Để chứng minh gen arsC được chuyển vào genome của cây thuốc lá, chúng tôi sử dụng phương pháp lai Southern Blot. Kết quả của lai Southern Blot sẽ cho ta
66
biết thông tin về số lượng bản sao gen, tức là số lượng gen arsC được gắn vào genome của cây thuốc lá.
Sau khi đánh giá cây chuyển gen bằng PCR, chúng tôi thu hỗn hợp lá non của các dòng thuốc lá chuyển genđã cho kết quả PCR dương tính để đánh giá bằng lai Southern Blot. DNA tổng số của các dòng 2, 6, 9, 13, 14, 17 tương ứng với các dòng thuốc lá chuyển gen cho kết quả PCR dương tính và cây đối chứng không chuyển gen đã được cắt bằng enzyme hạn chế HindIII; sản phẩm PCR gen arsC từ pCAMBIA1301-arsC được cắt bằng 2 enzyme hạn chế NcoI và Eco72I. Sở dĩ chúng tôi chọn enzyme HindIII vì enzyme này không có điểm cắt trong trình tự của gen arsC. Do thời gian có hạn nên đề tài mới chỉ đánh giá được 6 dòng thuốc lá chuyển gen và cho kết quả ở hình 3.15.
.
Hình 3.15. Kết quả lai Southern Blot
(-): cây thuốc lá không chuyển gen arsC
(+): sản phẩm PCR arsC từ plasmid pCAMBIA1301-arsC 1-6: DNA tổng số của dòng chuyển gen được cắt bởi HindIII.
Theo như hình 3.15 ta thấy rằng sản phẩm PCR gen arsC từ plasmid pCAMBIA1301-arsC cho 1 vạch băng tương ứng với gen arsC. DNA tổng số được cắt bởi HindIIIcho kết quả lai Southern Blot các dòng thuốc lá chuyển gen số 1, 4, 6 cho 1 vạch băng ngang nhau chứng tỏ các dòng thuốc lá này có 1 bản copy ở trong
67
cây và vị trí gắn của gen arsC trong genome của các dòng thuốc lá có khả năng là cùng một vị trí. Trong khi đó, ở đối chứng âm cũng như ở các dòng thuốc lá 2, 3, 5 không cho vạch băng nào. Chứng tỏ quá trình chuyển gen arsC vào cây thuốc lá 1, 4, 6 (tương ứng với các dòng thuốc lá số 2, 13, 17) đã thành công.
68
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
- Biến nạp thành công chủng E. coli DH5α và chủng A. tumefaciens C58 mang vector pCAMBIA1301-arsC.
- Tạo được 24 dòng thuốc lá chuyển gen mang gen arsC sống sót trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc Cefotaxime và Hygromycin trong in vitro và ngoài tự nhiên.
- Đã kiểm tra được sự có mặt của gen arsC trong cây thuốc lá trồng ngoài tự nhiên bằng kỹ thuật PCR và chứng minh thành công bằng lai Southern Blot.
Kiến nghị
- Cần tiếp tục đánh giá khả năng tích lũy asen và đánh giá tính ổn định di truyền ở các thế hệ sau của các dòng thuốc lá mang gen arsC thu được.
- Mở rộng triển khai ứng dụng chủng A. tumefaciens C58 mang cấu trúc vector pCAMBIA1301-arsC để nghiên cứu chuyển gen ở các cây trồng khác nhằm mục đích tích lũy Asen cải tạo môi trường bị ô nhiễm Asen.
- Dựa trên những kết quả nghiên cứu của đề tài và điều kiện của từng vùng ô nhiễm cụ thể có thể tiếp tục tạo những cây trồng chuyển gen khác nhằm mục đích cải tạo môi trường.
69
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Đỗ Văn Ái, Mai Trọng Nhuận, Nguyễn Khắc Vinh (2005), Một số đặc điểm phân bố Arsen trong tự nhiên và vấn đề ô nhiễm arsen trong môi trường ở nước ta, Báo cáo của Cục địa chất và khoáng sản Việt Nam.
2. Đặng Thị An (2005), Nghiên cứu khả năng chống chịu kim loại nặng ở một số loài thực vật, Đề tài nghiên cứu cấp Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật 2005-2006.
