Phương pháp: DNA tổng số chiết xuất từ lá non cây thuốc lá chuyển gen được cắt bởi HindIII là nguyên liệu cho quá trình lai Southern blot. Nguyên tắc của Southern Blot là màng lai nitrocelllulose hoặc nylon có tích điện, có khả năng tiếp nhận DNA được biết từ lâu và được sử dụng trong các nghiên cứu lai acid nucleic khác nhau vào thập niên 1950 và 1960 của thế kỷ 20. Vào thời kỹ này, DNA cố định không được phân đoạn, chỉ đơn giản gồm DNA tổng số được gắn trên màng lai nitrocellulose. Sự ra đời của phương pháp điện di trên gel agarose vào đầu thập niên
43
1970 đã cho phép các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách dựa trên cơ sở kích thước của chúng. Phương pháp này được Southern mô tả tại Đại học Edingburgh năm 1975. Phương pháp Southern Blot đơn giản, hiệu quả và rất chính xác. Theo Chopra và Anwan [37] và Glick và Jackj [45], Southern Blot gồm 6 bước:
Cắt DNA bằng enzyme hạn chế thích hợp.
Phân đoạn bằng điện di trên gel agarose.
Biến tính DNA (thông thường khi nó còn trên gel agarose) bằng cách nhúng vào dung dịch NaOH 0,5M; DNA sợi kép sẽ được tách thành DNA sợi đơn. Chỉ DNA sợi đơn mới có thể chuyển lên màng lai.
Chuyển DNA đã biến tính lên màng lai. Sử dụng màng nylon có khả năng giữ DNA chắc hơn và ít đứt gãy hơn. Việc chuyển DNA thường được tiến hành bằng phương thức mao dẫn trong khoảng vài giờ đến qua đêm hoặc có thể dùng một thiết bị thấm chân không. Nếu dùng thiết bị thấm chân không thì sẽ nhanh hơn, chỉ mất khoảng 1 tiếng. Trong quá trình chuyển, vị trí các đoạn DNA vẫn được giữ nguyên không thay đổi.
Lai DNA đã được cố định trên màng với mẫu dò DNA có đánh dấu. Quá trình này dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa DNA trên màng lai với mẫu dò.
Định vị các phân tử lai DNA-mẫu dò.
Trong chuyển gen, để chứng minh gen được chuyển và gắn kết vào genome, người ta sử dụng phương pháp Southern Blot, vì phương pháp này rất nhạy, cho kết quả chính xác, ít bị ảnh hưởng bởi DNA lẫn tạp khác, đồng thời có thể nhận được thông tin về số lượng bản sao gen, nghĩa là số lượng gen chuyển gắn vào genome cây chuyển gen, Trong đề tài này, phương pháp Southern Blot được sử dụng để xác định sự có mặt và gắn gen nguyên vẹn của gen arsC trong genome của cây thuốc lá chuyển gen sau khi các cây này đã được sàng lọc bằng kháng sinh Cefotaxime và Hygromycin và được xác định sự có mặt của gen arsC bằng phương pháp PCR. a. Tạo mẫu lai
44
Tách chiết DNA giống thuốc lá K326 đã được chuyển gen arsC thông quaA. tumefacienC58-pCAMBIA1301-arsC.Thực hiện phản ứng cắt DNA bằng các enzyme giới hạn. Điện di và chuyển lên màng.
