Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô tế bào và bước đầu chuyển gen kháng nấm vào cây sắn nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens

Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô tế bào và bước đầu chuyển gen kháng nấm vào cây sắn nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô tế bào và bước đầu chuyển gen kháng nấm vào cây sắn nhờ vi khuẩn Agrobacterium Tumefaciens luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

Bộ giáo dục đào tạo Trường Đại học bách khoa Hµ néi LuËn văn thạc sỹ khoa học Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô tế bào bước đầu chuyển gen kháng nấm vào sắn Nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ngành: Công nghệ sinh học Quách vũ quỳnh hương Hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Thị ánh Hồng Hà Nội 2006 MụC LụC Mở Đầu Tính cấp thiết đề tài ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Mơc ®Ých cđa ®Ị tµi néi dung nghiªn cøu Ch­¬ng I: Tỉng quan I.1 Giới thiệu chung sắn I.1.1 VÞ trí, phân loại nguồn gốc I.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Thành phần hóa học giá trị dinh dưỡng sắn 1.1.4 Độc tố củ sắn 1.1.5 Sản xuất, tiêu thụ sắn Thế giới Việt Nam I.1.5.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ sắn giới I.1.5.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ sắn ViÖt Nam I.2 Mét sè BÖnh nấm gây hại sắn 1.2.1 Bệnh nấm gây hại củ sắn đồng ruộng 1.2.2 Bệnh nấm gây hại củ sau thu ho¹ch 1.2.3 BƯnh nÊm gây hại thân sắn 10 1.2.4 Bệnh nấm gây sắn 10 I.3 Phương pháp nhân giống sắn 10 1.3.1 Nh©n gièng trun thång 10 I.3.2 Nhân giống điều kiện in vitro 10 I.4 kü thuËt chuyÓn gen ë thùc vËt 12 I.4.1 Tái sinh nuôi cấy mô, tế bào thực vật - sở thành công chuyÓn gen 12 I.4.1.1 C¬ së khoa học khả tái sinh thực vật 12 I.4.1.2 Vai trò hệ thống tái sinh kỹ thuật chuyển gen 14 I.4.2 Phương pháp chun gen gi¸n tiÕp nhê vi khn Agrobacterium 15 I.4.2.1 C¬ chÕ 15 I.4.2.2 Vect¬ 17 I.4.2.3 Gen chØ thị gen chọn lọc 19 I.4.3 Giới thiệu sơ lược enzym thủy phân kháng nấm 20 I.4.4 Một số thành tựu chuyển gen 22 I.4.5 Nh÷ng yÕu tè tÝch cùc hạn chế trồng biến đổi gen 23 I.4.6 Một số nghiên cứu chuyển gen vào s¾n 24 18T 18 T 18T 8T 18T 18T 18T 18 T 18T 8T 18T 18 T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18 T 18T 18T 18T 18T 18T 18 T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T Quách Vũ Quỳnh Hương I.4.7 Kỹ thuật PCR - øng dơng kiĨm tra sù biĨu hiƯn cđa gen chun 26 Ch­¬ng II: VËt liƯu, néi dung phương pháp nghiên cứu 28 II.1 VËt liƯu Nghiªn cøu 28 II.1.1 Thùc vËt 28 II.1.2 Chủng vi khuẩn vectơ biến nạp 29 II.1.3 Ho¸ chÊt thiết bị 29 II.2 Néi dung nghiªn cøu 29 I.2.1 X©y dựng hệ thống tái sinh sắn 29 II.2.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng 2,4-D đến khả phát sinh hình thái m« nu«i cÊy 29 II.2.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả phát sinh hình thái mô nu«i cÊy 30 II.2.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến khả phát sinh hình thái mô nuôi cÊy 30 II.2.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp BAP NAA đến khả phát sinh hình thái cđa m« nu«i cÊy 30 II.2.