3. Bùi Thị Kim Anh (2011), Nghiên cứu sử dụng thực vật (dương xỉ) để xử lý ô nhiễm Asen trong đất vùng khai thác khoáng sản, Luận án Tiến sĩ Môi trường đất và nước, Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.
4. Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak (2009), Công nghệ sinh học phân tử - Nguyên lý và ứng dụng của ADN tái tổ hợp, Nxb Khoa học và kĩ thuật.
5. Nguyễn Văn Bình, Nguyễn Đức Quý, Vũ Minh Quân, Lê Quang Thành (2000), “Sự phân bố và phát tán KLN trong đất và nước khu vực mỏ thiếc Sơn Dương”, Tạp chí các khoa học về trái đất, 22(2), tr. 134-139.
6. Nguyễn Tiến Cư, Trần Văn Tựa, Đặng Đình Kim, Đỗ Tuấn Anh, Lê Thu Thủy (2007), “Nghiên cứu khả năng xử lý chì (Pb) trong đất ô nhiễm bằng cây cỏ
Vetiver zizannioides”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học Viện Công nghệ môi trường - Nghiên cứu và ứng dụng - Kỉ niệm 5 năm thành lập Viện công nghệ môi trường, Viện KH &CN Việt Nam, Hà Nội, 29-30/10/2007, tr. 308-312.
7. Phạm Văn Khang, Nguyễn Ngọc Minh, Nguyễn Xuân Huân (2004), “Một số nghiên cứu về kim loại nặng trên thế giới”, Tạp chí khoa học đất, 20, tr. 157- 161.
8. Lê Văn Khoa, Nguyễn Xuân Cự, Trần Thiện Cường, Nguyễn Đình Đáp (2010),
Giáo trình ô nhiễm môi trường đất và biện pháp xử lý, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam.
70
9. Đặng Đình Kim (2010), Báo cáo tổng kết kết quả khoa học công nghệ đề tài nghiên cứu sử dụng thực vật để cải tạo đất bị ô nhiễm kim loại nặng tại các vùng khai thác khoáng sản, Chương trình KHNC cấp Nhà Nước KC08, Bộ Khoa học và Công nghệ.
10.Lê Thanh Hòa (2003),Sinh học phân tử virus Gumboro nghiên cứu ứng dụng tại Việt Nam, Nxb nông nghiệp, Hà Nội.
11.Diệp Thị Mỹ Hạnh, E. GarnierZarli (2007), “Lantana Canmara L., thực vật có khả năng hấp thu Pb trong đất để giải ô nhiễm”, Tạp chí phát triển khoa học và công nghệ, 10(1).
12.Đồng Thị Minh Hậu, Hoàng Thị Thanh Thủy, Đào Phú Quốc (2008), “Nghiên cứu và lựa chọn một số thực vật có khả năng hấp thu các kim loại nặng (Cr, Cu, Zn) trong bùn nạo vét kênh Tân hóa- Lò gốm”, Tạp chí phát triển khoa học và công nghệ, 11(4).
13.Lê Ðình Lương, Quyền Ðình Thi (2003), Kĩ thuật di truyền và ứng dụng, Nxb đại học quốc gia Hà Nội.
14.Nguyễn Quang Thạch (2005), Giáo trình Công nghệ sinh học nông nghiệp, Nxb Nông nghiệp.
15.Khuất Hữu Thanh (2003), Cơ sở di truyền phân tử và kĩ thuật gen, Nxb Khoa học và kĩ thuật, Hà Nội.
16.Lê Duy Thành (2001), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, Nxb Khoa học và kĩ thuật, Hà Nội.
17.Nguyễn Ðức Thành (2003), Chuyển gen ở thực vật, Nxb Khoa học và kĩ thuật, Hà Nội.
18.Bùi Phương Thảo, Hoàng Thu Hằng, Phạm Bích Ngọc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2013), “ Thiết kế vector chuyển gen Lsi2 góp phần nâng cao khả năng vận chuyển và tích lũy asen trong thực vật”, Hội nghị khoa học Công nghệ Sinh học toàn quốc 2013, tr. 1064-1069.
19.Vũ Quyết Thắng (1998), “Hàm lượng kim loại nặng trong đất và rau muống Thanh Trì”, Tạp chí hoạt động khoa học, tr. 31-32.
