứ cấp có giá trị DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CTAB : Cetyl trimethylammonium bromide DMSO : Dimethyl sulfoxide DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl hydrate LB : Lysogeny broth MS : Murashige and Skoog PCR : Polemerase chain reaction YMB : Yeast mannitol broth XUNG ĐỘT LỢI ÍCH Các tác giả tun bố họ khơng có xung đột lợi ích nghiên cứu LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu tài trợ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM khuôn khổ đề tài cấp Trường mã số T2017-46 ĐÓNG GÓP CỦA CÁC TÁC GIẢ Lee JK, Kim NS Genetic diversity and relationships of cultivated and weedy types of Perilla frutescens collected from East Asia revealed by microsatellite markers Korean J Breed Sci 2007;39(4):491–499 Lee JK, Ohnishi O Geographic differentiation of morphological characters among Perilla crops and their weedy types in East Asia Breeding science 2001;51(4):247–255 Available from: https://doi.org/10.1270/jsbbs.51.247 Ahmed HM Ethnomedicinal, Phytochemical and Pharmacological Investigations of Perilla frutescens (L.) Britt Molecules 2019;24(1):102 PMID: 30597896 Available from: https://doi org/10.3390/molecules24010102 Thu DK Tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase hạ acid uric máu dịch chiết tía tơ (Perilla frutescens L.) Tạp chí Dược học 2018;57(11):65–67 Trinh HN, et al Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính chống oxy hóa in vitro cao chiết từ tía tô thu hái địa điểm khác Tạp chí Dược học 2019;59(5):47–51 Vân HTK, et al Nghiên cứu thành phần hóa học khảo sát hoạt tính sinh học tinh dầu tía tơ (Perilla frutescens (L.) Britt) Tạp chí Dược học 2019;59(9):65–68 Basri DF, Fan SH The potential of aqueous and acetone extracts of galls of Quercus infectoria as antibacterial agents Indian journal of Pharmacology 2005;37(1):26 Available from: https://doi.org/10.4103/0253-7613.13851 Brand-Williams W, et al Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity LWT-Food science and Technology 1995;28(1):25–30 Available from: https://doi.org/10.1016/ S0023-6438(95)80008-5 Hufford CD, et al Two antimicrobial alkaloids from heartwood of Liriodendron tulipifera L Journal of pharmaceutical sciences 1975;64(5):789–792 PMID: 807704 Available from: https://doi.org/10.1002/jps.2600640512 10 Phụng MKP Phương pháp cô lập hợp chất hữu NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh 2007; 11 Tra PD, et al Induction of Platycodon grandiflorum hairy roots through the mediation of four Agrobacterium rhizogenes strains Science and Technology Development Journal 2016;19(4):64–75 Available from: https://doi.org/10.32508/ stdj.v19i4.624 12 Doyle JJ, Doyle JL A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochemical Bulllletin 1987;19:11 –15 13 Chou HJ, et al Comparative antioxidant properties of water extracts from different parts of Beefsteak plant (Perilla frutescens) Journal of Food & Drug Analysis 2009;17(6) Available from: https://doi.org/10.38212/2224-6614.2581 14 Lin E, Chou H, et al Antioxidant and antiproliferative activities of methanolic extracts of Perilla frutescens Journal of Medicinal Plants Research 2010;4(6):477–483 Trà Đơng Phương đóng góp vào việc thu thập số liệu hoạt tính kháng oxi hóa, kháng khuẩn viết 981 Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ – Khoa học Tự nhiên, 5(1):975-983 15 Meng L, et al Antioxidant activities of polyphenols extracted from Perilla frutescens varieties Molecules 2009;14(1):133– 140 PMID: 19127243 Available from: https://doi.org/10.3390/ molecules14010133 16 Gong J, et al Phytochemicals, nutritional analysis and in vitro antioxidant activities of pickled Perilla frutescens ethanolic leaf extract European Journal of Medicinal Plants 2014;p 303–314 Available from: https://doi.org/10.9734/EJMP/2014/ 7453 17 Lin E, Chou H, et al Antioxidant and antiproliferative activities of methanolic extracts of Perilla frutescens Journal of Medicinal Plants Research , 4(6), - 2010;4(6):477–483 18 Kim MH, et al Antimicrobial activity of aqueous ethanol extracts of Perilla frutescens var acuta leaf Journal of the Korean Society of Food Culture 2007;22(2):266–273 19 Dao LA, et al Screening and comparative study of in vitro antioxidant and antimicrobial activities of ethanolic extracts of selected Vietnamese plants International Journal of Food Properties 2020;23(1):481–496 Available from: https://doi org/10.1080/10942912.2020.1737541 20 Cowan MM Plant Products as Antimicrobial Agents Clinical Microbiology Reviews 1999;12:564–582 PMID: 10515903 Available from: https://doi.org/10.1128/CMR.12.4.564 21 Dahanukar SA, Kulkarni RA, Rege NN Pharmacology of Medicinal Plants and Natural Products Indian Journal of Pharmacology 2000;32:S81–S118 22 Afanas’ev IB, et al Chelating and free radical scavenging mechanisms of inhibitory action of rutin and quercetin in lipid peroxidation Biochemical pharmacology 1989;38(11):1763– 1769 Available from: https://doi.org/10.1016/0006-2952(89) 90410-3 23 Bi L, et al New antioxidant and antiglycation active triterpenoid saponins from the root bark of Aralia taibaiensis Fitoterapia 2012;83(1):234–240 PMID: 22088497 Available from: https://doi.org/10.1016/j.fitote.2011.11.002 24 Tapondjou LA, et al Cytotoxic and antioxidant triterpene saponins from Butyrospermum parkii (Sapotaceae) Carbohydrate research 2011;346(17):2699–2704 PMID: 21996603 Available from: https://doi.org/10.1016/j.carres.2011.09.014 25 Arabski