B. Một số gen chỉ thị sàng lọc
1.6. Các nghiên cứu về chuyển gen RNAi vào cây trồng kháng côn trùng
MiRNA là những ựoạn RNA ngắn khoảng từ 19 - 22 nucleotide ựã ựược phát hiện từ lâu trong di truyền vi sinh vật, ựộng vật, thực vật và người. Nhưng mãi ựến năm 1993, lần ựầu tiên, việc tách ly và phân tắch ựịnh tắnh miRNA lin-4 và let-7 của tuyến trùng Caenorhabditis elegans mới ựược hoàn tất.
Hai miRNA này giữ vai trò quan trọng trong việc ựiều tiết ở thời kỳ phát triển nhộng (larval development) của loại tuyễn trùng này. Mặc dù công trình nghiên cứu về vai trò của miRNA trong tế bào chưa ựược hoàn toàn thành công, nhưng các chuyên gia ựã có bằng chứng cho thấy sự hiện diện của miRNA có liên quan ựến sự tăng trưởng của mô và tế bào. Khác với RNA thông tin (mRNA Ờ messenger RNA), miRNA không tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein, nên ựã ựược ựặt tên là non-protein coding RNA (RNA không mã hoá protein). Trong quá trình sinh học, miRNA Gene ựã ựược tác ựộng bởi enzyme RNA Polymerase II, chuyển hoá và tạo ra microRNA nguyên thủy, ựược gọi là pri-miRNA. đây là chuỗi RNA dài hàng nghìn base, và mang ựầu 5'-CAP, và ựầu 3' là gốc ựa A (Poly-A, AAAA...).
Pri-miRNAs chứa ựựng ắt nhất một hay nhiều vòng kẹp tóc (Hairpin), mỗi vòng dài khoảng ~ 70 nucleotides. Cũng như tất cả các RNA khác (kể cả mRNA), pri- miRNA bị tác ựộng cắt ựoạn bởi hai enzyme là DROSHA ở trong nhân và DICER ở trong tế bào chất (Cytoplasm). Sự cắt ựoạn này tạo ra các ựoạn miRNA có hoạt tắnh tương tự như siRNA (small interfering RNA). MiRNA kết hợp với RNA Interference (RNAi) dưới sự hiện diện của phức hợp RISC (RNA-induced Silencing Complex) sẽ tác ựộng lên một phần của mRNA dưới dạng kết hợp cặp base (Base-pairing) ựể tiết chế việc tiếp tục sinh sản hay phân giải mRNA ựã phát sinh trong tế bào.
John và Daniel (2011), Niu và cộng sự (2010), ựã nghiên cứu sự bảo vệ cây trồng chống côn trùng gây hại sử dụng can thiệp RNAi. đưa ra, sự can thiệp của RNA (RNAi) gây ra bởi sợi ựôi RNA (dsRNA) ngoại sinh ựã phát triển mạnh mẽ thành một kỹ thuật ựể ựiều hòa biểu hiện gen trong một loạt các sinh vật. Nghiên cứu ựầu tiên là trên Caenorhabditis elegans. độ nhạy của các small RNA (siRNAs) can thiệp phụ thuộc vào cách chuyển bằng con ựường cho ăn hay thậm chắ ngâm cơ thể C. elegans vào dung dịch chứa dsRNA. Tuy nhiên nó không ựược lặp lại ở các sinh vật khác. Sau phát hiện ựầu tiên trong tuyến trùng, sự hấp thu của dsRNA ựược giới hạn trong loài côn trùng mô hình Drosophila melanogaster (ruồi), hiệu ứng can thiệp RNA ựã ựược quan sát liên tục. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu gần ựây cho thấy ựầy ựủ các hiệu ứng can thiệp RNAi có thể xảy ra ở tất cả côn trùng, mặc dù họ ựang thay ựổi nghiên cứu trong cùng loài và từ loài sang loài.