71
20.Hoàng Thị Thanh Thủy, Từ Thị Cẩm Loan, Nguyễn Như Hà Vy (2007), “Nghiên cứu địa hóa môi trường một số kim loại nặng trong trầm tích sông rạch Tp Hồ Chí Minh”, Tạp chí Phát triển Khoa học & Công nghệ, 10(1), tr. 47-54.
21.Nguyễn Thu Trang (2013), Thiết kế vector chuyển gen GSHI nhằm nâng cao khả năng tích lũy asen trong thực vật, Luận văn Thạc sĩ Công nghệ Sinh học, Đại học Thái Nguyên.
22.Lâm Minh Triết, Lê Huy Bá (2006), Sinh thái môi trường học cơ bản, Nxb Đại học Quốc gia TPHCM.
23.Nguyễn Đình Tuấn(2005), “Chất lượng nước kênh rạch tại Tp Hồ Chí Minh - Hiện trạng và thách thức”, Báo cáo hội thảo “Phát triển bền vững thành phố xanh trên lưu vực sông”, 5/2005, tr. 8 - 9.
24.Trần Văn Tựa, Nguyễn Đức Thọ, Đỗ Tuấn Anh, Nguyễn Trung Kiên và Đặng Đình Kim (2007), “Sử dụng cây sậy và cỏ vetiver trong xử lý nước thải chứa Cr và Ni theo phương pháp vùng rễ”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học Viện Công nghệ môi trường - Nghiên cứu và ứng dụng-Kỷ niệm 5 năm thành lập Viện công nghệ môi trường, Viện KH &CN Việt Nam, Hà Nội, tr.29.
25.Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về giới hạn cho phép của kim loại nặng trong đất ở Việt Nam, QCVN 03:2008/BTNMT.
26.Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2008), “Tạo cây thuốc lá kháng bệnh virus khảm dưa chuột bằng kỹ thuật RNAi”, Tạp chí công nghệ Sinh học, 6(4A), tr. 679-687.
72
Tài liệu tiếng Anh
27. Alloway B. and Ayres D. (1993), Chemical Principles of Environmental pollution, Blackie Academy and Profesional.
28. Agency for toxic substances and disease registry (ATSDR) (1999), Toxicological profile for Arsenic, U.S. Department of Heath and human services: Atlanta, GA. 29. Ashraf M., Foolad M.R. (2009), “Roles of glycine betaine and proline in
improving plants abiotic stress resistance”, Environmental and Experimental Botany, (59), pp. 206 – 216.
30. Barceló J. and Poschenrieder C. (2003), “Phytoremediation: principles and perspectives”, Contributions to Science, institute d’Edtudis Catalans, Bacelona, pp. 333 – 344.
31. Cangelosi G.A., Ankenbauer R.G., and Nester E.W. (1990), “Sugars induce the
Agrobacterium virulence genes through a periplasmic binding protein and a transmembrane signal protein”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 6708-6712. 32. Capuana M. (2011), “Heavy metals and woody plants-biotechnologies for
phytoremediation”, iForest, 4, pp. 7-15.
33. Chaney R. (1997), “Phytoremediation of soil metals”, Current Opinion in Biotechnology, 8, pp. 279–284.
34. Cezary K. and Bal R.S. (2001), “Fractionation and Mobility of Cooper, Lead, and Zinc in Soil Profiles in the Vicinity of a Cooper”, Smelter. J. Environ. Qual., Vol. 30, March-April 2001, pp. 485-491.
35. Chen H.M., Zheng C.R., Tu C. and Shen Z.G (2000), “Chemical methods and phytoremediation of soils contaminated with heavy metals”,Chemosphere, Vol. 41, No. 1-2, pp. 229-234.
36. Chiristina L., Finn O., et al (2002), “Remediation of mixed contamination Soil and tar/PAH contaminated Soil”.
37. Chopra V.L., Anwan N. (1990), Genetic Engineering and Biotechnology, Oxford and IBH Publishing CO.PVT, Ltd. UK.
73
38. Cohen S.N., Chang A.C., Hersu L. (1972), “Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA”,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, pp. 2110-2114.
39. DhankherO.P., Li Y., Rosen B.P., Shi J., Salt D., Senecoff J.F., Sashti N.A., Meagher R.B. (2002), “Engineering tolerance and hyperaccummulation of Arsenic in plants by combining Arsenate reductase and g-glutamylcysteine synthase expression”,Nature Biotechnology, 20, pp. 1140-1145.