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng vị trí lấy mẫu đến khả phát sinh hình thái mô nuôi cấy 30 II.2.1.6 Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp môi trường đến khả tạo chồi mô nuôi cấy 30 II.2.1.7 Nghiªn cøu ảnh hưởng NAA đến khả tạo hoàn chØnh 30 II.2.2 ThÝ nghiƯm vµ sau chuyển gen vào sắn 30 II.2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ vi khuẩn đến khả sống 30 II.2.2.2 Nuôi cấy tái sinh sắn chuyển gen 30 II.2.3 KiĨm tra sù cã mỈt t¹m thêi cđa gen chun 30 II.3 Phương pháp nghiên cứu 30 II.3.1 Các loại môi trường 30 II.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 31 II.3.3 Phương pháp vào mẫu 31 II.3.4 Chuẩn bị mẫu nội dung xây dựng hệ thống tái sinh sắn 31 II.3.5 ChuyÓn gen nhê vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens 31 II.3.6 Kiểm tra có mặt tạm thêi cđa gen chun 33 II.3.7 Phương pháp tách chiết DNA 33 II.3.8 Phương pháp PCR 34 Chương III: Kết thảo luận 40 Kết thảo luận 40 18T 18T 18T 18 T 18T 18 T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18 T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18 T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18 T 18 T Qu¸ch Vị Qnh Hương A Các thí nghiệm nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh cho sắn 40 III.1 ảnh hưởng 2,4-D đến khả phát sinh hình thái mô nuôi cấy 41 III.2 Nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả phát sinh hình thái mô nuôi cấy 44 III.3 Nghiªn cứu ảnh hưởng NAA đến khả phát sinh hình thái mô nuôi cấy 46 III.4 Nghiªn cứu ảnh hưởng tổ hợp BAP NAA đến khả phát sinh hình thái mô nuôi cÊy 48 III.5 Nghiªn cứu ảnh hưởng vị trí lấy mẫu đến khả phát sinh hình thái mô nuôi cấy 50 III.6 Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp môi trường đến khả tạo chồi mô nuôi cấy 52 III.7 Nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến khả tạo hoàn chỉnh 55 III.8 Những kết đà đạt giai đoạn xây dựng hoàn thiện hệ thống tái sinh cho sắn 56 B Các nghiên cứu vào sắn hoàn thiện tr×nh chun gen 59 III.9 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian lây nhiễm đến khả sống tái sinh mô sắn 59 III.10 KiÓm tra sù có mặt tạm thời gen chuyển 65 III.11 KÕt qu¶ kiĨm tra PCR Ch­¬ng IV: KÕt luận đề nghị 69 IV.1 KÕt luËn 69 IV.2 §Ị nghÞ 18T 18 T 18T 18 T 18T 18 T 18T 18 T 18T 18T 18T 18 T 18T 18T 18T 18T 18T 8T 18T 18 T 18T 18 T 18T 18T 18T 18T 18 T 18T 18T 18T 8T 18T 18T 18T 18T 18T 18T 18 T 18T 18T 18T Quách Vũ Quỳnh Hương Mở Đầu Tính cấp thiết đề tài Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) lương thực đứng hàng thứ giới có nguồn gốc nhiệt đới châu Mỹ La tinh đà trồng cách khoảng 5000 năm [26] Là lương thực hàng đầu nước có khí hậu nhiệt đới ẩm, sắn trồng 89 nước với diện tích 14,8 triệu năm 2001 [28] Đến kỷ 19, sắn trồng Việt Nam [6] lương thực đứng thứ tư sau lúa, ngô khoai lang Hiện nay, sắn nhanh chóng chuyển đổi vai trò từ lương thực truyền thống thành cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp chế biến sản xuất tinh bột, đồ uống, nước chấm, mỳ chính, cồn Sắn nguyên liệu quan trọng phục vụ chăn nuôi, sắn tươi nguồn protein quan trọng phục vụ tốt cho nghề nuôi tằm, thân sắn tận dụng làm nguyên liệu trồng nấm, mộc nhĩ Việt Nam, sắn trồng vùng sản xuất nông nghiệp Theo thống kê năm 2001, vùng có diện tích trồng sắn lớn Đông Nam (57.800 ha), vùng Đông Bắc (48.100 ha) vùng Đồng sông Cửu Long (5.500 ha) Về suất, vùng Đông Nam (16,8 tấn/ha), vùng Đồng sông Hồng (10,4 tấn/ha) thấp vùng Bắc Trung (7,1 