Nghiên cứu chuyển gen liên quan đến tích lũy asen vào cây thuốc lá

4 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN 1 MỤC LỤC 4 DANH MỤC BẢNG 10 DANH MỤC HÌNH 11 MỞ ĐẦU 12 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 15 1.1. Tình hình nghiên cứu ô nhiễm kim loại nặng ở trong và ngoài nƣớc. 15 1.2. Tình hình ô nhiễm Asen. 18 1.2.1. Sơ lược về Asen. 18 1.2.2. Tình hình ô nhiễm Asen ở Việt Nam. 19 1.2.3. Ảnh hưởng của Asen đến sức khỏe của con người. 19 1.2.4. Xử lý ô nhiễm Asen trong đất. 20 1.2.4.1. Phương pháp xử lý truyền thống. 20 1.2.4.2. Phương pháp sinh học. 20 1.3. Cơ sở khoa học của chuyển gen ở thực vật. 22 1.3.1. Khái niệm chuyển gen 22 1.3.2. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật. 22 1.3.2.1. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp 22 1.3.2.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp 22 1.3.2.3. Các hệ thống vector chuyển gen thực vật. 25 1.3.2.4. Giới thiệu về vector pCAMBIA1301. 28 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 5 2.1. Vật liệu nghiên cứu 31 2.1.1. Chủng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm 31 2.1.2. Vật liệu sinh học phân tử 31 2.1.3. Vật liệu thực vật 31 2.1.4. Hóa chất 32 2.1.5. Môi trường nuôi cấy 32 2.1.6. Máy móc và thiết bị 32 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 33 2.2.1. Thiết kế vector pCambia1301 mang gen arsC. 33 2.2.1.1. Nuôi cấy và lưu giữ chủng 33 2.2.1.2. Tách chiết plasmid tái tổ hợp từ tế bào vi khuẩn E.coli DH5α. 33 2.2.1.3. Phương pháp nhân gen đích bằng kỹ thuật PCR 34 3.2.1.4. Phương pháp điện di trên gel agarose 35 2.2.1.5. Phương pháp tinh sạch từ bản gel agarose bằng bộ kit của hãng Fermentas (Mỹ). 36 2.2.1.6. Phương pháp xử lý với enzyme giới hạn 37 2.2.1.7. Phản ứng ghép nối gen arsC với vector pCAMBIA1301. 37 2.2.2. Biến nạp sản phẩm ghép nối gen vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. 38 2.2.2.1. Kiểm tra chủng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp bằng PCR 39 2.2.2.2. Kiểm tra chủng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp bằng cắt enzyme giới hạn 39 2.2.3. Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens bằng xung điện 40 6 2.2.4. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua A. tumefaciens 40 2.2.4.1. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens 40 2.2.4.2. Biến nạp 41 2.2.4.3. Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy 41 2.2.4.4. Sàng lọc chồi thuốc lá chuyển gen trên môi trường có kháng sinh chọn lọc. 41 2.2.4.5. Tái sinh cây hoàn chỉnh 41 2.2.4.6. Ra cây trên môi trường đất : trấu : cát 42 2.2.5. Phương pháp phân tích cây chuyển gen 42 2.2.5.1. Phương pháp kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR. 42 2.2.5.2. Lai Southern blot. 42 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ 47 3.1. Thiết kế vector chuyển nạp mang gen arsC 47 3.1.1. Sơ đồ vector pCAMBIA1301-arsC dự định thiết kế 47 3.1.2. Gắn gen arsC vào vector biểu hiện pCAMBIA 1301 47 3.1.3. Biến nạp pCAMBIA1301-arsC vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. 49 3.1.4 Kết quả kiểm tra vector pCAMBIA1301 – arsC 50 3.1.4.1. Kết quả kiểm tra vector pCAMBIA1301-arsC bằng phản ứng PCR – colony. 50 3.1.4.2. Kết quả kiểm tra vector pCAMBIA1301-arsC bằng enzyme giới hạn NcoI và Eco72I 51 3.2. Biến nạp vector pCAMBIA1301 – arsC vào vi khuẩn A. tumefaciens. 