Quy trình chuyển DNA từ gel agarose lên màng nylon:
Rửa sạch gel bằng H20 deion, bổ sung dung dịch biến tính (1.5 M NaCl, 0.5 M NAOH) lắc đều ở nhiệt độ phòng.Rửa lại gel bằng H20 deion, bổ sung dung dịch trung hòa (1.5 M NaCl, 0.5 M Tris HCl pH 7.2, 1 mM EDTA). Lắc đều ở nhiệt độ phòng 15 phút. Đổ khay nhựa bằng buffer SSC20X (3 M NaCl, 0.3 M Na3C6H507 ), dùng một tấm kính làm cầu bắc ngang qua khay nhựa. Dùng 1 tấm giấy lọc Whaman 3 MM phủ lên trên miếng kính, 2 đầu giấy lọc nhúng chìm trong khay nhựa có chứa buffer SSC 20X. Làm ướt đều giấy lọc bằng buffer SSC 20X. Đặt gel agarose lên trên giấy lọc. Loại hết bọt khí nằm giữa giấy lọc và gel. Phủ màng nylon lên trên gel, chú ý loại hết bọt giữa nylon và gel, phủ 2-3 miếng giấy lọc Whatman 3 MM đã được làm ướt bằng buffer SSC 20X lên trên màng nylon, phủ lên trên giấy lọc 1 lớp giấy thấm dày, sau đó đặt 1 tấm kính nhỏ lên trên và chặn 1 quyển sách nhỏ lên trên cùng. Thí nghiệm được tiến hành qua đêm ở nhiệt độ phòng, bổ sung buffer SSC 20X vào khay nhựa khi cần thiết.Rửa màng nylon trong dung dịch SSC 2X, làm khô ở nhiệt độ phòng và cố định DNA trên lớp màng bằng cách chiếu đèn UV trong 2 phút.
b. Tạo probe
Thực hiện phản ứng PCR với gen arsCsau đó tinh sạch sản phẩm PCR. Tiếp theo thực hiện phản ứng đánh dấu như sau: Chuẩn bị mồi dò có gắn biotin theo kit của Fermentas và sử dụng ống 1.5 ml trong đó các thành phần sau:
45
Votex đều, ly tâm 3-5 giây cho mẫu không bám dính vào thành ống. Ủ trong nước sôi 5-10 phút, làm lạnh bằng cách cho vào đá, ly tâm 3 -5 giây để thu mẫu xuống dưới đáy. Bổ sung các thành phần sau vào trong ống:
Trộn đều, ly tâm 3 – 5 giây để thu mẫu, ủ mẫu ở 37oC trong 20 giờ. Dừng phản ứng bằng cách bổ sung 1 µl 0.5 M EDTA, pH 8.0. Mẫu có thể dùng ngay cho thí nghiệm hoặc lưu trữ ở -20o
C. c. Lai mẫu
Biến tính DNA tinh dịch cá hồi bằng cách ủ ở 100oC trong vòng 5 phút, làm lạnh trong đá và bố sung vào dung dịch lai cho tới nồng độ 50 – 100 µg/ ml. Đặt màng lai vào trong khay chứa dung dịch lai đã bổ sung DNA tinh dịch cá hồi biến tính, lắc 42oC trong 2 giờ. Mix mẫu dò được chuẩn bị trước, biến tính bằng cách ủ ở 100oC, 5 phút.Bổ sung hỗn hợp 2 mẫu dò vào trong dung dich lai tới nồng độ 25 – 100 ng/ml. Đổ bỏ dung dịch lai ở bước thứ 3, thay bằng dung dịch có bổ sung mẫu dò, ủ mẫu 42oC trong 12 giờ. Rửa lại màng lai bằng 2 lần dung dịch SSC 2X + SDS 0.1% trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Rửa lại 2 lần nữa trong dung dịch SSC 0.1X + SDS 0.1% trong 10 phút ở 65oC. Dùng giấy lọc Whatman 3MM làm khô màng lai.
d. Phát hiện mẫu dò trên màng lai (Fermentas Biotin Chromogenic Detection Kit) Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm: Rửa màng lai với 30ml Blocking / Washing buffer trong 5 phút ở nhiệt độ phòng trên máy lắc.Rửa lại màng lai bằng cách lắc với 30ml Blocking solution trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Ủ màng lai với 20 ml dung dịch Streptavidin – Alkaline Phosphatase ở nhiệt độ phòng trong 30 phút , lắc đều trên máy lắc. Rửa màng lai 2 lần với 60 ml Blocking /Washing buffer trong 15 phút. Ủ màng lai trong 20 ml buffer hiện trong 10 phút, lắc đều trên máy. Thực hiện
46
phản ứng enzyme giữa Alkaline Phosphatase với BCIP/NBT bằng cách ủ màng lai trong bóng tối với 10 ml cơ chất đã pha loãng, ủ màng lai qua đêm để phản ứng màu rõ nét. Rửa lại màng lai bằng nước khử trùng hai lần và chụp lại hình màng lai.
