Nghiên cứu chuyển gen chịu lạnh atcbf1 trên cây thuốc lá nicotiana tobacum l thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM  - CHU THỊ NGỌC ÁNH Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN CHỊU LẠNH AtCBF1 TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tobacum L) THƠNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefacciens” KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Khóa học : Chính quy : Cơng nghệ Sinh học : CNSH - CNTP : 2014 - 2018 Thái Nguyên - 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM -  - CHU THỊ NGỌC ÁNH Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN CHỊU LẠNH AtCBF1 TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tobacum L) THƠNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens” KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Lớp Khoa Khóa học Giảng viên hướng dẫn : Chính quy : Công nghệ Sinh học : K46 - CNSH : CNSH - CNTP : 2014 - 2018 : TS Nguyễn Tiến Dũng GS TS Ngơ Xn Bình Thái Nguyên - 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen chịu lạnh AtCBF1 thuốc (Nicotiana tobacum L) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” cơng trình nghiên cứu độc lập khơng có chép người khác Đề tài sản phẩm mà nỗ lực nghiên cứu trình học tập khoa CNSH-CNTP trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Trong trình viết có tham khảo số tài liệu có nguồn gốc rõ ràng, hướng dẫn TS Nguyễn Tiến Dũng GS TS Ngô Xuân Bình Tơi xin cam đoan có vấn đề tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm Thái Ngun, ngày tháng năm 2018 Sinh viên thực Chu Thị Ngọc Ánh ii LỜI CẢM ƠN Được đồng ý Ban giám hiệu nhà trường Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, thời gian thực tập tốt nghiệp em thực đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen chịu lạnh AtCBF1 thuốc (Nicotiana tobacum L) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” Trang khoá luận em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm thầy cô giáo Khoa tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo TS Nguyễn Tiến Dũng thầy giáo GS TS Ngơ Xn Bình, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm tận tình bảo, giúp đỡ hướng dẫn em thời gian thực đề tài Đồng thời, em xin cảm ơn ThS Ma Thị Hoàn giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em suốt trình thực tập tốt nghiệp Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình tạo điều kiện vật chất chỗ dựa tinh thần cho em suốt thời gian thực tập, cảm ơn bạn bè hết lịng động viên, giúp đỡ tơi suốt thời gian qua Trong trình thực tập, q trình làm báo cáo thực tập thời gian có hạn, trình độ kỹ thân cịn nhiều hạn chế nên đề tài tránh khỏi sai sót Em mong nhận ý kiến đóng góp thầy bạn để đề tài em hoàn thiện Lời cuối em xin kính chúc thầy, giáo nhà trường, khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ thực phẩm, bạn đồng nghiệp sức khoẻ, thành công sống Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2018 Sinh viên thực Chu Thị Ngọc Ánh iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii Phần MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Nội dung nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan tính chống chịu (stress) thực vật 2.1.1 Khái niệm stress 2.1.2 Tính chất tác nhân gây stress 2.1.3 Phản ứng thực vật với stress 2.2 Ảnh hưởng stress đến sinh trưởng phát triển trồng 2.