B. Một số gen chỉ thị sàng lọc
1.5. Các nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của VỜ ATPase ở côn trùng
Các loại V-ATPase ựã ựược biết ựến hơn 30 năm với 2 nhóm chắnh là F- ATPase và V-ATPase. Chúng là các cấu trúc vòng tròn nhỏ có chức năng giúp chuyển ựổi năng lượng của ATP thủy phân ựể trở thành năng lượng tiêu dùng cho các chức năng sinh học trong cơ thể sinh vật nhân chuẩn, bao gồm cả thực vật, ựộng vật và nấm. Chúng hoạt ựộng theo nguyên tắc của các bơm ion xuyên màng và chúng ựóng vai trò quan trọng trong nhiều phản ứng quan trọng do ựây là nơi sẽ cung cấp nguyên liệu (các cation hay H+ cần cho các cấu trúc cũng như hoạt ựộng khác). Vắ dụ như ở thực vật và nấm thì nó ựóng vai trò quan trọng trong việc là kênh vận chuyển Cl- ở không bào, còn ở ựộng vật là trong cấu trúc của lysosome tại quá trình axit hóa của các khoang endosoma.
Cấu trúc của V-ATPase ựược tìm thấy ựầu tiên ở trên màng endosoma, và hiện nay chúng ựược tìm thấy ngày càng nhiều trên màng plasma tại các bơm xuyên màng. Theo mô tả của ựa số các nhà nghiên cứu V - ATPases bao gồm một phức V1 bên trong tế bào chất, phức này chịu trách nhiệm về sự thủy phân của ATP, và một phức tạp V0 gắn trên màng có chức năng vận chuyển các ion từ trong ra ngoài và ngược lại. Các tiểu phần của phức V1 ựã ựược nghiên cứu kỹ càng về chức năng ắt nhất là 7 tiểu phần từ A ựến G. Ngược lại, các thành phần tiểu ựơn vị của V0 rất phức tạp và chưa ựược nghiên cứu rõ ràng.
Chú thắch:
+ Phức V0 gắn trên màng ruột có chức năng vận chuyển ion H+ ựược ký hiệu là các tiểu phần a, c, d. + Phức V1 phần màu vàng gồm các tiểu phần từ A ựến H nằm trong tế bào chất có chức năng thủy phân ATP giải phóng năng lượng.
Hình 1.2. Cấu trúc của H+ V Ờ ATPase (Kawasaki Nishi và Forgac, 2003)
Theo nghiên cứu của Sarjeet S. Gill và cộng sự (1992) ựã thành công trong việc tách ựược 2 tiểu phần A và c của V - ATPase từ ruột giữa và ống Malpighian của muỗi bằng cách sử dụng các trình tự amino acid bảo thủ cho việc thiết kế mồi oligonucleotide, nhân dòng cDNA cho hai tiểu ựơn vị của V-ATPase từ ruột giữa và ống Malpighian của ấu trùng muỗi Aedes aegypti. Các cDNA có kắch thước 3,1 kb của tiểu phần A, khu vực ngoại vi V1 xúc tác mã hóa cho một protein có khối lượng 68,6 kDa. Protein này có cấu trúc bảo thủ, bao gồm một ATP/GTP liên kết với nhau, tìm thấy trong tất cả các tiểu ựơn vị A khác. Phân tắch Southern bằng cách sử dụng các tiểu phần A như là một mẫu dò cho thấy chỉ có một bản sao duy nhất của gen trong muỗi Aedes aegypti. Các cDNA có kắch thước 0,85 kb của tiểu ựơn vị c của màng H+ ở vùng V0 mã hóa cho một protein. Protein này có bốn vùng xuyên màng và chứa một acid glutamic bảo thủ cũng như ựể liên kết cho
dicyclohexylcarbodiimide . Phân tắch Southern bằng cách sử dụng các tiểu phần phụ c là mẫu dò ựể thăm dò cho thấy sự hiện diện của gen liên quan nhiều hơn một trong bộ gen của muỗi Aedes aegypti. Phân tắch Pileup về các tiểu ựơn vị A khác nhau và các tiểu ựơn vị c cho thấy rằng những tiểu ựơn vị thuộc các cụm riêng biệt, trong ựó tất cả các protein của ựộng vật ngành chân ựốt thuộc cùng một nhóm.
Nghiên cứu của Hans Merzendorfer và cộng sự (1999) trong biểu mô ruột giữa ấu trùng của côn trùng Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae), H+ type V -
ATPase ựược tìm thấy trên ựỉnh của tế bào hình cốc, có chức năng sinh năng lượng cho alkalinization của màng ruột duy trì ựộ pH cao hơn 11. đối với phức V1, trình tự axit amin trong năm tiểu ựơn vị A, B, E, F, và G ở V ATPase của côn trùng ựã ựược lấy ra từ cDNAs nhân dòng và bằng chứng về sự tồn tại của tiểu ựơn vị D ựã ựược xác ựịnh nguồn gốc là từ các acid amin. đối với phức V0, cho ựến nay xác ựịnh ựược duy nhất chuỗi proteolipid 17-kDa và tiểu phần M40 có nguồn gốc từ cDNAs. Dựa trên một phần trình tự axit amin thu ựược từ một chuỗi polypeptide 20-kDa có mặt trong gel sau khi SDS-PAGE2 của holoenzyme côn trùng, ựã nhân dòng ựược trình tự cDNA mã hóa một protein 9,7-kD là một protein liên kết với phức V0.
Cấu trúc và chức năng của H+ V- ATPase trong côn trùng ựã ựược nghiên cứu và mô tả rõ ràng nhất trong các nghiên cứu của Helmut và cộng sự, (1999); U Klein, (1999); Helmut, (2000). H+ V-ATPases (V-ATPases) ựược tìm thấy tại hai ựịa ựiểm chắnh, trong màng endoplasma và plasma. Các V-ATPase trên màng plasma từ ruột giữa của ấu trùng Manduca sexta là nguồn cung cấp năng lượng duy nhất của tất cả các quá trình vận chuyển trung gian. Có 2 ựặc ựiểm quan trọng: thứ nhất là nơi rất giàu enzyme như:holoenzyme, cytosolic và chất hòa tan. Thứ 2 các quá trình vận chuyển ion của ruột giữa ựược kiểm soát chặt chẽ bởi các V Ờ ATPase. Cũng trong nghiên cứu này ựã ựưa ra V- ATPase gắn trên ựỉnh tế bào hình cốc trong ruột giữa ấu trùng Manduca sexta là nơi liên kết các hoạt ựộng và cung cấp năng lượng cho quá trình vận chuyển K+, tạo nên dòng vận chuyển trong ruột giữa. Tương tự các ông ựã nghiên cứu về vai trò của V - ATPase ựối với vận chuyển Na+ và Cl-. Tạo nên kênh vận chuyển ion hoàn chỉnh trong côn trùng.
Như vậy ta thấy bất kỳ tác ựộng nào vào cấu trúc hay chức năng của V- ATPase ựều có thể làm ảnh hưởng rối loạn ựến các quá trình chuyển hóa năng lượng, hấp thu dinh dưỡng của côn trùng.