tấn/ha)[13] Sắn trồng bị nhiều loại nấm bệnh khác gây hại, làm ảnh hưởng không nhỏ đến sinh trưởng phát triển suất, chất lượng củ Có gần 250 loại bệnh nấm sắn có khoảng 10 loại bệnh có ảnh hưởng lớn đến giá trị kinh tế sắn [5] Bệnh nấm gây hại củ sắn đồng ruộng gây hại nặng số địa phương chí có nơi không thu hoạch Điển hình loài nấm Phytophthora, nấm Rosellinia necatrik Bệnh nấm gây hại thân Quách Vũ Quỳnh Hương sắn, sắn củ sắn sau thu hoạch ảnh hưởng không nhỏ tới chất lượng hiệu kinh tế sắn Sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hạn chế phần ảnh hưởng nấm bệnh đến sắn không cho tác dụng triệt để mong muốn Chuyển gen công cụ hữu ích, bổ sung hiệu cho phương pháp chọn tạo giống truyền thống mở rộng nguồn gen có lợi sang giống khác Để chuyển gen vào thực vật phương pháp thông dụng chuyển gen nhờ Agrobacterium chuyển gen súng bắn gen [3] Chuyển gen hữu ích vào thực vật cho phép tăng cường tính trạng mong muốn mà giữ nguyên đặc tính giống, tránh khó khăn mà phương pháp chọn tạo giống truyền thống gặp phải Đối với sắn, chuyển gen cải tiến suất, tăng cường chất lượng củ, kháng sâu bệnh sản sinh hợp chất làm tăng giá trị sản phẩm Để tạo chuyển gen cách ổn định, cần xây dựng hệ thống nuôi cấy in vitro cho phép tái sinh Các gen chuyển cần có biểu trực tiếp chuyển gen di truyền cách ổn định cho hệ sau Sắn sinh sản vô tính, chuyển gen đà ổn định mặt di truyền sử dụng cho chương trình chọn tạo giống Tạo phôi vô tính phương pháp chung để tái sinh sắn giới hạn mô phân sinh mô phôi mẫu cấy mầm trụ phôi từ phôi hợp tử [70][73][50][60][44][56] Ngoài việc phát sinh chồi thông qua phát sinh quan từ tế bào mép cắt gần mép cắt mẫu thích hợp cho việc chuyển gen nhờ Agrobacterium [46][57] Xuất phát từ sở tiến hành thực đề tài: " Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô tế bào bước đầu chuyển gen kháng nấm sắn nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens" Quách Vũ Quỳnh Hương ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài - ứng dụng tiến công nghệ sinh học đại vào công tác chọn tạo giống nhằm tạo dòng sắn mang gen hữu ích mong muốn (kháng nấm) - Đề tài cung cấp thông tin, số liệu làm sở khoa học đóng góp cho việc nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyển gen kháng nấm vào sắn nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens nói riêng tài liệu tham khảo cho học tập nghiên cứu chuyển gen khác nói chung - Thành công đề tài tạo tiền đề cho việc chọn tạo dòng sắn kháng bệnh, chất lượng cao, suất tốt, hiệu kinh tế phục vụ cho nhu cầu sản xuất nông nghiệp công nghiệp Mục đích đề tài - Nghiên cứu quy trình chuyển gen kháng nấm chitinase-glucanase vào sắn nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens nhằm thu sắn có gen chuyển - Xây dựng quy trình tái sinh sắn chuyển gen in vitro nội dung nghiên cứu ã Chuyển gen kháng nấm vào sắn thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ã Xác định thành phần môi trường tối ưu cho khả tái sinh chồi cao sau chuyển gen ã Tái sinh sắn chuyển gen thành hoàn chỉnh ã Kiểm tra có mặt gen chuyển Quách Vị Qnh H­¬ng Ch­¬ng I Tỉng quan I.1 Giíi thiệu chung sắn I.1.1 Vị trí, phân loại nguồn gốc Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) thuộc giới thực vật (Phyta), ngành thực vật hạt kín (Angrospermae), lớp hai mầm (Dicotyledonece), thầu dầu (Euphorbiales), họ thầu dầu (Euphorbiacae), chi Manihot [19] Sắn có nguồn gốc từ Đông bắc Braxin có tài liệu đà chứng minh chúng có xuất xứ từ Bolivia Mehico [34] Thế kỷ 17, sắn du nhập vào châu Đến kỷ 19, sắn đưa vào miền nam Việt Nam [7] trở thành lương thực quan träng thø t­ cđa ViƯt nam Tíi c©y sắn đà phân bố diện rộng, chủ yếu nước tập trung khoảng từ 30 vĩ Bắc đến 30 vĩ Nam Có nhiều giống sắn khác Dựa vào màu sắc cây, vỏ củ hàm lượng glucozit độc chia sắn làm loại chính: ã Sắn đắng (sắn vỏ trắng): có hàm lượng glucozit độc cao loại sắn Hàm lượng HCN trung bình củ 15-30 mg/100g [1] Có vỏ gỗ màu nâu nhạt, vỏ thịt trắng, cuống tím, thân thấp, đốt ngắn, không ăn tươi ã Sắn (sắn vỏ đỏ): có hàm lượng glucozit độc thấp, hàm lượng HCN chung củ khoảng - 5mg/100g [1] Thân có màu xanh nhạt, đốt dài, màu xanh thẫm, vỏ củ có màu nâu xẫm ã Sắn nghệ (sắn vỏ vàng): có hàm lượng glucozit độc cao sắn vỏ đỏ Trung bình củ có 10mg/100g HCN [1] Thân màu vàng nhạt xanh, vỏ củ màu vàng ngà, thịt sắn vàng, suất thấp nên trồng Quách Vũ Quỳnh Hương Hình 1.1 Cây sắn, hoa, hạt sắn I.1.2 Đặc điểm sinh học Sắn tiểu mộc, cao khoảng - 4m, có phân nhánh không phân nhánh tuỳ giống, khía thành nhiều thùy, rễ ngang phát triển thành củ, tÝch lòy tinh bét Thêi gian sinh tr­ëng tõ - 12 tháng, có nơi lên tới 18 tháng Sắn thường trồng chủ yếu vùng nhiệt đới [7] Vụ sắn thường bắt đầu vào cuối mùa khô Thời gian sinh tr­ëng tõ 10 - 12 th¸ng ë miỊn Bắc - tháng miền Nam Cây sắn chịu đất chua nên trồng vùng đồi đất xấu miền Bắc hay vùng đất phèn châu thổ sông Cửu Long Đất cát ven biển, đất phù sa cũ trồng sắn Vùng núi cao không trồng sắn sắn không chịu rét I.1.3 Thành phần hóa học giá trị dinh dưỡng sắn Thành phần chất cấu tạo phận sắn khác (xem bảng - phụ lục 1) Củ sắn giàu tinh bột, nhiều nhiệt lượng axit ascorbic nh­ng cã nhiỊu gluxit khã tiªu, nghÌo protit, lipit, Ýt muối khoáng vitamin Lá sắn có nhiều canxi, protit, vitamin A, B1, B2 vµ mét sè axit amin không thay lizin, triptophan cao phận khác thay đổi tùy thuộc vào tuổi Có thể dùng củ sắn để ăn Thành phần hoá học sắn vàng sắn trắng khác (xem bảng - phụ lục 1) Sắn dùng thay ngũ cốc làm thức ăn giàu lượng cho gia súc, gia cầm Củ sắn sử dụng rộng rÃi nhiều nước, thân dùng Quách Vũ Quỳnh Hương Một số nơi dùng thân sắn kết hợp cỏ khô để sử dụng hàm lượng protit chất xơ Củ sắn thường sử dụng dạng sắn lát khô, sắn viên bột, chế biến thức ăn tổng hợp Cũng sử dụng sắn tươi nhờ khả dễ tiêu tinh bột sắn cần ý đầy đủ đến tác động HCN Giá trị dinh dưỡng sắn loại gia súc, gia cầm phân tích châu Phi cho kÕt qu¶ ë b¶ng - phơ lơc I.1.4 Độc tố củ sắn Bất kỳ loại sắn có độc tố acid cyanic (HCN) HCN phát có sắn từ năm 1904 Tùy loại sắn mà hàm lượng chất độc thay đổi phân bố không quan (bảng phụ lục 1) Theo kết nghiên cứu Nastey (1973), chất glucoside cyanogenic sắn có thành phần chủ yếu linamarin (93%) lotaustralin (7%) Những chất chuyển thành HCN có diện linamatase (một loại enzym sắn) I.1.5 Sản xuất, tiêu thụ sắn Thế giới Việt Nam I.1.5.1 Tình hình sản xuất tiêu thụ sắn thÕ giíi Theo sè liƯu thèng kª cđa FAO (1968) có tới 88 nước giới trồng sắn với suất bình quân năm 1968 8,7 tấn/ha, sản lượng 85 triệu [2] Đến năm 2004, toàn giới có 89 nước trồng sắn đạt diện tích 18,51 triệu ha, suất bình quân 10,94 