CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2. Phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
2.3.2.1. Chuẩn dịch khuẩn lây nhiễm
Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 và LB 303 ựược cấy trên môi trường YM rắn có bổ sung kháng sinh thắch hợp và nuôi ở 28oC khoảng 48-72 giờ. Sau ựó, chúng ựược cấy vào 5ml môi trường YM lỏng có bổ sung kháng sinh 50mg/l kanamycin và nuôi ở 28oC có lắc (200 vòng/phút) khoảng 10 giờ. Giai ựoạn tiếp theo, chuyển 500ộl vi khuẩn sang 100ml môi trường YM bổ sung 50mg/l kanamycin và tiếp tục nuôi ở 28oC có lắc 200 vòng/phút khoảng 16-18 giờ. Ly tâm 50ml vi khuẩn ở 3500 vòng/phút trong 15 phút. Phần cặn (pellet) ựược làm loãng trong 50ml môi trường ựồng nuôi cấy lỏng và giữ ở nhiệt ựộ 28oC có lắc 200 vòng/phút từ 30-40 phút thu ựược dịch khuẩn lây nhiễm.
2.3.2.2. Lây nhiễm và ựồng nuôi cấy
Giống ựậu cove dùng ựể chuyển gen là giống GS012. Cây mầm 3 ngày tuổi ựược cắt bỏ phần lớn trụ hạ diệp và rễ, còn lại khoảng 3 - 5 mm trụ hạ diệp cách từ ựốt lá mầm xuống. Tiếp theo chẻ dọc trụ hạ diệp tách lá mầm thành hai mẫu cấy riêng biệt. Sau ựó cắt bỏ trụ thượng diệp, chồi ngọn, chồi bên và gần hết lá mầm,
của ựốt lá mầm. Khoảng 100 mẫu ựược lây nhiễm với 50 ml môi trường lây nhiễm trong 60 phút có lắc nhẹ (50-70 vòng/phút). Sau ựó mẫu ựược thấm khô trên giấy lọc vô trùng và cấy vào môi trường ựồng nuôi cấy, ựồng nuôi cấy trong tối ở nhiệt ựộ 25oC trong 3 ngày.
2.3.2.3. Rửa khuẩn
Mẫu sau khi ựồng nuôi cấy ựược rửa sạch khuẩn nhiều lần với nước cất vô trùng cho ựến khi nước trở lên trong. Cuối cùng ngâm và lắc nhẹ mẫu với 800mg/l kháng sinh cefotaxime 2 lần, mỗi lần 20 phút ựể loại bỏ khuẩn. Sau ựó, mẫu ựược thấm khô trên giấy lọc vô trùng và cấy vào môi trường diệt khuẩn với trụ hạ diệp và ựốt lá mầm ựược ựặt sâu vào trong môi trường một góc 45o ựể kắch thắch sự tạo chồi.
2.3.2.4. Chọn lọc và tái sinh
Khi mẫu ựã có phản ứng tạo chồi chuyển sang môi trường diệt khuẩn và chọn lọc, ựể chọn lọc chồi chuyển nạp gen.
2.3.2.5. Tạo rễ
Khi chồi phát triển có 3-6 lá thì cấy chuyển sang môi trường tạo rễ. Sau khi cây có rễ ựược chuyển vào chậu giá thể và trồng trong nhà thanh lọc trong ựiều kiện ánh sáng tự nhiên cho ựến khi thu hoạch.
2.3.2.6. Phân tắch sự biểu hiện gen gus
Hoạt tắnh GUS ựược xác ựịnh theo phương pháp của Jefferson và cộng sự (1987). Mẫu sau 3 ngày ựồng nuôi cấy ựược rửa sạch với nước cất vô trùng và thấm khô với giấy lọc vô trùng. Tiếp tục ngâm mẫu với ựệm GUS qua ựêm ở 37oC. Sau ựó mẫu ựược rửa với cồn ethanol 70% ựể loại diệp lục tố và ghi nhận sự biểu hiện gen gus.
đệm phân tắch gen GUS:
100 mM sodium phosphate buffer (pH 7,0) 0,5 mM potassium ferrocyanide
10 mM EDTA
1mM X-GLUC (ựược hòa với DMSO trước khi thêm vào ựệm GUS).
