B. Một số gen chỉ thị sàng lọc
1.3.7. Các yếu tố ảnh hưởng ựến hiệu quả biến nạp thông qua A.tumefaciens
Sự thành công trong việc tạo ra thực vật chuyển gen phụ thuộc vào một loạt các yếu tố như tần số biến nạp, tác nhân chọn lọc hoặc sàng lọc và khả năng tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh từ các tế bào và mô mang gen chuyển nạp.
đối với phương pháp chuyển gen thông qua A.tumefaciens thì tần số biến nạp phụ thuộc vào các yếu tố liên quan ựến vi khuẩn và các yếu tố liên quan ựến thực vật. Các yếu tố liên quan ựến vi khuẩn gồm: chủng vi khuẩn, mật ựộ vi khuẩn, thời gian lây nhiễm, hoạt tắnh của gen vir, khả năng xâm nhập vào các câu chủ và loại vector.
- Ảnh hưởng của kiểu gen: Nhìn chung, hiệu quả chuyển gen rất khác nhau giữa các kiểu gen của cùng một loài. đa số các báo cáo, tài liệu về chuyển gen chỉ ựề cập ựến ảnh hưởng của kiểu gen ựến khả năng chuyển T-ADN hay phản ứng nuôi cấy in vitro.
- Ảnh hưởng của dạng mẫu mô ựắch: các dạng mô ựược sử dụng làm mô ựắch ựể biến nạp là mô sẹo phôi hóa, phôi non của hạt hay huyền phù tế bào. Mẫu quá non hay quá già ựều ảnh hưởng ựến khả năng biến nạp. Nếu mẫu non, sức sống kém dẫn ựến tỷ lệ mẫu sống thấp, còn nếu mẫu quá già lúc này hệ gen thực vật ổn ựịnh dẫn ựến việc tiếp nhận gen ngoại lai trở nên khó khăn hơn.
- Ảnh hưởng của chủng Agrobacterium và plasmid: Các nghiên cứu chuyển gen thành công thông qua A.tumefaciens cho thấy hiện tại chỉ có 3 chủng vi khuẩn ựược sử dụng hiệu quả ở các loài cây một lá mầm ựó là LBA4404, C58 ựã bị bất hoạt và EHA101 và các chủng cải biên (EHA105 từ EHA101, AGL0 và AGL1 từ EHA101) (Cheng và cộng sự, 2004). Dạng Ti-plasmid của Agrobacterium cũng có vai trò trong quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật. Các nghiên cứu cho thấy, Ti-plasmid dạng nopalin có hiệu quả hơn trong việc lây nhiễm Agrobacterium vào ngô so với Ti-plasmid dạng octopin.
- Nhiệt ựộ: Ảnh hưởng của nhiệt ựộ trong quá trình ựồng nuôi cấy ựến hiệu quả chuyển T-ADN ựã ựược phát hiện ở các loài cây hai lá mầm. Nhiệt ựộ thắch hợp cho quá trình chuyển T-ADN có thể thay ựổi ựối với mỗi dạng mẫu mô biến nạp nhất ựịnh. Nhiệt ựộ thắch hợp cho chuyển gen bền vững cũng cần phải ựược ựánh giá với mỗi dạng mẫu mô ựắch và với mỗi chủng Agrobacterium biến nạp. Ở các loài cây một lá mầm nhiệt ựồng nuôi cấy thường là 24-25oC, một số trường hợp là 28oC. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ thấp (dưới 23oC) ựến khả năng chuyển T-ADN và chuyển gen bền vững ựã ựược ựánh giá. Biểu hiện gen bền vững gen gus tạm thời trong chuyển gen vào mô sẹo cây tỏi ựạt ựược cao nhất ở 22oC. Tần số chuyển gen cao hơn ựã nhận ựược ở phôi ngô non sau biến nạp ựược ựồng nuôi cấy ở 20oC so với 23oC (Frame và cộng sự, 2006).
- Ảnh hưởng của thành phần môi trường lây nhiễm và ựồng nuôi cấy: Thành phần môi trường cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng ựến hiêu quả chuyển gen.
Việc bổ sung acetosyringone chất kắch thắch sự hình thành các gen vir, ựã có trong hầu hết các quy trình chuyển gen ở cây một lá mầm. Trong trường hợp không có acetosyringone, mức ựộ biểu hiện tạm thời của gen gus rất thấp, không tái sinh ựược cây lúa và cây hành chuyển gen.
Gần ựây, việc sử dụng L-Cys bổ sung vào môi trường ựồng nuôi cấy ựã cải thiện hiệu suất chuyển gen của 3 dòng ngô (Frame và cộng sự, 2006).
- Ảnh hưởng của các chất kháng sinh ựể loại bỏ Agrobacterium: Các chất kháng sinh như: cefotaxime, Car, timentin thường ựược sử dụng loại bỏ vi khuẩn
sau khi ựồng nuôi cấy trong các nghiên cứu chuyển gen thông qua Agrobacterium (Stachel và cộng sự, 1986). Hiện nay, Car ựang ựược sử dụng chủ yếu trong các thắ nghiệm chuyển gen thông qua Agrobacterium vào ngô và lúa ở nồng ựộ 100 mg/ (Cheng và cộng sự, 2004). Và ựối với ựậu tương là cefotaxime 200mg/l, Car 250mg/l (Xue và cộng sự 2006).
- Ảnh hưởng của mật ựộ vi khuẩn: Mật ựộ vi khuẩn Agrobacterium cao thường gây chết tế bào thực vật giảm khả năng tái sinh của các tế bào sau khi biến nạp, dẫn tới giảm tần số chuyển gen bền vững. Tuy nhiên, mật ựộ vi khuẩn lây nhiễm cao là cần thiết ựối với chuyển gen vào các loài, các mẫu mô khó, tần số chuyển gen có thể ựược cải thiện bằng cách lây nhiễm thời gian ngắn, rửa mẫu sau khi lây nhiễm hoặc bổ sung các chất kìm hãm vi khuẩn vào môi trường ựồng nuôi cấy (Wei D. và Zhi-ming W, 2007).
Trong hầu hết các trường hợp, nếu quá trình chuyển T-ADN hiệu quả sẽ dẫn ựến khả năng chuyển gen bền vững cao. Mặc dù vậy, trong nhiều ựiều kiện quá trình chuyển T-ADN tăng ựã không có kết quả trong chuyển gen bền vững. Nguyên nhân có thể là do thiếu sự tương tác giữa quá trình chuyển T-ADN và chuyển gen bền vững. để có ựược sự phối hợp giữa chuyển T-ADN và chuyển gen bền vững thì các ựiều kiện lây nhiễm, ựồng nuôi cấy phải thắch hợp cho việc chuyển T-ADN và tái sinh cây chuyển gen (Cheng và cộng sự, 2004).