tấn/ha, sản lượng 202,64 triệu [29] Diện tích, suất sản lượng sắn giới có chiều hướng gia tăng 10 năm qua 1994-2004 (bảng - phụ lục 1) có 22 nước đạt sản lượng sắn hàng năm triệu Châu Phi chiếm 53% sản lượng sắn giới, châu 29%, châu Mỹ La tinh vùng Caribê 17% (bảng phụ lục 1) Quách Vũ Quỳnh Hương 65 III.10 Kiểm tra có mặt tạm thời gen chuyển Sau tiến hành chuyển gen vào sắn , tiến hành theo dõi khả tái sinh mẫu cấy chuyển gen môi trường chọn lọc có kháng sinh tương ứng Đối với sắn chuyển gen chitinase-glucanase kháng nấm kháng sinh chọn lọc hygromycin Những mẫu sắn biến nạp biểu tính trạng: kháng nấm hai kháng hygromycin Sau tuần nuôi cấy môi trường chọn lọc, quan sát thấy phần lớn mô phôi bị đen chết đi, số mô phô sống sót khoảng 30% bật chồi chiÕm tû lƯ rÊt thÊp xÊp xØ 2% CÊy chun mô sống sót có khả phát sinh phôi môi trường chọn lọc sang môi trường tạo phôi tái sinh chồi MS + 0,1mg/l BAP + 0,01mg/l αNAA250 mg/l cefotaxime + 50 mg/l hygromycin Sau 10 ngµy, đà thấy tính kháng với hygromycine bắt đầu biểu Những mô cấy biến nạp màu xanh phát triển bình thường chồi phát triển thành bình thường bước đầu kết luận đà mang gen kháng hygromycin Ngược lại, mô cấy màu xanh diệp lục, khả phát triển bị đình trệ, tế bào bề mặt tiếp xúc với môi trường đà có xu hướng đổi màu, thấy lốm đốm có màu đen Hiện tượng biểu tế bào mô chưa mang gen ngoại lai hpt Do môi trường nuôi cấy có chứa hygromycin, kháng sinh đà ức chế trình sinh tổng hợp protein làm khả xanh hóa mẫu Những kết thu cho thấy kháng sinh sử dụng trình chuyển gen đà ức chế trình sinh trưởng phát triển làm giảm khả phát sinh quan tế bào mô Ngoài ra, gây nên biến di soma làm giảm đến 50% tốc độ phát triển 40% sức sống [60][46] Những mô phát triển tốt môi trường chứa hygromycin sau 2-3 tuần nuôi cấy, từ mép đà bắt đầu tạo phôi Sau 2-3 lần cấy chuyển, Quách Vũ Quỳnh Hương 66 sống sót phát triển môi trường kháng sinh thống kê để đánh giá tỷ lệ biến nạp Bảng 3.10 Kết chọn lọc biến nạp môi trường chứa kháng sinh hygromycine 50mg/l Tªn gièng Sè mÉu thÝ nghiƯm Sè chồi tái sinh Hiệu biến nạp (%) KM60 295 1,36 KM94 300 1,67 KM140 455 1,54 Tỉng 1050 16 1,52 KÕt qu¶ b¶ng 3.10 cho thÊy khả phát sinh chồi sắn phụ thuộc vào kiểu gen giống Dòng sắn DS2 cho tỷ lệ biến nạp cao trung bình đạt 1,67% Các chồi đà phát triển cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung 0,01 mg/l NAA để tạo hoàn chỉnh Chúng thu 14 hoàn chỉnh, nhiên trình cấy chuyển thu 11 khoẻ mạnh Những kết khả phát sinh chồi trình bày bảng 3.11 Bảng 3.11 Khả phát sinh chồi giống sắn trước sau chuyển gen Tên giống Tỷ lệ t¹o chåi tr­íc Tû lƯ t¹o chåi sau chun gen (%) chuyÓn gen (%) KM60 38,8 1,36 KH94 45,1 1,67 KM140 42,0 1,54 Quách Vũ Quỳnh Hương 67 Từ số liệu bảng 3.11 cho thấy khả tái sinh tất giống sắn giảm đáng kể sau đồng nuôi cấy chọn lọc Chỉ có 1,36% mẫu giống KM60 tạo chồi môi trường chọn lọc có chứa kháng sinh so với 38,8% tái sinh môi trường kháng sinh Đối với giống KM 94 khả tái sinh sau chuyển gen 1,67% so với 45,1% tái sinh điều kiện kháng sinh Còn lại giống KM140, tỷ lệ tái sinh mẫu môi trường chọn lọc 1,54 so với 42% tái sinh môi trường kháng sinh Các kết thu cho thấy kháng sinh dùng chuyển gen có ảnh hưởng làm ức chế trình sinh trưởng phát triển phát sinh quan mô tế bào Ngoài chúng gây biến dị soma, làm giảm