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ thấp đến sinh trưởng phát triển trồng 2.2.2 Ảnh hưởng tính chịu hạn đến sinh trưởng phát triển trồng 2.3 Nghiên cứu nâng cao tính chống chịu nhiệt độ thấp thực vật 2.3.1 Trên giới 2.3.2 Ở Việt Nam 2.4 Đặc điểm gen CBF1 2.5 Chuyển gen thực vật 12 2.5.1 Khái niệm chuyển gen thực vật 12 iv 2.5.2 Các phương pháp chuyển gen cho trồng 12 Phần VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 21 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 21 3.1.2 Hóa chất 21 3.1.3 Thiết bị thí nghiệm 22 3.2 Nội dung nghiên cứu 22 3.3 Phương pháp nghiên cứu 23 3.3.1 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen 23 3.3.2 Phương pháp chuyển gen thuốc 26 3.3.4 Phân tích chuyển gen phương pháp PCR 28 3.3.5 Các tiêu đánh giá 29 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Thiết kế vector chuyển gen 30 4.3 Chọn lọc phân tích hiệu chuyển gen 34 4.4 Phân tích biểu gen chuyển AtCBF1 thuốc 36 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Đề nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC v DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ADP Adenosine Diphotphat As Acetosyringone ACS Agrocinopine Synthase ATP Adenosin Triphosphat BAP Benzylaminopurine Bp Base pair BSA Bovine Serum Albumin CBF C-repeat Binding Factors CNSH Công Nghệ Sinh Học cs Cộng CTAB Cetyltrimethylammonium Bromide DREB Dehydration-Responsive Element-Binding DNA Deoxynucleic acid dNTPs Deoxy Nucleoside Triphosphate EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid Kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria Bertani LB Left Border MAS Maker- Assisted Selection MCS Multi Cloning Site MS Murashige Skoong (1962) NAA α- Naphthalenne Acetic Acid NAD Nicotinamide Adenine Dinucleotide NIL Nearly Isogenic Lines NOS Nopaline Synthase OD Optical Density vi PCR Polymerase Chain Reaction PMI Phosphomanose Isomerase QTL Quantitative Trait Loci RB Right Boder RMOP Regeneration Medium for Organogenesis Plant RNA Ribonucleic Acid ROS Reactive Oxygen Species RFLP Restriction Fragment Length Polymorphismtg SDS Sodium Dodecyl Sufate TAE Tris bazơ - Axit acetic - EDTA T-DNA Tranfer - DNA TE Tris HCl - EDTA, pH = Ti - plasmid Tumor inducing plasmid UV Ultraviolet v/p Vòng/phút Vir Virulence vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 3.2 Thành phần môi trường sử dụng chuyển gen 27 Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR 29 Bảng 3.4: Chương trình thực phản ứng PCR 29 Bảng 4.1 Kết chuyển gen CBF1 thuốc thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 34 Bảng 4.3 Kết đánh giá hiệu chuyển gen CBF1 thuốc 37 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopyne 15 Hình 2.2 Ti-plasmid A.tumefaciens dạng nopalin 16 Hình 2.3 Sự tương tác Agrobacterium với tế bào thực vật 19 Hình 4.1 Hình vẽ cấu trúc vector nhân dòng vector chuyển gen AtCBF1 30 Hình 4.2 Kết kiểm tra khuẩn lạc mang gen AtCBF1 PCR enzyme cắt giới hạn 31 Hình 4.3 Hình ảnh mơ tả q trình biến nạp tái sinh tạo thuốc chuyển gen 36 Hình 4.4 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi AtCBF1 39 36 A D G B C E F H K L Hình 4.3 Hình ảnh mơ tả q trình biến nạp tái sinh tạo thuốc chuyển gen (A): Cây thuốc gieo trồng in vitro 15 ngày tuổi; (B): Lá thuốc vô trùng dùng cho biến nạp; (C): Mảnh ngâm dịch huyền phù vi khuẩn mang vector chuyển gen; (D): Mảnh