CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy mô
2.3.1.1. Tạo nguồn mẫu ban ựầu
- Chọn hạt: Chọn những hạt ựúng giống, hạt to, ựều và mẩy, hạt không bị sâu, mọt và gãy, nát.
- Khử trùng: Hạt ựược rửa sạch bằng nước xà phòng loãng 30 giây. Tráng sạch bằng nước cất, tiến hành khử trùng bằng ethanol 70% trong vòng 30 giây. Tráng 2 lần bằng nước cất vô trùng. Tiếp tục sử dụng HgCl2 0,1% khử trùng kép trong vòng 10 phút, tráng lại bằng nước cất vô trùng ắt nhất 5 lần. Ngâm hạt qua ựêm trong nước cất vô trùng. Sau ựó chuẩn bị mẫu theo mô tả sau: Mẫu ựốt lá mầm (5-6mm) ựược cắt từ cây ựậu nảy mầm sau 3 ngày gieo hạt ựã bóc vỏ trên môi trường MSB5 (Hình 2.4). Cây mầm ựược cắt bỏ phần lớn trụ hạ diệp và rễ, còn lại khoảng 3 - 5 mm trụ hạ diệp cách từ ựốt lá mầm xuống. Tiếp theo chẻ dọc trụ hạ diệp tách lá mầm thành hai mẫu cấy riêng biệt. Sau ựó cắt bỏ trụ thượng diệp, chồi ngọn, chồi bên và gần hết lá mầm. Như vậy từ một cây mầm ban ựầu sẽ thu ựược hai mẫu cấy sử dụng cho các thắ nghiệm tiếp theo.
Hình 2.4. Mẫu chuyển gen: ựốt lá mầm (1) từ cây ựậu nảy mầm sau 3 ngày gieo cấy.
2.3.1.2. Môi trường nuôi cấy và ựiều kiện nuôi cấy.
Môi trường MS (Murashige và Skoog 1962) và bổ sung vitamin theo môi trường B5 (Gamborg 1968) (kắ hiệu là MSB5) ựược sử dụng làm môi trường nuôi cấy cơ bản, các thành phần chất ựiều tiết sinh trưởng hay kháng sinh ựược bổ sung thêm vào môi trường tùy thuộc vào mục ựắch nuôi cấy và giai ựoạn nuôi cấy khác nhau. Môi trường ựược bổ sung thêm agar 7g/l và chuẩn pH 5,8 sau ựó ựược hấp vô trùng 20 phút ở 121oC. Các chất ựiều tiết sinh trưởng và kháng sinh ựược lọc vô trùng bổ sung vào môi trường sau khi hấp ở nhiệt ựộ 50-60oC.
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn A. tumefaciens chủng LBA 4404 và LB 303:
Môi trường YM (Yeast extract - mannitol) Yearst extract (0,4 g/l) Mannitol (10 g/l) NaCl (0,1g/l) MgSO4.7H2O (0,2g/l) KH2PO4 (0,5g/l) pH 7,0
- Môi trường vào mẫu hạt
Môi trường MS (Murashige và Skoog 1962) và bổ sung vitamin theo môi trường B5(Gamborg 1968) (kắ hiệu là MSB5) bổ sung thêm 30 g/l saccarose + 7 g/l agar; pH 5,8.
- Môi trường ựồng nuôi cấy
Môi trường B5 (Gamborg 1968) bổ sung thêm: 30 g/l saccarose 0,88 g/l CaCl2.2H2O 0,5 g/l KNO3 0,5 g/l MgSO4.7H2O 0,8 g/l glutamine 1 mg/l adenine sulphate 5 mg/l BAP 0,1 mg/l NAA 200 ộM acetosyringone 3 g/l gelrite pH 5,8
- Môi trường diệt khuẩn và chọn lọc Môi trường MSB5 bổ sung thêm: 30 g/l saccarose
2,5 mg/l BA 0,1 mg/l α-NAA 10% nước dừa 400 mg/l cefotaxime
25 mg/l kanamycin 7 g/l agar
pH 5,8
- Môi trường ra rễ diệt khuẩn, chọn lọc Môi trường MSB5 bổ sung thêm: 30 g/l saccarose 1 mg/l IBA 1 mg/l GA3 400 mg/l cefotaxime 25 mg/l kanamycin 7 g/l agar pH 5,8
điều kiện nuôi cấy: Chế ựộ chiếu sáng 16 giờ sáng/ 8 giờ tối, cường ựộ chiếu
sáng: 2500 lux, nhiệt ựộ phòng nuôi cấy: 22ổ 2 0C .
2.3.1.3. Cách bố trắ thắ nghiệm
Hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức ựược bố trắ 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại gồm 3 bình, mỗi bình gồm 5 mẫu.
2.3.1.4. Các chỉ tiêu theo dõi
Theo dõi thắ nghiệm ựịnh kỳ từng tuần, Lấy kết quả vào tuần thứ 2 ở thắ nghiệm tái sinh, ra rễ, tuần thứ 3 ở thắ nghiệm nhân nhanh.
1. Thắ nghiệm tái sinh chồi
Tổng số mẫu sống
- Tỷ lệ mẫu sống (%) = x 100 Tổng số mẫu nuôi cấy
Tổng số mẫu tạo cụm chồi
- Tỷ lệ mẫu phát sinh cụm chồi (%) = x 100
Tổng số mẫu nuôi cấy
Tổng số mẫu tạo callus
- Tỷ lệ mẫu tạo callus (%) = x 100
Tổng số chồi ựơn
- Số chồi quan sát rõ =
Tổng số mẫu cấy
(Chồi quan sát rõ là chồi có thể quan sát ựầy ựủ thân, lá thật).
2. Thắ nghiệm nhân nhanh chồi:
Tổng số mẫu chồi thu ựược
- Hệ số nhân chồi /cụm chồi (lần) = x 100
Tổng số chồi ban ựầu
3. Thắ nghiệm tạo rễ Tổng số rễ - Số lượng rễ /cây (rễ) = Tổng số cây Tổng số mẫu tạo rễ - Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) = x 100 Tổng số mẫu