đến 50% tốc độ phát triển 40% sức sống mô [46] 3.11 Kết kiểm tra PCR PCR kỹ thuật nhiều phòng thí nghiệm áp dụng nghiên cứu tồng hợp trình tự DNA đà đưa vào thể nhận với cặp mồi đặc trưng Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu khuyếch đại đoạn gen chitinase là: CHIf : 5'-GGGATCCACCATGGGGAAGAATAGGATGATG-3' CHIr: 5'-GATAATCATCGAAGACCGGCAACAGGATTC-3' Kết trình bày hình 3.17 Quách Vũ Quỳnh Hương 68 Hình 3.17 Kết kiểm tra có mặt gen chitinase sắn đà chuyển gen kháng nấm kỹ thuật PCR Kết điện di cho thấy 11 dòng sắn đà chuyển gen có DS2 DS5 biểu có mặt gen chitinase khuyếch đại tương ứng 1620 bp Hai dòng sắn hai dòng sắn thuộc giống KM94 Quách Vũ Quỳnh Hương 69 Chương IV Kết luận đề nghị IV.1 Kết luận Đà xây dựng hệ thống tái sinh mô sắn làm së cho kü tht chun gen  Bỉ sung chÊt điều tiết sinh trưởng riêng rẽ tổ hợp vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt đến khả phát sinh hình thái mẫu cấy Bổ sung riêng rẽ chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhãm auxin (αNAA nång ®é tõ 0,01 - 0,05mg/l , 2,4-D cã nång ®é tõ - 8mg/lÝt) hay cytokinin (BAP cã nång ®é tõ 0,05 - 4,0mg/l) cã chØ có tác dụng kích thích khả tái sinh theo hướng tạo callus (trên 80% mẫu cấy tạo callus chưa kích thích tái sinh tạo chồi) Tỷ lệ tạo callus đạt cao công rhức bổ sung 6mg/l 2,4-D với chất lượng callus đồng đều, ổn định phát triển tốt Với nồng độ NAA từ 0,01 - 0,05mg/l bổ sung đơn lẻ vào môi trường nuôi cấy, khả tạo rễ lớn ®Õn trªn 80%  Bỉ sung αNAA (nång ®é tõ 0,01 - 0,04mg/l) tỉ hỵp víi BAP (0,1mg/l) sau giai đoạn tạo phôi sơ cấp đà làm tăng khả tái sinh tạo chồi mẫu cấy Tỷ lệ mẫu cấy tạo chồi đạt cao 13,3% c«ng thøc bỉ sung 0,1mg/l BAP + 0,01mg/l αNAA  Tổ hợp môi trường cho tỷ lệ tái sinh tạo chồi cao MS + 6mg/l 2,4D nuôi cấy tuần điều kiện không chiếu sáng hoàn toàn MS + 0,1mg/l BAP + 0,01mg/l NAA Quách Vũ Quỳnh Hương 70 Mẫu cấy nằm đoạn thân có vị trí gần cho tỷ lệ sống khả tái sinh chồi cao với mẫu cấy mảnh (tỷ lệ sống đạt 90%, tỷ lệ mẫu tái sinh tạo chồi đạt cao 13,3%) Mẫu cấy đoạn thân nằm phần cho tỷ lệ sống 92,2% tạo chồi đạt 4,45 Mẫu cấy mảnh cho khả tái sinh chồi cao Mẫu cấy mảnh nuôi cấy môi trường MS (1 tuần) sau chuyển sang m«i tr­êng MS + 0,1mg/l BAP + 0,01mg/l αNAA cho tỷ lệ tạo chồi đạt cao đạt 42,2% với số chồi tái sinh trung bình mẫu cấy đạt 3,97 Môi trường tạo sắn hoàn chỉnh cho kết sinh trưởng tốt môi tr­êng MS cã bæ sung 0,01mg/l αNAA  Thêi gian lây nhiễm yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ khả biến nạp tỷ lệ tái sinh chuyển gen Thời gian lây nhiễm tốt khoảng từ 15-20 phút Sau chuyển gen chitinase-glucanase tái sinh chuyển gen, đà thu 16 sắn hoàn chỉnh có 11 khoẻ mạnh Tỷ lệ biến nạp đạt trung bình 1,52% Sử dụng phương pháp PCR ®Ĩ kiĨm tra sù cã mỈt cđa gen chun víi cặp mồi đặc hiệu khuyếch đại gen chitinase-glucanase, kết điện di 11 dòng sắn đà chuyển gen thu dòng sắn DS2 DS5 giống KM94 biểu có mặt gen chitinase khuyếch đại tương ứng 1620bp Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu thêm nhằm hoàn thiện quy trình chuyển gen kháng nấm vào sắn Quách Vũ Quỳnh Hương Phụ lục Bảng Thành phần chất cấu tạo phận sắn Các chất cấu tạo Rễ tổng số Vỏ củ Thân Cành Lá Chất khô (% chất tươi) 36 30 40 30 15 Gluxit (% chât khô) 89 75 91 46 41 Lipit (% chât khô) 0,5 Protit (% chât khô) 