môi trường đồng nuôi cấy; (E): Mảnh môi trường chọn lọc; (F): Các mảnh không biến nạp đặt môi trường bổ sung kháng sinh vàng dần chết; (G): Tái sinh đa chồi; (H): Kéo dài chồi; (K): Ra rễ tạo hoàn chỉnh; (L): Ra bầu trấu cát 4.4 Phân tích biểu gen chuyển AtCBF1 thuốc Đánh giá hiệu chuyển gen, thí nghiệm tiến hành phương pháp: Sử dụng phương pháp đĩa (leaf-disk) phân tích PCR Mỗi thí nghiệm chọn ngẫu nhiên Kết nghiên cứu trình bày bảng 4.3 37 Bảng 4.3 Kết đánh giá hiệu chuyển gen CBF1 thuốc Thí nghiệm Cây thí nghiệm Đ/c TN1-1 TN1-2 TN1-3 TN2-1 TN2-2 TN2-3 TN3-1 TN3-2 TN3-3 TN4-1 TN4-2 TN4-3 TN5-1 TN5-2 TN5-3 TN6-1 TN6-2 TN6-3 TN7-1 TN7-2 TN7-3 TN8-1 TN8-2 TN8-3 TN9-1 TN9-2 TN9-3 TN10-1 TN10-2 TN10-3 31 TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 TN7 TN8 TN9 TN10 Tổng cộng Số mẫu sống sót mơi trường kháng sinh sau ngày 14 ngày 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 30 30 Ghi chú: (+): mẫu dương tính (-): mẫu âm tính Kết PCR _ + + + + + _ + _ + + + + + + + + + _ + + _ + + + + + + + + + 38 Đánh giá biểu gen thông qua gen chọn lọc kanamycin: Cắt để nuôi cấy mơi trường có bổ sung kanamycin 25mg/l Sau 14 ngày theo dõi cho thấy tất thí nghiệm sống sót, đối chứng (Đ/c) chết sau ngày xử lý (bảng 4.3, hình4.3F) Để có kết xác hơn, tiến hành tách chiết DNA tổng số phân tích PCR với cặp mồi đặc hiệu AtCBF1 Kết cho thấy 4/30 mẫu thí nghiệm chuyển gen âm tính (bảng 4.3, hình 4.3) Xác định xem gen chuyển vào có tiếp tục phiên mã hoạt động hay không cách kiểm tra có mặt gen cấu trúc mang gen AtCBF1 chuyển vào phản ứng PCR với cặp đoạn mồi đặc hiệu PCR cho phép nhân số lượng lớn nguyên đoạn DNA thời gian ngắn Đây phương pháp thường dùng phân tích dịng chuyển gen độ tin cậy cao Theo lí thuyết ta cung cấp cặp mồi đặc hiệu nhân xác đoạn gen nằm hai mồi Khi tiến hành PCR DNA tách từ chuyển gen, cho kết đặc hiệu với cặp mồi ta kết luận mang đoạn gen cần chuyển Trong q trình làm thí nghiệm chúng tơi tạo 95 chuyển gen đến bầu đất Nhưng điều kiện thí nghiệm nên tiến hành thu thuốc sau chọn lọc để tách chiết kiểm tra Sau tách chiết DNA, tiến hành điện di gel agarose 1% để kiểm tra thu kết sau: 39 Hình 4.4 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi AtCBF1 Ghi chú: (+) Đối chứng dương (-) Đối chứng âm M: Thang DNA chuẩn 1: TN1-1 7: TN3-1 13: TN5-1 19: TN7-1 25: TN9-1 2: TN1-2 8: TN3-2 14: TN5-2 20: TN7-2 26: TN9-2 3: TN1-3 9: TN3-3 15: TN5-3 21: TN7-3 27: TN9-3 4: TN2-1 10: TN4-1 16: TN6-1 22: TN8-1 28: TN10-1 5: TN2-2 11: TN4-2 17: TN6-2 23: TN8-2 29: TN10-2 6: TN2-3 12: TN4-3 18: TN6-3 24: TN8-3 30: TN10-3 Theo kết qủa hình 4.4 30 mẫu thuốc chuyển gen có 26 mẫu cho kết dương tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu AtCBF1-F AtCBF1-R, thu sản phẩm có kích thước khoảng 634 bp tương ưng vs tính tốn kích thước gen AtCBF1 theo lý thuyết Bước đầu chứng tỏ mẫu mang gen AtCBF1 Trong 30 mẫu có mẫu cho kết âm tính với PCR cho thấy mẫu ko chứa gen AtCBF1 Đối chứng dương plasmid pER8-UBQ14::AtCBF1 làm khuôn mẫu Đối chứng âm sản phẩm PCR sử dụng khuôn mẫu ADN tổng số tách chiết từ thuốc không chuyển gen cho kết âm tính Điều đảm bảo đoạn gen khơng có sẵn khơng chuyển gen Như vậy, kết dương tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu AtCBF1-F AtCBF1-R 30 thuốc chuyển gen chứng tỏ thuốc có mang cấu trúc gen cần chuyển 40 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Thiết