nghiên cứu chuyển gen vào đậu cove (phaseolus vulgarí.l) thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHỆP HÀ NỘI PHẠM THỊ TRANG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO ðẬU COVE (PHASEOLUS VULGARIS. L) THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, NĂM 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI PHẠM THỊ TRANG “NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO ðẬU COVE (PHASEOLUS VULGARIS. L) THÔNG QUA VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS” CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ : 06.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO HÀ NỘI, NĂM 2013 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Phạm Thị Trang Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii LỜI CẢM ƠN Luận văn được hoàn thành theo chương trình đào tạo Thạc sĩ, hệ chính quy niên khóa 2011-2013 của trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội. Trong suốt quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ tạo mọi điều kiện thuận lợi của Ban Giám Hiệu và phòng Đào Tạo Nhà trường; Ban chủ nhiệm khoa, các giảng viên và nhân viên bộ môn Công nghệ sinh học thực vật; Ban Giám Hiệu và các đồng nghiệp trường Đại Học Hải Dương. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc trước những sự quan tâm và giúp đỡ quý báu đó. Để có được kết quả trên là nhờ sự hướng dẫn và chỉ bảo tận tình của giảng viên PGS.TS. Nguyễn Thị Phương Thảo, trưởng Khoa Công nghệ sinh học. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và sự kính trọng nhất đối với cô. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới giảng viên ThS. Ninh Thị Thảo, ThS. Nguyễn Thị Thủy, ThS. Phạm Thị Thu Hằng cán bộ tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ sinh học thực vật đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập. Tôi còn nhận được sự giúp đỡ và động viên tinh thần của cha mẹ, anh chị em trong gia đình cùng các bạn học cùng khóa. Tôi thành thật cảm ơn và ghi nhớ tất cả sự giúp đỡ chân thành đó. TÔI XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN! Tác giả luận văn Phạm Thị Trang Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv MỤC LỤC Lời cam đoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục các bảng vi Danh mục hình vii Danh mục biểu đồ viii Danh mục chữ viết tắt ix TÓM TẮT 1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1 Giới thiệu chung về cây đậu cove 4 1.2 Các nghiên cứu về hệ thống nuôi cấy mô cây đậu cove 4 1.2.1 Tái sinh in vitro thông qua tái sinh cơ quan sinh dưỡng 5 1.2.2 Tái sinh in vitro thông qua phát sinh callus 9 1.3 Vi khuẩn A. tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen ở thực vật 10 1.3.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn A. tumefaciens 10 1.3.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 11 1.3.3 Cấu trúc và chức năng của T-ADN 12 1.3.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens 13 1.3.5 Các vector biến nạp thực vật không gây ung thư dựa trên Ti-plasmid 13 1.3.6 Các gen chỉ thị chọn lọc và sàng lọc 14 1.3.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp thông qua A.tumefaciens 16 1.4 Các nghiên cứu về chuyển gen vào đậu cove 18 1.5 Các nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của V – ATPase ở côn trùng 20 1.6 Các nghiên cứu về chuyển gen RNAi vào cây trồng kháng côn trùng 22 1.7 Các nghiên cứu sử dụng RNAi cho các mục tiêu khác 25 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Địa điểm, thời gian, vật liệu nghiên cứu 27 2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 27 2.1.2 Thời gian nghiên cứu 27 2.1.3 Vật liệu nghiên cứu 27 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v 2.2 Nội dung nghiên cứu 29 2.2.1 Nghiên cứu nuôi cấy tái sinh in vitro các giống đậu cove 29 2.2.2 Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của một số thông số của quy trình chuyển gen đậu cove 30 2.2.3 Nghiên cứu chuyển cấu trúc vector mang gen amiRNA V-ATPase vào giống đậu cove GS012 30 2.3 Phương pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy mô 30 2.3.2 Phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 34 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Nghiên cứu nuôi cấy tái sinh in vitro các giống đậu cove 36 3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng việc bóc vỏ hạt đến sự