53 3.3. Tạo cây thuốc lá chuyển gen arsC. 54 7 3.4. Kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen đƣợc trồng ngoài tự nhiên 64 3.4.1. Kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR 64 3.4.2. Kết quả kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen bằng Southern Blot. 65 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 Kết luận 68 Kiến nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ LỤC 8 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A.tumefaciens As BAP Bp CaMV35S Cefo DNA dNTPs EDTA Gus Kan Kb KLN LB MS NAA OD PCR RNA SDS SSC Agrobacterium tumefaciens Asen Benzylaminopurine Base pair Cauliflower Mosaic Virus 35S Cefotaxime Deoxyribonucleic Acid Deoxy Nucleoside Triphosphate Ethylene Diamine tetra- acetate Acid -glucuronidase Kanamycin Kilo base     Naphthalene Acetic Acid  Polymerase Chain Reaction Ribonucleic Acid Sodium dodecyl sulfate Saline sodium sitrate 9 TAE Taq T-DNA Ti-plasmid UV Vir  Axit acetic  EDTA Thermus aquaticus Transferred-DNA  Ultraviolet (light)  10 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. arsC 31 Bảng 2.2. -arsC NcoEco72I 37 Bảng 2.3. NcoEco72I 37 Bảng 2.4. arsC  38 Bảng 3.1.                61 11 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1.  18 Hình 1.2.  29 Hình 3.1. -arsC 47 Hình 3.2arsC NcoEco72I 48 Hình 3.3. arsC sau khi NcoEco72I 49 Hình 3.4.  E. Coli       Kanamycin 50mg/l. 50 Hình 3.5. - colony 51 Hình 3.6. - arsC  NcoEco72I. 52 Hình 3.7.       -arsC    A. tumefaciens 53 Hình 3.8. -A. tumefaciens C58 -arsC. 54 Hình 3.9.  56 Hình 3.10.   57 Hình 3.11 59 Hình 3.12.  63 Hình 3.13.  64 Hình 3.14. n gen 65 Hình 3.15.  66 12 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề                Ita Cd -1 mg.kg -1 [25], [27].            KLN   LN     13                         KLN .            (Eleusine indica    (Vetiveria zizanioides (Pteris vittata L)Brassica juncea), Polygonum hydropiper[2], [3], [59].   KLN   KLN  KLN                       KLN      arsC                       [...]... việc sử dụng những cây đã có sẵn khả năng tích lũy KLN, chúng tôi đã nghiên cứu quy trình chuyển gen để tạo ra cây mang gen tích lũy KLN cho những cây không có khả năng tích lũy KLN Cụ thể ở đây chúng tôi nghiên cứu tạo cây thuốc lá mang gen arsC để tích lũy Asen 1.3 Cơ sở khoa học của chuyển gen ở thực vật 1.3.1 Khái niệm chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết... có nghiên cứu nào về tách dòng và chuyển gen hấp thụ Asen từ thực vật sống tại vùng ô nhiễm, đây là điểm mới của đề tài Để đạt được mục tiêu đề ra ở trên, chúng tôi thực hiện đề tài Nghiên cứu chuyển gen liên quan đến tích lũy Asen vào cây thuốc lá Đây là một hướng nghiên cứu có ý nghĩa khoa học và thực tiễn lớn với mục đích cải tạo môi trường bằng thực vật 2 Mục tiêu nghiên cứu Tạo cây thuốc lá chuyển. .. cây thuốc lá chuyển gen mang gen arsC có khả năng tích lũy asen Bước đầu kiểm tra và đánh giá các dòng cây thuốc lá mang gen arsC 3 Nội dung nghiên cứu - Biến nạp plasmid tái tổ hợp pCAMBIA1301-arsC vàovi khuẩnA tumefaciensC58 - Bước đầu tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen arsC - Đánh giá, kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen 14 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu ô nhiễm kim loại... gen trực tiếp - Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung điện - Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm - Phương pháp chuyển gen trực tiếp qua ống phấn - Chuyển gen nhờ súng bắn gen - Chuyển gen nhờ silicon carbide 1.3.2.