kế thành công vector chuyển gen pER8-UBQ14::AtCBF1 phục vụ công tác chuyển gen trồng cà chua, khoai tây, lúa, Đề tài chuyển thành công gen chịu nhiệt AtCBF1 vào thuốc thông qua vi khuẩn A.tumefaciens chủng GV3101 Tỷ lệ chuyển gen thông qua chọn lọc kháng sinh kanamycin kết tái sinh chuyển gen thu 95 Kết kiểm tra ngẫu nhiên 30 chuyển gen PCR thu 26/30 dương tính với cặp mồi đặc hiệu AtCBF1 Các trồng nhà lưới sinh trưởng tốt 5.2 Đề nghị Do thời gian thực tập có hạn đề tài chưa tiến hành đánh giá đầy đủ khả biểu gen AtCBF1 chuyển gen Vì để có sở chắn chuyển gen AtCBF1 trồng khác lúa, ngô, cà chua cần tiến hành nghiên cứu tiếp nội dung sau: Nghiên cứu mức độ biểu gen mức độ RNA protein thông qua phân tích RT-PCR Westernblot Đánh giá khả chịu lạnh chuyển gen điều kiện nhiệt độ thấp 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt Bùi Hoàn Hảo (1993), Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào bảo quản, nhân giống chọn dòng chịu lạnh khoai lang (Ipomoea batatas L.), Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, Nxb Nơng Nghiệp Phạm Đình Thái, Nguyễn Duy Minh, Nguyễn Lương Hùng (1987), Sinh lý học thực vật, Nxb GD, Hà Nội Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, Nxb NN, Hà Nội Nguyễn Quang Thạch (2006), Bài giảng công nghệ sinh học thực vật, Đại học Nông nghiệp Hà Nội Trần Quốc Dũng, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006), Công nghệ chuyển gen động vật, thực vật, Huế 2006 II Tài liệu nước Aiqiu Xing, Zhangyuan Zhang, Shirley Sato, Paul Staswick, and Tom Clemente, “ The use of the two T-DNA binary system to derive market-free transgenic soybeans“, In Vitro Cell Dev Biol.Plant 36:456 - 463 Alicja Ziemienowicz (2001), “Odyssey of Agrobacterium T-DNA“, Vol 48 No 3, pp 623- 635 B Gail McLean, Elizabeth A Greene, and Patricia C Zambryski (1994) “Mutants of Agrobacterium V1rA That Activate vir Gene Expression in the Absence of the Inducer Acetosyringone", The Journal of Biological Chemistry, Vol.269, No 4, pp 2645-2651 10 Craig R Pigott and David J Ellar (2007),”Role of Receptors in Bacillus thuringiensis Crystal Toxin Activity”, MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS, Vol 71, No 2, p 255-281 11 Chang - Jin Park and Young - Su Seo, 2015 Heat shock protein: A review of the moleculer Chaperones for plant immunity 42 12 Daphna Frenkiel-Krispin, Sharon GrayerWolf, Shira Albeck, Tamar Unger, Yoav Peleg, Jossef Jacobovitch, YigalMichael, Shirley Daube, Michal Sharon, Carol V Robinson, Dmitri I Svergun, Deborah Fass, Tzvi Tzfira, and Michael Elbaum (2007), “Plant Transformation by Agrobacteriumtumefaciens modulation of single-straned DNA- VirE2 complex assembly by VirE1“, The Journal of Biological Chemistry, Vol 282, No 6, pp 3458-3464 13 Futsuhara T, K Toriyama 1964 Studies on testing methods of cold resistance in rice Jpn J Breed 14:166-172v 14 Futsuhara Y, K Toriyama 1966 Genetic studies on cool tolerance in rice III Linkage relations between genes controlling cool tolerance and marker genes of Nagao and Takahashi Jpn J Breed 16: 19-30 15 Fischhoff, D.A, Bowdish, K.S, Perlak, F.J, Marone, P.G, MvCormick, S.M, Niedermeyer, J.G, Dean, D.A, Kusano-Kretzmer, K, Mayer, E.J, Rochester, D.E, Rogers, S.G and Fraley, R.T (1987), Insect tolerant tomatoplants, BioTechnology 5:807-812 16 Graham