B. Một số gen chỉ thị sàng lọc
1.4. Các nghiên cứu về chuyển gen vào ựậu cove
Hiệu suất chuyển gen vào ựậu thông qua Agrobacterium rất thấp khoảng 0.1 - 5% (Atkin và Smith, 1997; Veltcheva và cộng sự, 2005). Quy trình chuyển gen có hai bước chắnh. đầu tiên, gen chuyển phải ựược biến nạp vào tế bào. Không có khó khăn trong bước này với ựối tượng Phaseolus (Mc Clean và cộng sự, 1991). Thứ hai là tế bào chứa gen chuyển phải tổ hợp ổn ựịnh và tái sinh trong cây chuyển gen. Bước này chắnh là khó khăn chắnh khi thực hiện trên ựối tượng ựậu (Dillen và cộng sự, 2000).
Nghiên cứu ựầu tiên về sự mẫn cảm của ựậu cove với vi khuẩn A. tumefaciens
ựược thực hiện bởi Mc Clean và cộng sự (1991). Trong thắ nghiệm này, 19 kiểu gen khác nhau của P.vulgaris ựược lây nhiễm bởi ba chủng vi khuẩn A. tumefaciens khác
nhau. Mẫu sử dụng là ựốt lá mầm và trụ dưới lá mầm. Và kết quả ựã cho thấy một số lượng lớn các kiểu gen của ựậu cove mẫn cảm với sự lây nhiễm của ba dòng vi khuẩn A. tumefaciens. Tuy nhiên không thu ựược cây chuyển gen nào và quy trình này không còn ựược sử dụng trong các phòng thắ nghiệm khác nữa.
Franklin và cộng sự (1993) ựã tạo ựược ra callus kháng kanamycin từ ựĩa lá và trụ dưới lá mầm của ựậu cove lây nhiễm với dòng A. tumefaciens EHA101 có chứa gen gus. Những phân tắch về hóa sinh và phân tử ựã chỉ ra sự tổ hợp ổn ựịnh và biểu hiện của gen gus và sự không có mặt của Agrobacterium trong callus chuyển gen nhưng không thu ựược cây chuyển gen nào. Nagl và cộng sự (1997) tiến hành quy trình chuyển gen trên nhiều mô khác nhau của cây với Agrobacterium (trục phôi, trụ dưới lá mầm, mẩu trụ trên lá mầm, ựốt lá mầm, ựốt sơ cấp và lá sơ cấp). Sau khi gây vết thương và lây nhiễm, chồi tái sinh từ ựốt lá sơ cấp ựược chuyển sang môi trường chọn lọc. Tuy nhiên, cũng không thu ựược cây chuyển gen nào. Barros và cộng sự (1997) cũng ựưa ra báo cáo về tái sinh chồi cây ựậu có chứa gen gus bằng chuyển gen vào lá mầm bởi Agrobacterium và cũng không thu ựược cây chuyển gen. Liu và cộng sự (2005) cũng ựã miêu tả một quy trình chuyển gen sử dụng Agrobacterium cho ựậu thận ựể tạo ra cây chuyển gen T2. Gần ựây, Amugume và cộng sự (2011) ựánh giá tiềm năng của hai giống ựậu cove Mwitemania và Rose coco với phương pháp chuyển gen sử dụng dòng vi khuẩn
A.tumefaciens LBA4404 bằng việc sử dụng phôi hạt trưởng thành làm mẫu lây nhiễm. Tuy nhiên, biểu hiện gen gus không ựược quan sát ở giống Rosa coco nhưng phôi của giống Mwitemania lại cho thấy biểu hiện của gen gus.
Hiện nay trong chuyển gen cây họ ựậu người ta thường sử dụng 3 chủng
A.tumefaciens phổ biến là EHA101, EHA105 và LBA 4404, tuy nhiên hiệu quả của từng chủng ựối với mỗi ựối tượng cụ thể là khác nhau, phụ thuộc vào nồng ựộ lây nhiễm, thời gian lây nhiễm, loại vật liệu lây nhiễm, các chất kắch thắch liên quanẦ
Các tài liệu liên quan nghiên cứu về khả năng lây nhiễm của các chủng vi khuẩn A.tumefaciens phải ựược kể ựến Suratman và cộng sự (2010) khi các ông thực hiện thắ nghiệm chuyển gen vào lá mầm của Citrullus vulgaris. Nghiên cứu ựã chỉ ra
chủng A.tumefaciens EHA101 có hiệu quả hơn trong chuyển gen dưa hấu so với chủng LBA4404. đồng thời việc bổ sung thêm 200ộM acetosyringone vào môi trường giai ựoạn ựồng nuôi cấy cũng làm tăng hiệu quả chuyển gen.
đậu cove là cây 2 lá mầm có thể tạo ra lượng lớn hợp chất phenol, chất ựược phát hiện và sử dụng ựể kắch thắch vi khuẩn chuyển gen. Báo cáo của Balasubramani và cộng sự (2005), Wu và cộng sự (2008) cũng ựưa ra khi bổ sung từ 10ộg/l - 50ộg/l acetosyringone vào dung dịch vi khuẩn khi lây nhiễm làm tăng hiệu quả chuyển gen.
