phương pháp sốc nhiệt
Biến na ̣p là quá trình chuyển trực tiếp DNA vào tế bào nhâ ̣n. Các tế bào ở trạng thái có thể được biến nạp bởi DNA từ môi trường bên ngoài được gọi là tế bào khả biến (trong thí nghiệm này là tế bào khả biến E. coli chủng DH5α) bằng phương pháp sốc nhiê ̣t.
a. Chuẩn bị tế bào khả biến
Lấy một khuẩn lạc từ đĩa nuôi ở 37oC từ 16 – 20 giờ, cấy chuyển vào bình 100 ml có chưa 50 ml môi trường LB lỏng để ở tủ 37oC qua đêm.Chuyển dịch khuẩn sang ống eppendorf 1,5 ml cho vào đá để làm lạnh dịch khuẩn xuống 0oC.Ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút loại bỏ dịch để thu tế bào. Làm khô trong box. Hòa tan vào CaCl2 – MgCl2 (20 mM CaCl2, 80 mM MgCl2), đảo nhẹ bằng pipet 5 lần.Ly tâm
39
6000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch, thu tế bào. Hòa tan trong 50 µl CaCl2 0.1M bằng voltex.
b. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli bằng sốc nhiệt
Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli DH5α được tiến hành theo Cohen và cộng sự [38].Các bước tiến hành như sau:
Lấy tế bào khả biến từ tủ -80oC, sau đó làm tan tế bào khả biến từ từ bằng cách đặt trong đá 20-25 phút.Bổ sung 10µl vector tái tổ hợp vào ống đựng tế bào khả biến (50 – 100 µl) và đảo nhẹ. Đặt hỗn hợp ổn định trong đá 20 phút.Sốc nhiệt ở 42oC trong thời gian 45 giây, sau đó đặt trong đá 3 -5 phút.Bổ sung 300 µl môi trường LB lỏng, nuôi lắc với tốc độ 200 v/p, 37o
C trong thời gian 1 giờ.Cấy trải 100 µl -150 µl trên môi trường LB đă ̣c có bổ sung kháng sinh kanamycin 50mg/l. Nuôi qua đêm ở 37oC (khoảng 16 giờ).Plasmid pCAMBIA1301-arsC được biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α và nuôi trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l.