D., Patterson B.D (1982) Responses of plant to low non - Physiol 33, 347-372 17 Guy C.L (1990) Cold acclimation and freezing stress tolerance: Role of protein metabolism Ann, Rev Plant Physiol Mol Biol 41, 187-223 18 Gulzar SS, Shabir HW, Wasim H, Singh NB (2011) Engineering cold stress tolerance in crop plants Curr Genomics 12(1): 30-43 19 Hayase H, T Sasake, N Nishiyama, N Ito 1969 Male sterility caused by cooling treatment at the young microspore stage in rice plants II The most sensitive stage to cooling and the fertilizing ability of pistils Proc Crop Sci Soc Japan 38:706-711 20 Hayashi T, Y Ukai 1994 Detection of additive and dominance effects of QTLs in interval mapping of F2 RFLP data Theor Appl Genet 87:1021-1027 43 21 Hu W, Hu G and Han B (2009) Genome-wide survey and expression profiling of heat shock proteins and heat shock factors revealed overlapped and stress specific response under abiotic stresses in rice Plant Sci 176: 583-590 22 Jelili T.Opabode, “Agrobacterium-mediated transformation of plants: emerging factors that influence efficiency“, Biotechnology and Molecular Biology Review Vol (1), pp 12-20 23 Kaneda C, HM Beachell 1973 Response of japonica - indica rice hybrids to low temperatures SABRAO J 6:17-32 24 Kasamo K (1988) Response of tonoplas and membrane ATPase in chilling sensitive and insensitive rice (Oryza sativa L.) culture cells to low temperature Plant Cell Physiol 29, 1085-1094 25.Kirankumar S Mysore, Burgund Bassuner, Xiao-bing Deng, Nune S Darbinian, Andrei Motchoulski, Walt Ream, and Stanton B Gelvin (1998), “Role of the Agrobacterium tumefaciens VirD2 Protein in T-DNA Transfer and Integration“, MPMI, Vol 11, No 7, pp 668-683 26 Lan-Ying Lee and Stanton B Gelvin (2008), “T-DNA Binary Vectors and Systems“, Plant Physiology, Vol 146, pp 325-332 27 Mutasim M Khalafalla, Hany A El-Shemy, Shaikh M Rahman, Masayoshi Teraishi, Hisakazu Hasegawa, Teruhiko Terakawa and Masao Ishimoto, “Efficient production of transgenic soybean (Glycine max [L] Merrill) plants mediated via whisker-supersonic (WSS) method“, African Journal of Biotechnology Vol (18), pp 1594-1599 28 Mary Dell Chilton, Randall K Saiki, Narendra Yadavt, Milton P Gordon and Francis Quetieri (1980), “ T-DNA from Agrobacterium Ti plasmid is in the nuclear DNA fraction of crown gall tumor cells“, Proc Nati Acad Sci USA, Vol 77, No 7, pp 4060-4064 29 Murray MG, WF Thompson 1980 Rapid isolation of high molecular weight plant DNA Nucleic Acids res 8:4321-4325 44 30 Margie M Paz, Huixia Shou, Zibiao Guo, Zhanyuan Zhang, Anjan K Banerjee, Kan Wang (2004), “Assessment of conditions affecting Agrobacteriummediated soybean transformation using the cotyledonary node explant“, Euphytica 136: 167-179 31 Mohammad Alimohammadi and Mohammad B Bagherieh-Najjar, (2009), “Agrobacterium-mediated transformation of plants: Basic principles and influencing factors“, African Journal of Biotechnology Vol (20), pp 51425148 32 Muhammad Zia, Zarrin Fatima Rizvi, Riaz-Ur-Rehman and M Fayyaz Chaudhay (2010), “Agrobacterium mediated transformation of soybean (Glycine max L.) some conditions standardization”, Pak J Bot., 42(4): 2269-2279 33 Nishiyama I 1976 Male sterility caused by cooling treatment at the young microspore stage in rice plants XIII Ultrastructure of tapetal hypertrophy without primary wall Proc Crop sci Soc