Quy ựịnh cụ thể của biểu hiện gen thông qua cung cấp các dsRNA ựể có thể gây ra tử vong côn trùng, thông qua một loạt các thay ựổi kiểu hình, chẳng hạn như sự can thiệp vào quá trình phát triển, hoặc sự trao ựổi chất, hoặc phản ứng với môi trường, và hiệu ứng can thiệp của hệ thống RNAi ựã ựược theo dõi liên tục, ựáng chú ý là các rối loạn hầu hết thuộc bọ cánh cứng Tribolium confusum. Trong khi tiêm dsRNA vẫn là phương pháp ựược lựa chọn ựể chuyển vào côn trùng, thì một số loài bằng con ựường cung cấp dsRNA thông qua ăn cũng ựã ựược nghiên cứu thể hiện ựể tạo ra hiệu ứng can thiệp của RNAi. Hơn nữa, biểu hiện của gen dsRNAs chống lại côn trùng trong cây trồng chuyển gen ựã ựược chứng minh tác dụng can thiệp của RNAi ựủ khả năng bảo vệ chống lại côn trùng gây hại. Công nghệ này có tiềm năng là cơ sở tạo ra một thế hệ cây trồng mới, cây trồng biến ựổi gen chống lại các loại dịch hại, bổ sung cho công nghệ hiện có. Phát triển hơn nữa ựể cải thiện hiệu quả bảo vệ và mở rộng phạm vi của các loài bị ảnh hưởng là ựiều cần thiết.
Baum và cộng sự (2007) ựã ựề xuất một phương pháp kiểm tra, với gen từ WCR (western corn root - worm) ựược xác ựịnh từ thư viện cDNA và gen mã hóa cho các chuỗi polypeptide ựã ựược dự báo ựể cung cấp các chức năng sinh học chủ yếu ựược phân loại và trở thành các gen mục tiêu. Tổng cộng có 290 mục tiêu tiềm năng ựược xác ựịnh và tương ứng với dsRNAs ựược tổng hợp trong ống nghiệm, tác ựộng của chúng trên các ấu trùng ựược xác ựịnh thông qua chế ựộ ăn nhân tạo ựể thử nghiệm. Sử dụng cách này có tổng cộng 14 gen từ danh sách ban ựầu ựã ựược chứng minh cụ thể ở cuối ựường hướng biểu hiện của các trình tự mục tiêu ở nồng ựộ dsRNA thấp, kết quả là làm cho côn trùng không phát triển và tử vong. Trong nghiên cứu này các ông ựưa ra dsRNAs trực tiếp có khả năng tác ựộng vào ba gen mục tiêu (b-tubulin, V-ATPaseA và V-ATPase E) thông qua WCR dẫn ựến tử vong ấu trùng cao. Hiệu quả nhất của dsRNA là gen mã hóa cho V-type ATPase A, nó chứng tỏ cho khả năng knockdown nhanh chóng mRNA nội sinh trong vòng 24 giờ sau khi uống vào và kắch hoạt một phản ứng RNAi cụ thể với nồng ựộ thấp của dsRNA.
Một cách tiếp cận khác ựưa ra bởi Mao và cộng sự (2007) khi nghiên cứu sự tương tác giữa sâu ựục quả bông và quả bông ựã phát hiện ra gen CYP6AE14 trong P450 của cytochrome. Gen này tìm thấy có nồng ựộ cao trong ruột giữa của côn
trùng có biểu hiện tương quan tới sự phát triển của ấu trùng khi có Gossypol, là một hợp chất thứ cấp trong quả cây bông. Gen này giúp cho côn trùng có thể ựồng hóa Gossypol. Vì vậy tác ựộng ức chế biểu hiện của gen này sẽ làm cho ấu trùng nhạy cảm với hệ thống phòng thủ của cây. Sử dụng thuốc lá và Arabidopsis tạo dsRNAs nhằm ức chế gen CYP6AE14 chống lại sâu ựục quả. điều thú vị là dsRNA tạo ra từ
Arabidopsis dicer ựột biến (loại trực tiếp từ các gen DCL2, DCL3,DCL4 của A. Dicer) có tác ựộng ức chế biểu hiện của gen CYP6AE14.Nhóm của Mao và cộng sự gần ựây ựã báo cáo rằng họ ựã thiết kế thành công tạo cây bông chuyển gen kháng sâu ựục quả bông thông qua RNA mạch kép - CYP6AE14 và các cây chuyển gen cho thấy khả năng kháng Helicoverpa armigera.