nảy mầm của các giống đậu cove 36 3.1.2 Đánh giá khả năng nảy mầm của các giống đậu cove 38 3.1.3 Nghiên cứu môi trường nhân nhanh tốt nhất đậu cove 39 3.2 Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của một số thông số của quy trình chuyển gen đậu cove 41 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh kanamycin đến sức sống của mẫu cấy 41 3.2.2 Đánh giá khả năng biểu hiện gen gus của các giống đậu cove khác nhau 43 3.2.3 Đánh giá ảnh hưởng của mật độ quang của dịch khuẩn (OD) đến khả năng biểu hiện gen gus ở giống GS012 45 3.3.4 Đánh giá ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến khả năng biểu hiện gen gus của GS012 47 3.4 Nghiên cứu cải tiến quy trình chọn lọc đậu co ve chuyển gen 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 1 Kết luận 53 2 Đề nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 58 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Hệ thống các gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker genes) và các gen chỉ thị sàng lọc (screenable marker genes) 15 3.1 Ảnh hưởng của việc bóc vỏ hạt đến sự nảy mầm của các giống đậu cove 37 3.2 Ảnh hưởng công thức nhân nhanh tới khả năng tái sinh của đậu cove sau 3 tuần nuôi cấy 40 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh kanamycin đến sức sống của mẫu cấy (sau 3 tuần) 42 3.4 Khả năng biểu hiện gen gus của các giống đậu cove khác nhau 44 3.5 Ảnh hưởng của mật độ quang của dịch khuẩn (OD) đến khả năng biểu hiện gen gus của GS012 46 3.6 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến khả năng biểu hiện gen gus của giống GS012 48 3.7 Kết quả chọn lọc cây chuyển gen theo các phương pháp khác nhau 50 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình và ñồ thị Trang 1.1 Ti-Plasmid (http://www.patentlens.net) 11 1.2 Cấu trúc của H+ V – ATPase (Kawasaki Nishi và Forgac, 2003) 21 2.1 Các giống đậu cove 27 2.2 Plasmid pBin 19 28 2.3 Plasmid pPS1 28 2.4 Mẫu chuyển gen: đốt lá mầm (1) từ cây đậu nảy mầm sau 3 ngày gieo cấy. 31 3.1 Mẫu hạt đậu cove sử dụng cho nuôi cấy in vitro ( C1: không bóc vỏ, C2: bóc vỏ). 37 3.2 Sự nảy mầm của các giống đậu cove sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường MSB5 39 3.3 Khả năng tái sinh giống GS012 trên các môi trường khác nhau 40 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh Kanamycin đến sức sống của mẫu cấy (sau 3 tuần) 43 3.5 Khả năng biểu hiện gen gus của GS012 (A) và AYOKA (B) 45 3.6 Mẫu sử dụng chuyển gen 49 3.7 Chọn lọc cây chuyển gen theo các phương pháp khác nhau trên 51 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp viii DANH MỤC BIỂU ðỒ STT Tên biểu ñồ Trang 3.1 Sự nảy mầm của các giống đậu cove sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường MSB5. 38 3.2 Ảnh hưởng của mật độ quang của dịch khuẩn (OD) đến khả năng biểu hiện gen gus của giống GS012 46 33.3 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến khả năng biểu hiện gen gus của giống GS012 48 Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ix DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens AmiRNA Artificial miRNA - miRNA nhân tạo Amp Ampicillin CT Công thức ĐC Đối chứng ICP Insecticidal crystal protein - protein tinh thể diệt côn trùng Kan Kanamycin MiRNA MicroRNA Nst Nhiễm sắc thể Nts Nucleotides ND Nước dừa PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp RE Restriction Enzyme - Enzyme giới hạn RISC RNA Inducing Silencing Complex - Phức hợp làm câm RNA RNAi RNA interfering - RNA can thiệp SiRNA Small interfering RNA - RNA can thiệp kích thước nhỏ Srna Small RNA - RNA nhỏ Strep Streptomycin GA 3 Gibberellic acid TDZ N-phenyl-N’-1, 2,3-thiadiazol-5-urea [thidiazuron] BAP 6 -Benzylaminopurine IAA Indole-3- acetic acid α – NAA α-Naphthalene acetic acid IBA Indole-3-butyric-acid AS Adenine sulphate 2,4D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid IPM Integrated Pests Management - Quản lý dịch hại tổng hợp [...]