japan 45:270-278 34 Oka H, H Morishima 1967 Variations in the breeding systems of a wild rice, Oryza perennis Evolution 21:249-258 35 R Walden, B Reiss,C Koncz, and J Schell (1997), “ The impact of Tiplasmid-derived gene vector on the study of the mechanism of action of phytohormones“, Annu Rev Phytopathol 35:45-66 36 Satake T, H Hayase 1970 Male sterility caused by cool treatment at the young microspore stage in rice plants V Estimation of pollen developmental stage and the most sensitive stage to coolness Proc Crop Sci Soc Japan 39:468-473 37 Sawada S 1978 Study of sterile-type cool injury in rice plants with special reference to the mechanism and inheritance of sterility Res Bull Obihiro Univ 10:837-883 38 Scott E Stachel, Eugene W Nester and Patricia C Zambrysky, (1986) “ A plant cell factor induces Agrobacterium tumefaciens vir gene expression“, Proc Natl Acad Sci USA, Vol 83, pp 379-383 45 39 Satake T 1991 Male sterility caused by cool treatment at the young microspore stage in rice plants XXX Relation between fertilization and the number of engorged pollen grains among spikelets cooled at different pollen developmental stages Jpn J Crop Sci 60:523-528 40 Saito A, M Yano, N Kishimoto, M Nakagahra, A Yoshimura, K Saito, S Kuhara, Y Ukai, M Kawase, T Nagamine, S Yoshimura, O Ideta, R Oshawa, Y Hyano, N Iwata, M Sigiura 1991 Linkage map of restriction fragment length polymorphism loci in rice Jpn J Breed 41:665-670 41 Satake T, M Shibata 1992 Male sterility caused by cool treatment at the young microspore stage in rice plants XXXI Four components participating in fertilization Jpn J Crop Sci 61:454-462 42 Saito K, K Miura, K Nagano, Y Hayano-Saito, A Saito, H Araki, A Kato 1995 Chromosomal location of quantitative trait loci for cool tolerance at the booting stage in rice variety “Norin-PL8” Breed Sci 45:337-340 43 Saito K, K Miura, K Nagano, Y Hayano-Saito, H Araki, A Kato 2001 Identification of two closely linked quantitative trait loci for cold tolerance on chromosome of rice and their association with anther length Theor Appl Genet 103:862-868 44 Suzuki S 1981 Cold tolerance in rice plants with special reference to the floral characters I Varietal differences in anther and sigma lengths and the effects of planting densities on these characters Jpn J Breed 31:57-64 45 Takahashi M, T Kinoshita, K Takeda 1973 Character expression of some major genes in rice and their agronomic application J Facul Agr Hokkaido Univ 57:275-293 46 Tanno H, J Xiong, L Dai, C Ye 1999 Some characteristics of cool weathertolerant rice varieties in Yunnan province, China Jpn J Crop Sci 68:508-514 47 Topping TF (1988), Tobaco tranfomation Methods of Molecular Biology, 81:365 48 Trieu A T., S H Burleigh, I V Kardailsky, I E Maldonado-Mendoza, W K Versaw, L A Blaylock, H Shin, T J Chiou, H Katagi, G R Dewbre, D 46 Weigel and M J Harrison (2000) “Technical Advance: Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium” Plant J, (22), pp 531-541 49 Tzvi Tzfira and Vitaly Citovsky (2006), “Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology“, Current Opinion in Biotechnology, 17:147-154 50 Timperio A M., M.G Egidi, L.Zolla 2008 Proteomics applied on plant abiotic stresses: Role of heatshock proteins (HSP) JOURNAL OF PROTEOMICS 71 (2008): 391-411 51 Tran Thi Cuc Hoa, Tran Vu Hai and La Cao