47
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ 3.1. Thiết kế vector chuyển nạp mang gen arsC
3.1.1. Sơ đồ vector pCAMBIA1301-arsC dự định thiết kế
Vật liệu cho thiết kế vector chuyển gen là vector pCAMBIA1301 và plasmid tái tổ hợp pBT-arsC. Vector pCAMBIA1301 có chứa promoter CaMV 35S là một promoter mạnh dùng để biểu hiện trong tế bào thực vật, vì vậy chúng tôi chọn promoter CaMV 35S để điều khiển gen arsC phục vụ cho quá trình chuyển gen vào cây thuốc lá đạt kết quả cao.
Hình 3.1. Sơ đồ cấu trúc vector pCAMBIA1301-arsC
3.1.2. Gắn gen arsC vào vector biểu hiện pCAMBIA 1301
Vector pCAMBIA1301 và gen arsC (được nhân bằng cặp mồi đặc hiệu
arsC-F/Rtừ vector tách dòng pBT-arsC)đều có chứa 1 điểm cắt của 2 enzyme giới hạn NcoI và Eco72I. Do đó chúng tôi thực hiện phản ứng cắt đồng thời gen arsC và pCAMBIA1301 với 2 enzyme NcoI và Eco72I nhằm thay thế gen Gus trong vector pCAMBIA1301 bằng gen arsC. Kết quả sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1% thể hiện trên hình 3.2.
48
Hình 3.2. Kết quả kiểm tra pCAMBIA1301 và arsC được cắt bằng NcoI và Eco72I
M: Marker Fermentas 1Kb 1: pCAMBIA1301
2: pCAMBIA1301 được cắt bằng NcoI và Eco72I
3: arsC được cắt bằng NcoI và Eco72I
Điện di sản phẩm cắt cho kết quả: plasmid pCAMBIA1301 có kích thước khoảng 11 kb (giếng 1). Plasmid này đã được cắt bằng hai enzyme NcoI và Eco72I cho 2 vạch (giếng 2), 1 vạch khoảng 9kb là của vector pCAMBIA1301 có chứa promoter CaMV 35S, gen kháng kháng sinh hygromycin và vạch còn lại cho kích thước khoảng 2 kb tương ứng với đoạn gen Gus; gen arsC sau khi cắt cho 1 vạch băng khoảng gần 500 bp (giếng 3).
Sản phẩm sau khi cắt được tiến hành tinh sạch gen mục tiêu arsC và pCAMBIA1301 đã được mở vòng bằng bộ KIT của hãng Fermentas để nhằm thu lại đoạn gen mục tiêu đồng thời loại bỏ các tạp chất để cho quá trình thiết kế vector có hiệu quả cao.
Khi dung dịch qua cột tinh sạch, DNA sẽ được gắn vào các phân tử có ái lực cao với chúng cố định trên màng lọc của cột. Dịch đệm cùng agarose
49
đượcloại bỏ nhờ ly tâm với tốc độ cao. DNA được thu lại bằng nướckhử ion. Sản phẩm tinh sạch được kiểm tra trên gel agarose 1 % thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Kết quả kiểm tra sản phẩm tinh sạch pCAMBIA1301và gen arsC sau khi cắt bằng enzyme NcoI và Eco72I
M: Marker Fermentas 1 kb
1: phân mảnh 9kb của pCAMBIA1301 cắt bằng NcoI và Eco72I (sau tinh sạch) 2: arsC được cắt bằng NcoI và Eco72I (sau tinh sạch)
Kết quả sản phẩm DNA tinh sạch (hình 3.3) có hàm lượng cao, không bị đứt gẫy, đúng với kích thước như tính toán lý thuyết của gen arsC và vector pCAMBIA1301 đã loại bỏ Gus. Chứng tỏ quá trình tinh sạch đủ điều kiện để thực hiện phản ứng lai nhờ T4 ligase tạo vector tái tổ hợp pCAMBIA1301-arsC.
