CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2.1.Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ựộ kháng sinh kanamycin ựến sức sống của mẫu cấy
của mẫu cấy
Trong quy trình chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn A. tumefaciens, việc sử dụng các kháng sinh ựể diệt khuẩn sau giai ựoạn ựồng nuôi cấy là không thể thiếu. Bởi vì ngoài tác dụng chuyển gen vào mô, tế bào thực vật thì A. tumefaciens cũng là một loài vi khuẩn gây bệnh, nếu ựể chúng phát triển quá mức có thể gây ảnh hưởng xấu ựến sức sống và khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy (Purnina và Kothari, 2004; Nagaraju và Sita, 1998; Hoshi và cộng sự, 2004). Kháng sinh diệt khuẩn ựược sử dụng ở ựây là cefotaxime, ựây là loại kháng sinh ựược sử dụng phổ biến trong việc diệt các vi khuẩn thuộc nhóm Gram (Ờ).
Do trong vector chuyển gen có chứa gen kháng kanamycin, ựây ựược xem là yếu tố chọn lọc của cây tái sinh sau chuyển gen nên việc nghiên cứu ngưỡng tác dụng gây chết của kanamycin ựối với ựậu cove GS012 là hết sức quan trọng. Từ kết quả của ngưỡng chọn lọc thu ựược thì chúng tôi sử dụng ựể bổ sung vào môi trường chọn lọc.
Từ những yêu cầu trên, chúng tôi tiến hành thắ nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ựộ kanamycin ựến sức sống và khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Kết quả theo dõi sau 3 tuần ựược thể hiện qua bảng 3.3.
Qua bảng trên ta thấy:
Kháng sinh kanamycin có ảnh hưởng xấu ựến sức sống của ựậu cove GS012. Ở nồng ựộ kanamycin 10 mg/l không gây chết mẫu tuy nhiên làm suy giảm sức sinh trưởng và ựẻ nhánh của mẫu, mẫu còi cọc lá nhỏ, các chồi nhanh bị úa vàng, callus tại chỗ tiếp xúc với môi trường bị hóa ựen sau 3 tuần nuôi cấy. Khi tăng nồng ựộ kanamycin lên 25 mg/l bắt ựầu xuất hiện cụm chồi chết từ tuần quan sát thứ 3. đặc biệt
khi nồng ựộ kanamycin từ 50mg/l ựến 100mg/l mẫu chết từ tuần quan sát thứ 2. Tỉ lệ mẫu chết tăng 13.33 % lên ựến 97,87% khi nồng ựộ kanamycin từ 25 ựến 100 mg/l.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng ựộ kháng sinh kanamycin ựến sức sống của mẫu cấy (sau 3 tuần)
Phát sinh hình thái Công thức Kanamycin (mg/l) Tỷ lệ mẫu chết (%) Tạo callus (%) Tạo chồi (số chồi/cụm chồi) Tạo rễ (%) đánh giá chồi tái sinh đC 0 0 100 3,64 12 +++ CT1 10 0 100 3,48 4 ++ CT2 25 13,33 100 3,18 4,40 + CT3 50 16,67 100 2,02 2,08 + CT4 75 74 100 1,62 0 + CT5 100 97,87 100 1,19 0 +
Ghi chú: Môi trường nuôi cấy: môi trường MSB5+20mg/l AS +2,5mg/l BA +0,1mg/l α-NAA+10%ND
+++: Chồi xanh, sinh trưởng tốt, hình thái bình thường ++: Chồi sinh trưởng chậm, nhỏ, lá vàng,Ầ
+: Các chồi bạc trắng do mất màu diệp lục
Kanamycin cũng có tác dụng ức chế mạnh mẽ ựến khả năng ra rễ và cảm ứng hình thành chồi của mẫu cấy. Tỷ lệ ra rễ giảm từ 12 % ở công thức không bổ sung kháng sinh xuống còn 0 % ở nồng ựộ 75 và 100 mg/l. Tại nồng ựộ kanamycin là 100 mg/l thì mẫu hoàn toàn không còn khả năng sinh trưởng. Tại nồng ựộ 75 mg/l thì tỷ lệ mẫu chết rất nhiều (74 %) và mẫu không có khả năng ra rễ (0 %).
Vì vậy, chúng ta có thể sử dụng kanamycin ở nồng ựộ 75 mg/l trở lên ựể làm ngưỡng chọn lọc cây sau chuyển gen.
đC
0mg/l kanamycin 10mg/l kanamycin 25mg/l kanamycin
50mg/l kanamycin 75 mg/l kanamycin
C T%
100mg/l kanamycin
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng ựộ kháng sinh Kanamycin ựến sức sống của mẫu cấy (sau 3 tuần)
Môi trường nuôi cấy: môi trường MSB5+20mg/l AS +2,5mg/l BA +0,1mg/l α-NAA+ 10%ND