CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4.Nghiên cứu cải tiến quy trình chọn lọc ựậu cove chuyển gen
Từ các kết quả của nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành chuyển gen mang cấu trúc amiRNA ức chế biểu hiện gen V-ATPase của một số loài sâu hại ựậu ựỗ vào ựậu cove.
Giống sử dụng cho chuyển gen là GS012 ựược khử trùng ngâm qua ựêm rồi tiến hành tách bỏ vỏ và cấy vào môi trường MSB5. Cây mầm 3 ngày tuổi ựủ tiêu chuẩn cho cắt lấy mẫu ựốt lá mầm ựể chuyển gen. Từ một cây mầm ban ựầu tạo ựược hai mẫu ựốt lá mầm sử dụng cho chuyển gen
Cây mầm 3 ngày tuổi Mẫu ựốt lá mầm trên môi trường diệt khuẩn
Hình 3.6. Mẫu sử dụng chuyển gen
- Chuẩn bị dịch khuẩn lây nhiễm: OD600 ựạt 0,6-0,8
- Lây nhiễm và ựồng nuôi cấy: Mẫu sau khi lây nhiễm với khuẩn 60 phút ựược thấm khô và cấy vào môi trường ựồng nuôi cấy B5+5mg/lBA+0,1mg/l α-NAA +20mg/lAS +200ộM acetosyringone+30 g/l ựường+3g/l gelrite, pH: 5,8, ựồng nuôi cấy trong tối ở nhiệt ựộ 25oC trong 3 ngày cho ựến khi khuẩn mọc kắn mẫu.
- Rửa khuẩn: Mẫu sau khi ựồng nuôi cấy ựược rửa sạch khuẩn nhiều lần với nước cất vô trùng cho ựến khi nước trở lên trong. Cuối cùng ngâm và lắc nhẹ mẫu với kháng sinh 800 mg/l cefotaxime 2 lần, mỗi lần trong 20 phút ựể loại bỏ khuẩn. Do mẫu ban ựầu còn yếu chưa phát sinh chồi, nếu ựặt luôn vào trong môi trường chọn lọc thì khả năng tái sinh mẫu rất kém hầu hết các mẫu hóa ựen và chết. Do vậy, chúng tôi tiến hành giảm áp lực chọn lọc bằng cách cấy mẫu sau khi rửa khuẩn trong môi trường diệt khuẩn không bổ sung kháng sinh kanamycin: MSB5 + 2,5mg/l BA +
0,1mg/l α- NAA + 20mg/l AS + 800mg/l cefotaxime +30g/l ựường+ 7g/l agar, pH 5,8
Khi mẫu ựã có phản ứng tạo chồi ựược cấy chuyển sang môi trường diệt khuẩn và chọn lọc, ựể chọn lọc chồi chuyển nạp gen. Chúng tôi tiến hành chọn lọc theo hai phương pháp khác nhau
Phương pháp 1: Giữ nguyên mức kháng sinh chọn lọc kanamycin là 75mg/l và mức kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime là 800mg/l: Môi trường chọn lọc MSB5 + 20mg/l AS + 2,5mg/l BA + 0,1mg/l α-NAA + 75mg/l kanamycin + 800mg/l cefotaxime + 10%ND. Tiến hành chọn lọc 5 lần sau ựó chuyển sang môi trường ra rễ. Phương pháp 2: Giảm áp lực chọn lọc và số lần chọn lọc. Sử dụng nồng ựộ kháng sinh kanamycin ở mức bắt ựầu gây chết mẫu là 25mg/l và giảm nồng ựộ kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime là 400mg/l: MSB5 + 20mg/l AS + 2,5mg/l BA + 0,1mg/l α-NAA + 25mg/l kanamycin+ 400mg/l cefotaxime + 10%ND. Tiến hành chọn lọc 3 lần sau ựó chuyển sang môi trường ra rễ.