40. Dietz A.C. and Schnoor J.L. (2001), “Advances in Phytoremediation. Environmental Health Prospectives”, Supplement 1, 109, pp. 163-169.
41. Ellis D.R., Gumaelius L., Indriolo E., Pickering I.J., Bank J.A., Salt D.E. (2006), “A novel arsenate reductase from the Arsenic hyperaccummulating fern Pterisvittata”, Plant Physol, 141, pp. 1544-1554.
42. Fallon K.M., Phillips R. (1989), “Responses to water stress in adapted and unadapted carrot cell suspension cultures”, Journal of Experimental Botany, 40, pp. 681-687.
43. Gelvin S.B. (2000), “Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration”, Annu Rev.Plant Physiol. Plant Mol. Biol, 51, pp. 223–256.
44. Ghosh M., Singh S.P. (2005), “A review on phytoremediation of heavy metals and utilization of íts by products”, Applied ecology and environmental research, 3(1), pp. 1-18.
45. Glick B.R., Jackj P. (1994), Molecular Biotechnology, ASM Press, Washington D.C. USA.
46. Gustavo A., Cabrera J. (1998), “The Agrobacteriumtumefaciens gene transfer to plant cell”, Molecular Microbiology, (26), pp. 1-14.
47. Ha S.B., Smith A.P., Howden R. Dietrich W.M., Bugg S., O’Connell M.J., Goldsbrough P.B., Cobbett C.S (1999), “Phytochelatin synthase genes from
Arabidopsis and the yeast Schzosaccharomycespombe”, Plant Cell, 11, pp. 1153-1163.
74
48. Hansen G., Chilton M.D. (1999), “Lessons in gene transfer to plants by a gifted microbe”, Curr. Top. Microbiol.Immunol, 240, pp. 22–57.
49. Hirschi K.D., Zhent R.G., Cunningham K.W., Reat P.A., Fink G.R. (1996), “CAX1, an HI/Ca2+ antiporter from Arabidopsis”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America, 93, pp. 8782- 8786.
50. Ma J.Q.,Komar M., Zhang T.W., Cai Y., Kenelley E.D. (2001), “A fern that hyperaccumulaters Arsenic”, Nature, pp. 409-509.
51. Mello D.J. (2003), Food Safety – Contaminants and toxins, CABI Publishing.
52. Murashige T., Skoog F. (1962),“A revised medium for rapid grow and bioassayswith tobaco cultures”,Physiol Plant, 15,pp. 473 – 497.
53. Norman Terry, Gary Banuelos (1999), Phytoremediation of contaminated soils and water, CRC Press/Lewis Publishers, Boca Raton, FL, pp. 85-107.
54. Prasad M.N.V., Freitas H.M.O. (2003), “Metal hyperaccumulation in plant – biodiversity prospecting for phytoremendiation technology”,ElectronJ. Biotechnol, 6(3), pp. 285-321.
55. Raskin I., Smith R.D., Salt D.E. (1997), “Phytoremediation of metals: Using plants to remove pollutants from the environment”, Curr.Opin. Biotechnol, 8(2), pp.221-226. 56. Sabarrinath S., Shan W., Lena Q.M., Bala R. (2009), “Expression of a
Pterisvittataglutaredoxin PvGRX5 in transgenic Arabidopsis thaliana
increases plant arsenic tolerance and decreases arsenic accumulation in the leaves”, Plant, Cell andEnvironment, 32, pp. 851–858.
57. Saghai M.A., Biyashev R.M., Yang G.P., Zhang Q., Allard R.W. (1984), “Extraodirarily polymorphic microsetellite DNA in barley: Species diversity, chromosome location, and population dynamics”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, pp. 5466-5470.
58. Sambrook J., Russell D.W. (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol.3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
75
59. Saxena P.K. et al (1999), “Phytomerediation of heavy metal contaminated and polluted soils”, In: MNV prasad & J Hagemayr (eds) Heavy metal stress on plants, From molecules to ecosystems, Springer Verlag, Berlin, pp. 305-329. 60. Shiralipour A., Ma L., Cao X. (2002), “Effects of compost on Arsenic
leachability in soils and Arsenic uptake by a fern”, Report #02-04, University of Florida, Gainesville, FL.