2,5 10 25 Xelulo (% chât kh«) 4,5 12 23 20 2,5 10 Canxi (% chât khô) 0,1 0,2 0,1 0,3 14 Photpho (% chât khô) 0,1 0,1 0,1 0,3 0,5 Sắt (% chât khô) 0,003 0,002 0,001 - 0,03 Natri (% chât khô) 0,006 - - - 0,02 Kali (% chât khô) - - - Vitamin A (mg/100g chÊt kh«) - - - - 30 Vitamin B1 (mg/100g chÊt kh«) 0,1 - - - Vitamin B2 (mg/100g chÊt kh«) 0,1 - - - Axit ascorbic (mg/100g chÊt kh«) 80 - - - 500 Tro (% chât khô) Nguồn: Đường Hồng Dật (2004) Bảng Thành phần hoá học củ sắn Thành phần hóa học Củ sắn vàng Củ sắn trắng Nước (%) 63,18 61,90 Tinh bột (%) 34,20 32,90 Đạm tæng sè (%) 0,61 0,43 ChÊt bÐo (lipit) (%) 0,20 0,24 ChÊt kho¸ng (%) 0,05 0,83 Vitamin B1 31 gamma 58 gamma Vitamin B2 75 gamma 75 gamma Nguån: §­êng Hồng Dật (2004) Bảng Giá trị dinh dưỡng sắn gia súc, gia cầm Các tiêu dinh d­ìng A B C D E 8,78 §é Èm (%) 67,25 64,30 11,05 12,55 ChÊt kh« (%) 32,75 35,70 89,95 87,45 91,22 Protit dƠ tiªu (%) 1,37 1,02 2,05 2,88 2,73 Xenlulo (%) 0,8 0,9 2,82 4,00 3,40 ChÊt bÐo (lipit) (%) 0,14 0,28 0,65 0,84 0,86 ChÊt kho¸ng (%) 0,69 0,97 2,89 2,66 3,45 Canxi (%) 0,071 0,034 0,112 0,110 0,120 Photpho (%) 0,046 0,079 0,104 0,091 0,140 Chất chiết N, dễ tiêu 29,75 32,53 80,54 77,07 80,36 Protit dễ tiêu bò (%) 0 0 Protit dễ tiêu lợn (%) - - 1,39 1,96 1,85 Protit dễ tiêu đối víi gia cÇm (%) - - - 2,16 - Tỉng chất dinh dưỡng dễ tiêu bò (%) Tổng chất dinh dưỡng dễ tiêu lợn (%) 17,81 19,55 74,8 71,52 74,57 - - 83,6 81,73 84,44 Đơn vị thức ăn bò (kg) 0,17 0,19 0,98 0,92 0,96 Đơn vị thức ăn lợn (kg) - - 1,14 1,11 1,12 Năng lượng chuyển hoá đối víi lỵn (KCal/kg) - - 3,428 3,351 3,460 N.l­ỵng chun hoá gia cầm (KCal/kg) - - - 3,071 Ngn: §­êng Hång DËt (2004) [ ] Ghi chó: A Sắn tươi có HCN với hàm lượng 1710ppm/kg chất khô B Sắn tươi có HCN với hàm lượng 287ppm/kg chất khô C Sắn lát khô 18 tháng, hàm lượng HCN 33,7ppp/kg chất khô D Bột sắn E Lát sắn khô 30 tháng - Bảng 4: Hàm lượng HCN phận củ sắn tươi P P Hàm lượng HCN (mg/ 100g) Loại sắn Vỏ Vỏ Sắn đắng (Hoà bình) - 14,04 6,48 Sắn đắng (Vĩnh phú) 7,6 21,16 - Sắn Hai đầu nguyên củ cuống Thịt sắn Lõi sắn 7,55 - 12,6 16,20 9,72 15,8 Nguồn: Hoài Vũ, 1980 [14] Bảng Diện tích, suất, sản lượng sắn giới giai đoạn 1994-2004 0B Năm Diện tích (triệu ha) Năng suất (tạ/ha) Sản l­ỵng (triƯu tÊn) 1994 16,78 9,80 164,59 1995 16,43 9,84 161,79 1996 16,25 9,75 158,51 1997 16,05 10,06 161,60 1998 16,56 9,90 164,10 1999 16,56 10,31 170,92 2000 16,86 10,70 177,89 2001 17,17 10,73 184,36 2002 17,31 10,61 183,82 2003 17,59 10,79 189,99 2004 18,51 10,94 202,64 1B 2B 3B 4B 5B 6B 7B 8B 9B 10B 11B Nguån: FAOSTAT (2005) [ ] Bảng 6: Tình hình sản suất sắn cđa mét sè n­íc trªn thÕ giíi 19B Vïng trång Diện tích (nghìn ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lượng (triệu tÊn) ThÕ giíi 18.511 10,94 202,64 Ch©u Phi 12.252 8,82 108,10 Nigeria 4.118 9,27 38,17 Congo 1.850 8,08 14,95 Ghana 783 12,42 9,73 Tanzania 660 10,43 6,89 1.050 5,85 6,15 Angola 640 8,75 5,60 Uganda 407 13,51 5,50 Benin 300 13,33 4,00 Malawi 150 17,06 2,55 Madagascar 352 6,21 2,19 Cameroon 145 13,44 1,95 Cote d’Ivoire 300 5,00 1,50 Guinea 270 5,00 1,35 Châu 3.515 16,76 58,92 Thái lan 1.050 19,42 20,40 Indonesia 1.267 15,19 19,26 Ên ®é 240 27,91 6,70 ViÖt Nam 370 14,50 5,37 Trung quèc 250 16,79 4,20 Philippin 205 7,99 1,64 Ch©u Mü La tinh 2.728 12,99 