Thang (2008), “Transformation efficiencies of the soybean variety PC 19 [Glycine max (L.) Merrill] using Agrobacterium tumefaciens and the cotyledonary node method “, Omonrice 16: 1-8 52 Tetsuya Yamada, Satoshi Watanabe, Maiko Arai, Kyuya Harada, Keisuke Kitamura (2010),“Cotyledonary node pre-wounding with a micro-brush increased frequency of Agrobacterium-mediated transformation in soybean“, Plant Biotechnology, 27, 217-220 53 Ukai Y, R Oshawa, A Saito 1991 MAPL: a package of microcomputer programs for RFLP linkage mapping Rice Genetics Newsl 8:155-158 54 Wang, W., Vinocur, B., Shoseyov, O and Altman, A 2004 Role of plant heatshock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response Trends Plants Sci 9: 244-252 55 Zidenga T (2005) Improving stress tolerance through energy homeostasis in plants Department of Plant Cellular and Molecular Biology, Ohio State University III Tài liệu Web 56 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/828653 - NCBI 57 JianLi YaqingWang BoYu QipingSong YangLiu Tony H.H.Chen GangLi XinghongYang (May 2018), Plant Science, 221-233.) https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168945217307781 58 NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28175921) 47 59 NCBI - Singh S , Rathore M, Goyary D, Singh RK, Anandhan S, Sharma DK, Ahmed Z Khoa Sinh học Phân tử Bộ phận Kỹ thuật Di truyền, Viện Nghiên cứu Năng lượng Sinh học Quốc phòng, Haldwani 263 139, Uttarakhand, Ấn Độ 2011 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21287175/ PHỤ LỤC Thành phần dung dịch MS Macro 10x (mg/l) NH4NO3 16500,0 KNO3 19000,0 KH2PO4 1700,0 MgSO4.7H2O 3700,0 CaCl2.2H2O 4400,0 Thành phần dung dịch MS Micro 1000x (mg/l) H3PO3 62,0 MnSO4.4H2O 223,0 ZnSO4.4H2O 86,0 Na2MoO4.2H2O 2,5 KI 8,3 CuSO4.5H2O 0,25 CoCl2.6H2O 0,25 Thành phần môi trường MS (Muashige & Skoog) Amount to Bottle Component Stock take Solution (g/l) preparation (ml) I II III IV V Final concentratic (mg/l) NH4NO3 82,5 KNO3 95 MgSO4.7H2O 37 MnSO4.4H2O 2,23 ZnSO4.7H2O 1,058 CuSO4.5H2O 0,0025 0,025 CaCl2.2H2O 44 440,0 KI 0,083 CoCl2.6H2O 0,0025 0,025 KH2PO4 17 170,0 H3BO4 0,62 Na2MoO4.2H2O 0,025 FeSO4.7H2O 2,784 Na2EDTA.2H2O 3,724 20 1.650,0 1.900,0 370,0 10 10 10 22,3 10,6 0,83 6,2 0,25 10 27,85 37,25 mg/100ml Vitamin Nicotinic acid 100 0,5 0,5 Glycine 100 2,0 2,0 Thiamine acid 100 0,1 0,1 Pyridocine HCl 100 0,5 0,5 Sucrose 30.0000,0 Agar 600,0 pH 5,6-5,8 XÁC NHẬN ĐÃ SỬA CHỮA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG Thái Nguyên, ngày tháng năm 2018 Người nhận xét phản biện Người hướng dẫn (chữ ký ghi rõ họ tên) (chữ ký ghi rõ họ tên) TS Nguyễn Văn Duy TS Nguyễn Tiến Dũng ... hành nghiên cứu chuyển gen thuốc 4.2 Kết chuyển gen AtCBF1 vào giống thuốc thông qua vi khuẩn A .tumefaciens Chuyển gen chịu l? ??nh AtCBF1 vào giống thuốc K326 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. .. dụng chuyển gen 2 Xuất phát từ l? ? trên, tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu chuyển gen chịu l? ??nh AtCBF1 thuốc (Nicotiana tobacum L) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens? ?? 1.2 Mục tiêu nghiên cứu. .. HỌC NÔNG L? ?M -  - CHU THỊ NGỌC ÁNH Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN CHỊU L? ??NH AtCBF1 TRÊN CÂY THUỐC L? ? (Nicotiana tobacum L) THƠNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens? ?? KHĨA LUẬN TỐT