M, Węgierek-Ciuk A, Czerwonka G, Lankoff A, Kaca W Effects of saponins against clinical E coli strains and eu- 982 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 karyotic cell line BioMed Research International 2012;PMID: 22500084 Available from: https://doi.org/10.1155/2012/ 286216 Bordes C, et al Antibacterial properties of polyphenols: characterization and QSAR (Quantitative structure-activity relationship) models Frontiers in microbiology 2019;10:829 PMID: 31057527 Available from: https://doi.org/10.3389/ fmicb.2019.00829 Saboora A, et al Antibacterial activity of different composition of aglycone and glycosidic saponins from tuber of Cyclamen coum Miller Industrial Crops and Products 2019;140:111662 Available from: https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2019.111662 Kim YJ, et al Growth of Artemisia annua hairy roots in liquidand gas-phase reactors Biotechnology and Bioengineering 2002;80(4):454–464 PMID: 12325154 Available from: https: //doi.org/10.1002/bit.10389 Kim Y, et al Secondary metabolism of hairy root cultures in bioreactors In Vitro Cell.Dev.Biol Plant 2002;38:1–10 Available from: https://doi.org/10.1079/IVP2001243 Chandran RP, Potty VP Different inducer molecules and strains of Agrobacterium rhizogenes on enhancing transformation frequency in host plants Biotechnology 2011;10(2):203–208 Available from: https://doi.org/10.3923/ biotech.2011.203.208 Pawar PK, Maheshwari VL Agrobacterium rhizogenes mediated hairy root induction in two medicinally important members of family Solanaceae 2004; Pirian K, et al Hairy roots induction from Portulaca oleracea using Agrobacterium rhizogenes to noradrenaline’s production Intl Res J Appl Basic Sci 2012;3:642–649 Minh HTT, et al Nghiên cứu quy trình chuyển gen tạo rễ tơ in vitro đậu phộng (Arachis hypogaea L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes nhằm thu nhận Resveratrol Tạp chí Cơng nghệ sinh học 2011;9(4A):665–672 Sivanesan I, Jeong BR Induction and establishment of adventitious and hairy root cultures of Plumbago zeylanica L African Journal of Biotechnology 2009;8:20 Tao J, Li L Genetic transformation of Torenia fournieri L mediated by Agrobacterium rhizogenes South African journal of botany 2006;72(2):211–216 Available from: https://doi.org/ 10.1016/j.sajb.2005.07.010 Science & Technology Development Journal – Natural Sciences, 5(1):975-983 Research Article Open Access Full Text Article Antioxidant, anti-bacterial activity of Perilla frutescens ethanol extract and induction of hairy roots by Agrobacterium rhizogenes Tra Dong Phuong1,2, Le Thi Mong Vuong2, Quach Ngo Diem Phuong1,2,* ABSTRACT Use your smartphone to scan this QR code and download this article Perilla frutescens, a plant of the Lamiaceae family, is commonly used for traditional medicine to treat diseases (cold, headache, cough, tympanites, poisoning, ) because it contains many secondary compounds with bioactivities Roots, stems and leaves of P frutescens were extracted with ethanol These extracts have also been investigated antioxidant by DPPH method and antibacterial by agar well diffusion method The results showed that these extracts possess antioxidant and antibacterial activity By specific reactions, we found that phenols, flavonoids, saponins, alkaloids and glycosides were contained in all extracts of P frutescens, but triterpenoids were only found in leaf extract These secondary compounds are involved in the antioxidant and antibacterial activity of P frutescens Hairy roots of P frutescens were induced by Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 The results suggested that leaves were the best materials for hairy root inducing (67.67 ± 3.51 % of samples produced hairy roots) 20 minutes of immersion and 72 hours of co-culture are optimal for the induction of hairy roots These results are a pre-requisition for further studies related to hairy root cultures aimed production of bioactive compounds Key words: Antibacterial, antioxidant, hairy roots, Perilla frutescens, secondary compound Molecular Biotechnology Laboratory, University of Science, VNU-HCM Faculty of Biology and Biotechnology, University of Science, VNU-HCM Correspondence Quach Ngo Diem Phuong, Faculty of Biology and Biotechnology, University of Science, VNU-HCM Molecular Biotechnology Laboratory, University of Science, VNU-HCM Email: qndphuong@hcmus.edu.vn History • Received: 2020-05-28 • Accepted: 2020-12-21 ã Published: 2021-1-28 DOI :10.32508/stdjns.v5i1.917 Copyright â VNU-HCM Press This is an openaccess article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International license Cite this article : Phuong T D, Vuong L T M, Phuong Q N D Antioxidant, anti-bacterial activity of Perilla frutescens ethanol extract and induction of hairy roots by Agrobacterium rhizogenes Sci Tech Dev J - Nat Sci.; 5(1):975-983 983 ... tính kháng khuẩn cao chiết ethanol từ quan Tía tơ Cao chiết ethanol từ quan Tía tơ thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn phương pháp đục lỗ thạch Kết cho thấy loại cao chiết ethanol từ quan Tía tơ có... tùy thuộc vào lồi vi khuẩn mà cao chiết Tía tơ thể hoạt tính kháng khuẩn khác Sự diện hợp chất thứ cấp cao chiết ethanol từ quan Tía tơ Cao chiết ethanol từ quan Tía tơ phân tích định tính hợp... Đường kính vịng kháng khuẩn cao chiết ethanol từ quan rễ, thân Tía tơ Đường kính vịng kháng khuẩn (mm) Chứng âm Chứng dương Cao chiết ethanol rễ Cao chiết ethanol thân Cao chiết ethanol – 26,83