35,44 Brazil 1.773 13,55 24,03 Paraguay 306 17,97 5,50 Colombia 191 11,56 2,21 12B 13B Mozambique 14B 15B Nguồn: FAOSTAT 2005 [ ] Bảng Tình hình xuất, nhập sắn (sắn lát, sắn viên, tinh bột) số nước giới giai đoạn 1983-2002 Đơn vị tính: triệu 17B Thị trường Trung bình Trung bình Trung bình 1999 83-85 92-93 95-96 Xuất Thái Lan Indonesia Tr Quốc + Đài Loan Các nước khác Việt Nam Nhập Cộng đồng Châu âu Tr Quốc + Đài Loan Nhật Bản Hàn Quốc Các nước khác Malaysia Indonesia Mü 18B 7,0 6,4 0,4 0,1 0,1 6,6 5,5 0,3 0,3 0,2 0,3 9,8 8,3 1,1 0,3 0,1 9,7 6,5 0,9 0,5 0,7 1,1 5,9 4,6 0,6 0,4 0,3 0,1 5,9 3,5 0,7 0,4 0,3 1,0 7,0 6,4 0,3 0,2 0,2 7,0 4,3 1,1 0,5 0.1 0,9 2000 2001 2002 6,9 6,5 0,2 0,2 0,2 6,9 3,7 0,9 0,6 0,1 1,6 0,2 0,5 0,1 7,4 7,1 0,1 0,1 0,2 7,4 2,7 2,6 0,7 0,2 1,2 0,2 0,2 0,1 5,9 5,7 0,1 0,1 0,3 5,9 1,5 2,5 0,7 0,1 1,3 0,2 0,1 0,1 Nguån : FAO (2003) [ ] Bảng Tình hình xuất sắn nước giới năm 2003-2004 Đơn vị tính: 1000 Nước xuất Thái Lan Việt Nam Indonesia Cộng đồng Châu âu Trung Quốc + Đài Loan Mỹ ấn Độ Philippin Nhật Bản Tổng số Nguồn: FAOSTAT 2005 [ ] Sắn củ Sản phẩm sắn khô tươi Lát phơi Tinh bột Bột nghiền Sán viên Tổng 11262 821 325 603 74 17 13473 3776 328 100 235 14 4457 2904 328 70 229 20 3531 767 20 799 82 83 23 10 10 44 Bảng Dự báo tình hình sản xuất tiêu thụ sắn toàn giới đến năm 2020 tốc độ tiêu thụ sản phẩm sắn hàng năm giai đoạn 1993-2020 21B Vùng Sx sắn Tiêu thụ sắn 2020 Tốc độ tăng trưởng giai 2020 (triệu tấn) đoạn 1993-2020 (%) (triệu Lương thực Thức ăn Tổng Lương thực Thức ăn Tổng thực phẩm gia súc cộng thực phÈm gia sóc céng tÊn) 275,1 176,3 53,4 275,1 1,98 0,95 1,74 0,4 0,4 19,4 20,5 - 0,50 0,01 -0,50 Các nước phát triển 274,7 175,9 33,9 254,6 1,99 1,62 1,93 Ch©u Phi 168,6 130,2 7,5 168,1 2,49 1,53 2,44 Ch©u Mü 41,7 13,9 21,9 42,9 0,70 1,75 1,30 + Đông Nam 48,2 19,5 0,9 24,4 0,97 0,89 0,96 + Trung Quèc 6,5 2,8 3,0 6,4 0,17 1,61 0,84 + Ên §é 7,0 6,9 - 7,3 0,93 - 0,93 Toàn giới Các nước phát triển Châu Ngn: http://www.agroviet.gov.vn [ ] 20TU U20T B¶ng 10 DiƯn tÝch, suất, sản lượng sắn số tỉnh Việt nam (năm 2001) TT 10 11 12 16B Tên địa phương Cả nước Lào Cai Yên Bái Phú Thọ Sơn La Thanh Hoá Nghệ An Quảng Nam Bình Định Kon Tum Gia Lai Tây Ninh Đồng Nai Diện tích trồng (ngh×n ha) 263,9 6,3 8,5 8,5 16,2 11,9 10,2 11,5 10,2 15,6 16,2 24,4 15,8 Ngn Tỉng cơc thèng kª, 2001[ ] Năng suất (tạ/ha) 106,4 104,3 89,6 108,8 88,1 78,2 61,9 94,7 105,0 99,9 88,9 196,4 180,1 Sản lượng (ngh×n tÊn) 2806,2 65,7 76,2 92,5 142,8 93,1 63,1 108,9 107,1 155,8 144,0 479,1 284,5 Bảng 11 Số nhà máy chế biến tinh bột sắn Việt Nam năm 2004 Vùng 20B Số tỉnh Số nhà Công suất chế biến máy (tấn bột/ngày) Sản lượng (1000 củ/năm) Đông Nam 26 79,80 56,7 Đồng sông Cửu Long 1 60,00 24,0 Tây Nguyên 62,00 67,2 Nam trung Bé 61,40 54,7 B¾c trung Bé 64,30 43,8 MiỊn nói phÝa B¾c 62,80 62,0 53 65,05 51,4 Tỉng sè 24/61 (Ngn: TrÇn Công Khanh, Hoàng Kim, Võ Văn Tuấn, Nguyễn Hữu Hỷ, Phạm văn Biên, Howeler 2005) Bng 12 Din tớch cõy trồng chuyển gen giới từ 1996 đến 2005 29T Đơn vị tính: triệu Loại Đậu tương 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 0.5 5.1 14.5 21.6 25.8 33.3 36.5 41.4 48.4 54.4 Ngô 0.3 3.2 8.3 11.1 10.3 9.8 12.4 15.5 19.3 21.2 Bông 0.8 1.4 2.5 3.7 5.3 6.8 6.8 7.2 9.0 9.8 Cải dầu 0.1 1.2 2.4 3.4 2.8 2.7 3.0 3.6 4.3 4.6 Bí 0.0