61. Smith E.F., Townsend C.O. (1907), "A Plant-Tumor of Bacterial Origin", Science, 25(643), 671–673.
62. Sun H.H., Sun A.C., Hyeon Y, Kyung-Suk C. (2011), “Screening of Cucumissativus as a new arsenic-accumulating plant and its arsenic accumulation in hydroponic culture”, Environ Geochem Health, 33, pp. 143– 149.
63. Topping J.F. (1998), Tobacco transformation, In: Foster GD, Taylor SC.Vol.81: Plant virology protocols, from virus isolation to transgenic resistance,Humana Press Inc,Totowa, NJ, pp. 365-385.
64. US-EPA (2002), Arsenic treatment technologies for soil, waste and water, Solid Waste and Emergency Response (5102G), EPA-542-R-02-004 September 2002, 132 pages.
65. Varsha M., Nidhi M., Anurag M. (2010), “Heavy metals in plants: phytoremediation: Plants used to remediate heavy metal pollution”, Agric. Biol. J. N. Am, 1(1), pp. 40-46.
66. Yadav R., Arora P., Kumar S. (2010), “Perspectives for genetic engineering of poplars for enhanced phytoremediation abilities”, Ecotoxicology, 19, pp. 1574–1588.
76
PHỤ LỤC Phụ lục 1: Cấu trúc vector pCAMBIA1301
77
Phụ lục 2: Quy trình chuyển gen quan tâm vào thuốc lá cải tiến (Toopping, 1998) [63]
1. Chủng khuẩn Agrobacterium tumefaciens có chứa gen quan tâm được bảo quản trong glycerol -80oC được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có chứa kháng sinh chọn lọc, nuôi tối ở 28oC trong 2 ngày.
2. Cây con in vitro phát triển 3-4 lá thật, chọn các lá bánh tẻ để tiến hành biến nạp. Các mảnh lá được cắt với kích thước khoảng 1 cm2
trong môi trường ½ MS lỏng và đặt lên môi trường cảm ứng CT1 (MS + 1mg/l BAP).
3. Một ngày trước khi biến nạp, chọn khuẩn lạc tròn đều, đứng độc lập nuôi lỏng trong 10 ml LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc, nuôi qua đêm (16 giờ). Sau đó nuôi phục hồi thêm 4 giờ trong 50 ml LB không bổ sung kháng sinh chọn lọc.
4. Biến nạp:
- Khuẩn sau khi nuôi được đem đo OD600= 0,6-1 thì sử dụng để biến nạp. - Đem ly tâm lạnh thu cặn khuẩn, cặn khuẩn được hòa tan với dung dịch ½ MS để tạo dịch huyển phù vi khuẩn.
- Các mảnh lá sau 2 ngày nuôi cấy cảm ứng trên môi trường CT 1 được chuyển sang b́nh tam giác có chứa dung dịch ½ MS lỏng và dịch huyền phù vi khuẩn.
5. Sau 30 phút chuyển các mảnh lá lên giấy thấm tiệt trùng, thấm khô và cấy lên môi trường CT1 không có kháng sinh, đồng nuôi cấy 2 ngày.
6. Sau 2 ngày, cấy chuyển các mảnh lá sang môi trường có bổ sung Cefotaxime 500mg/l và Hygromycin 5mg/l (CT2).
7. Sau 2-3 tuần, các mảnh lá bắt đầu được cảm ứng tạo mô sẹo chuyển sang môi trường MS có bổ sung Cefotaxime 500mg/l + Hygromycin 5mg/l (CT2).
8. Sau 4 tuần, các mảnh lá đã tạo chồi được chuyển sang môi trường MS có bổ sung Cefotaxime 400 mg/l + Hygromycin 10 mg/l (CT3)
78
9. Sau khi tạo đa chồi, các chồi phát triển tốt được chuyển sang môi trường tạo rễ MS + NAA 0,1 mg/l có bổ sung Cefotaxime 400 mg/l + Hygromycin 10 mg/l (CT4).
10. Cây con ra rễ nhiều, cao 5-7 cm thì được đua ra bầu chứa giá thể đất: trấu: cát (1:1:1).
11. Sau 2 tuần, cây phát triển ổn định, tiến hành kiểm tra cây sau chuyển gen.
Phụ lục 3: Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn
Tên môi trường Thành phần môi trường