... L.) thông qua vi khu n Agrobacterium tumefaciens ” M c ñích, yêu c u M c ñích c a ñ tài nh m xây d ng quy trình chuy n gen gus có hi u qu nh t ñ t ñó áp d ng chuy n gen mang c u trúc amiRNA c ch bi u hi n gen VATPase c a m t s loài sâu h i ñ u ñ vào ñ u cove (Phaseolus vulgaris L) thông qua vi khu n Agrobacterium tumefaciens: Yêu c u: Trong khuôn kh m t lu n án t t nghi p, chúng tôi t p trung nghiên c... các phương pháp chuy n gen vào th c v t khác nhau như s d ng súng b n gen, dùng xung ñi n t bào và mô th c v t, dùng vi tiêm, chuy n gen thông qua con ñư ng ng ph n,… Tuy nhiên, hai phương pháp thư ng s d ng cho chuy n gen ñ u cove là chuy n gen tr c ti p thông qua súng b n gen và chuy n gen gián ti p thông qua vi khu n ñ t gram âm Agrobacterium b m t ñ c tính (Dillen và c ng s 1995; Kim và Minamikawa... n nh m nghiên c u chuy n gen vào ñ u cove Phaseolus vulgaris L thông qua vi khu n Agrobacterium tumefaciens Các ch ng Agrobacterium tumefaciens (A tumefaciens) ñư c s d ng là LB 303 mang plasmid pBin 19 ch a gen gus và ch ng LBA 4404 mang plasmid pPSI ch a c u trúc amiRNA (có trình t 5’- TCAAACTCTTTGAATTGCCTT-3’) có ti m năng làm câm gen mã hóa V-ATPase 5 loài sâu h i, ñ t o cây ñ u chuy n gen kháng... bi n n p thông qua A .tumefaciens S thành công trong vi c t o ra th c v t chuy n gen ph thu c vào m t lo t các y u t như t n s bi n n p, tác nhân ch n l c ho c sàng l c và kh năng tái sinh cây chuy n gen hoàn ch nh t các t bào và mô mang gen chuy n n p ð i v i phương pháp chuy n gen thông qua A .tumefaciens thì t n s bi n n p ph thu c vào các y u t liên quan ñ n vi khu n và các y u t liên quan ñ n th c... trong chuy n gen b n v ng Nguyên nhân có th là do thi u s tương tác gi a quá trình chuy n T-ADN và chuy n gen b n v ng ð có ñư c s ph i h p gi a chuy n T-ADN và chuy n gen b n v ng thì các ñi u ki n lây nhi m, ñ ng nuôi c y ph i thích h p cho vi c chuy n T-ADN và tái sinh cây chuy n gen (Cheng và c ng s , 2004) 1.4 Các nghiên c u v chuy n gen vào ñ u cove Hi u su t chuy n gen vào ñ u thông qua Agrobacterium. .. khi ñ ng nuôi c y trong các nghiên c u chuy n gen thông qua Agrobacterium (Stachel và c ng s , 1986) Hi n nay, Car ñang ñư c s d ng ch y u trong các thí nghi m chuy n gen thông qua Agrobacterium vào ngô và lúa n ng ñ 100 mg/ (Cheng và c ng s , 2004) Và ñ i v i ñ u tương là cefotaxime 200mg/l, Car 250mg/l (Xue và c ng s 2006) - nh hư ng c a m t ñ vi khu n: M t ñ vi khu n Agrobacterium cao thư ng gây... Các y u t liên quan ñ n vi khu n g m: ch ng vi khu n, m t ñ vi khu n, th i gian lây nhi m, ho t tính c a gen vir, kh năng xâm nh p vào các câu ch và lo i vector - nh hư ng c a ki u gen: Nhìn chung, hi u qu chuy n gen r t khác nhau gi a các ki u gen c a cùng m t loài ða s các báo cáo, tài li u v chuy n gen ch ñ c p ñ n nh hư ng c a ki u gen ñ n kh năng chuy n T-ADN hay ph n ng nuôi c y in vitro - nh hư... 1.2.2 Tái sinh in vitro thông qua phát sinh callus Dillen và c ng s (2000) cho r ng tái sinh gián ti p thông qua c m ng hình thành callus phù h p cho chuy n gen ñ u cove b ng vi khu n Agrobacterium hơn tái sinh tr c ti p ch i t meristem Tuy nhiên cho t i nay, ch có b n báo cáo ñư c công b v vi c tái sinh ch i P vulgaris t callus Phát sinh hình thái ch i t callus v i ñ i tư ng ñ u cove ñư c báo cáo... ñ m b o cho s sinh sôi c a qu n th vi khu n ð khai thác và s d ng A tumefaciens như là m t vector chuy n gen các nhà khoa h c ñã lo i b các gen gây kh i u và gen mã hóa opine c a T-ADN và thay th vào ñó là các marker ch n l c, trong khi v n duy trì các vùng b ph i và b trái c a T-ADN và các gen vir Gen chuy n ñư c xen vào gi a các vùng b c a T-ADN Nó s ñư c chuy n vào t bào và tr nên h p nh t v i nhi... ñã có m t s nghiên c u theo hư ng ng d ng k thu t RNAi trong t o gi ng cây tr ng chuy n gen ch ng l i các b nh do virus gây ra Phòng Công ngh t bào th c v t - Vi n Công ngh sinh h c do Lê Tr n Bình và Chu Hoàng Hà ñ ng ñ u, là nhóm nghiên c u ñ u tiên Vi t Nam ñã thành công trong vi c ng d ng k thu t RNAi trong t o cây chuy n gen kháng virus M t trong nh ng k t qu c a ñ tài c p Vi n KH&CN Vi t Nam ñư . tài được thực hiện nhằm nghiên cứu chuyển gen vào đậu cove Phaseolus vulgaris. L thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Các chủng Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) được sử dụng. vật, dùng vi tiêm, chuyển gen thông qua con đường ống phấn,… Tuy nhiên, hai phương pháp thường sử dụng cho chuyển gen đậu cove là chuyển gen trực tiếp thông qua súng bắn gen và chuyển gen gián. tài Nghiên cứu chuyển gen vào ñậu cove (Phaseolus vulgaris L.) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ”. Mục ñích, yêu cầu Mục đích của đề tài nhằm xây dựng quy trình chuyển gen gus