- Ra rễ: Các chồi sau khi chọn lọc lá xanh khỏe mạnh ựược chuyển sang môi trường ra rễ MSB5 +20mg/l AS + 1mg/l IBA+ 1mg/l GA3+ 400 mg/l cefotaxime Kết quả thu ựược thể hiện bảng 3.8:
Bảng 3.7. Kết quả chọn lọc cây chuyển gen theo các phương pháp khác nhau
Phương pháp Số lần chuyển gen Tổng số mẫu chuyển gen Tỉ lệ cây sống sau các lần chọn lọc (%) Tỉ lệ cây ra rễ (%) PP1 23 4278 1,94 0 PP2 18 4500 22,4 13,5
Trong quy trình chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens, việc bổ sung kháng sinh diệt khuẩn và chọn lọc vào môi trường nuôi cấy ảnh hưởng không nhỏ ựến khả năng tái sinh của mẫu chuyển gen (Purnima và Kothari, 2004; Nagaraju và Sita, 1998; Hoshi và cộng sự, 2004). đặc biệt, ựậu cove là cây rất mẫn cảm với kháng sinh do ựó khi tiến hành chọn lọc chồi chuyển gen ở môi trường chọn lọc MSB5+20mg/lAS+2,5mg/l BA+0,1mg/l α-NAA+75mg/l kanamycin+ 800mg/l cefotaxime + 10%ND thì hầu hết các mẫu sau chuyển gen bị bạc lá chết, các chồi còn sống sót vẫn có thể sinh trưởng phát triển tốt ở lần chọn lọc thứ 2. Nhưng từ lần
chọn lọc thứ 3 trở ựi, chồi gần như không sinh trưởng ựược, lá sinh trưởng rất kém, lá nhỏ co lại quăn queo, vàng úa, không ựẻ nhánh và kết quả thu ựược sau 5 lần chọn lọc chỉ có 1,94% mẫu sống sót. Khi tác ựộng kháng sinh mức cao (75mg/l kanamycin+ 800mg/l cefotaxime) trải qua 5 lần chọn lọc ựã tác ựộng không nhỏ tới sự sinh trưởng của chồi chuyển gen. Hơn nữa ựậu cove rất khó khăn cho việc ra rễ (Arnaldos và cộng sự, 2001) vì vậy mà các chồi còn sống sót sau 5 lần chọn lọc ựược chuyển sang môi trường ra rễ không thể ra rễ ựược do ựó cây không sống sót khi chuyển ra nhà lưới.
Khi tiến hành giảm nồng ựộ kháng sinh chọn lọc, kháng sinh diệt khuẩn (25mg/l kanmycin+ 400mg/l cefotaxime) và giảm số lần chọn lọc (3 lần) thu ựược tỉ lệ sống sót sau chọn lọc tăng ựáng kể 22,4 %. đặc biệt các chồi còn sống sót ở lần chọn lọc thứ 3 vẫn sinh trưởng phát triển tốt, lá xanh to khi chuyển sang môi trường ra rễ có khoảng 13,5% cây ra rễ sau khi cấy chuyển.
PP1(75mg/l kanmycin+800mg/l cefotaxime với 5 lần chọn lọc)
PP2(25mg/l kanmycin+400mg/l cefotaxime với 3 lần chọn lọc)
Hình 3.7. Chọn lọc cây chuyển gen theo các phương pháp khác nhau trên
Môi trường nuôi cấy: MSB5+20mg/lAS+2,5mg/l BA+0,1mg/l α-NAA+ 10%ND Hiệu suất chuyển gen vào ựậu thông qua Agrobacterium rất thấp khoảng 0,1 - 5% (Atkin và Smith, 1997; Veltcheva và cộng sự, 2005). Trong quá trình chuyển gen, gen chuyển biến nạp vào tế bào không quá khó khăn với ựối tượng Phaseolus
cove là gen chuyển dễ bị ựào thải, không tổ hợp ổn ựịnh và không tái sinh ựược trong cây chuyển gen (Dillen và cộng sự, 2000). đã có một vài báo cáo chuyển gen thành công trên cây họ ựậu thông qua vi khuẩn A. tumefaciens: đậu Hà Lan (Grant và Cooper 2006), ựậu tương (Paz và cộng sự 2006, lạc (Sharma và Pooja, 2006). Tuy nhiên hầu như chưa có công bố nào chuyển gen thành công trên ựối tượng ựậu cove thông qua vi khuẩn Agrobacterium. Các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc xây dựng hệ thống tái sinh ựậu cove, nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng ựến quá trình chuyển gen vào ựậu cove : mẫu chuyển gen, chủng vi khuẩn, thời gian biến nạp... và khả năng biểu hiện gen gus trên cây ựậu. Quá trình chuyển gen vào ựậu cove thông qua vi khuẩn A. tumefaciens rất khó khăn phụ thuộc rất nhiều yếu tố: chủng
A.tumefaciens, thời gian ựồng nuôi cấy, mẫu chuyển gen, giống ựậu sử dụng cho chuyển gen... (James và cộng sự, 2012). Việc sử dụng áp lực chọn lọc quá lớn và chọn lọc nhiều lần thì khả năng thu ựược cây chuyển gen càng khó khăn hơn. Do ựó, tiến hành giảm áp lực chọn lọc trong quá trình chọn lọc cây chuyển gen giúp tăng số lượng mẫu biểu hiện tạm thời mang gen chuyển tăng xác suất thu ựược cây ựậu cove chuyển gen.