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp - Chuyển gen nhờ virus - Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 22 Chuyển gen nhờ Agrobacterium được nghiên cứu từ những năm 1960 – 1970 Việc... của thực vật Chưa có nhiều các nghiên cứu ở mức độ phân tử, đặc biệt là các gen liên quan đến hấp thụ và tích lũy KLN So với những nghiên cứu tại các nước tiên tiến, ở Việt Nam chưa có nhiều công trình nào sử dụng công nghệ gen để tạo thực vật có khả năng hấp thụ và tích lũy KLN Hầu hết các nghiên cứu tập trung đánh giá và sử dụng các loài cây sẵn có khả năng tích lũy KLN trong tự nhiên cho mục đích.. .chuyển gen được thực hiện trên cây thuốc lá là đối tượng dễ thao tác, các môi trường tạo mô sẹo và tái sinh cây đã được tối ưu hóa, cây phát triển nhanh thuận tiện cho nghiên cứu Nếu thành công, cây thuốc lá có thể là đối tượng dùng để xử lý vùng nhiễm KLN Hoặc có thể ứng dụng quy trình này để tạo các loại cây chuyển gen phù hợp, có khả năng tích lũy loại KLN với từng vùng... nặng ở trong và ngoài nƣớc Nước ngoài Việc nghiên cứu cơ chế chịu KLN ở thực vật bao gồm các quá trình hấp thụ, tích lũy và vận chuyển đã đạt nhiều tiến bộ trên thế giới Đã có nhiều nghiên cứu về gen liên quan đến hấp thụ và vận chuyển KLN như các gen ZIP 1, ZIP 2, IRT1 (ion-regulated transporter), AtNramp, AtNramp 3 (metal transpoter gene family), liên quan đến cácphytochelatin (PC) – CAD1, GmPCS1 (phytochelatin... PvACR2 đã tách được từ cây dương xỉ Pteris vittata, đây là cây có khả năng siêu tích lũy [41] Mới đây, một nghiên cứu của chương trình Sinh học tế bào và Phân tử thực vật tại đại học Florida, Gainesville-Mỹ khi chuyển gen PvGRX5 của cây dương xỉ Trung quốc Pteris vittata siêu tích lũy As trong lá vào hai dòng Arabidopsis Tuy nhiên so sánh cho thấy các dòng Arabidopsis chuyển gen có khả năng chống chịu... synthase) [47]và metallotionein (MT) – MT1, MT2 các gen này được thông báo có liên quan đến tích lũy KLN và khá phổ biến ở thực vật Các gen CAX 1 và CAX 2 (Cation exchanger) ở Arabidopsis cũng đã được nghiên cứu và được xác định tham gia vào vận chuyển KLN [49] Hiện nay, tại Hàn quốc đã chuyển được nhiều gen có khả năng hấp thụ KLN tập trung vào một dòng cây Dương (Poplar) có khả năng sinh trưởng nhanh,... đồng ruộng [66] Đối với As, gen arsC mã hóa cho enzyme arsenate reductase tham gia vào chuyển hóa As ở dạng arsenate thành arsenit đã được tách từ dòngArabidopsis đột biến Việc chuyển gen arsC với gen khởi động rubisco từ đậu tương (SRS1p) và gen γ-ECSvới gen khởi động actin của nấm men (ACT2p) vào Arabidopsis đã tạo được cây chuyển gen kháng As hơn cây đối chứng [39] Một gen cho arsenate reductase . arsC vào vi khuẩn A. tumefaciens. 53 3.3. Tạo cây thuốc lá chuyển gen arsC. 54 7 3.4. Kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen đƣợc trồng ngoài tự nhiên 64 3.4.1. Kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen.      Nghiên cứu chuyển gen liên quan đến tích lũy Asen vào cây thuốc lá .   . chuyển gen 22 1.3.2. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật. 22 1.3.2.1. Các phương pháp chuyển gen trực tiếp 22 1.3.2.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp 22 1.3.2.3. Các hệ thống vector chuyển