3.1.3. Biến nạp pCAMBIA1301-arsC vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt phương pháp sốc nhiệt
Plasmid tái tổ hợp được tạo ra từ phản ứng lai sẽ được biến nạp vào tế bào khả biến E.Coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt để chọn lọc, nhân nhanh plasmid với số lượng lớn. Sản phẩm của quá trình biến nạp sau 16 giờ nuôi cấy LB đặc có bổ
50
sung kanamycin 50 mg/l ở 37oC cho các khuẩn lạc có màu trắng và nằm riêng rẽ với nhau (hình 3.4).
Hình 3.4. Khuẩn lạc E. Coli DH5α mọc trên môi trường có bổ sung kháng sinh Kanamycin 50mg/l.
3.1.4 Kết quả kiểm tra vector pCAMBIA1301 – arsC
3.1.4.1. Kết quả kiểm tra vector pCAMBIA1301-arsC bằng phản ứng PCR – colony colony
Các dòng khuẩn lạc mọc trên môi trường có kháng sinh chọn lọc Kanamycin 50 mg/l chưa chắc chắn đã là các dòng mang plasmid tái tổ hợp, chúng có thể là các khuẩn lạc mang plasmid tự đóng vòng, hoặc mang gen đích bị đứt gãy. Vì vậy, để chọn lọc dòng khuẩn lạc mang vector chứa gen đích, chúng tôi chọn các khuẩn lạc trắng và thực hiện phản ứng PCR – colony với cặp mồi đặc hiệu cho gen, kết quả thể hiện trên hình 3.5.
51
Hình 3.5. Ảnh điện di kiểm tra các dòng khuẩn lạc bằng PCR - colony
M: Marker Fermentas 1Kb 1, 2, 3, 4: các dòng khuẩn lạc (+): pBT-arsC
(-): pCAMBIA1301
Kết quả trên hình 3.5 cho thấy: hai khuẩn lạc 1 và 2 trên môi trường có kháng sinh chọn lọc cho kết quả dương tính. Hai mẫu dương tính đều lên 1 vạch băng duy nhất có kích thước khoảng 500bp phù hợp với kích thước của gen
arsCtheo tính toán lý thuyết. Chứng tỏ 2 trong số 4 khuẩn lạc mang plasmid pCAMBIA1301 – arsC. Mẫu đối chứng dương là plasmid pBT-arsC cũng cho vạch băng tương ứng của gen arsC khoảng 500 bp. Mẫu đối chứng âm vector pCAMBIA1301 không có vạch băng nào, chứng tỏ vector không có sẵn gen arsC.
3.1.4.2. Kết quả kiểm tra vector pCAMBIA1301-arsC bằng enzyme giới hạn NcoI và Eco72I NcoI và Eco72I
Để khẳng định thêm các dòng khuẩn lạc trên mang plasmid tái tổ hợp mong muốn, chúng tôi tiến hành lấy các plasmid trên đem thực hiện phản ứng cắt
52
bằng enzyme giới hạn NcoI và Eco72I, kết quả điện di sản phẩm cắt thể hiện ở hình 3.6.
Hình 3.6. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt vector pCAMBIA1301 - arsC bằng enzyme giới hạn NcoI và Eco72I.
M: Marker Fermentas 1Kb
1, 2: Plasmid của dòng khuẩn lạc
1’, 2’: Plasmid của các dòng khuẩn lạc ðýợc cắt bằng enzyme giới hạn NcoI và Eco72I.
Kiểm tra sản phẩm cắt của vector pCAMBIA1301-arsC trên gel agrose 1% được thể hiện ở giếng 1’, 2’ (hình 3.6): cho 2 vạch có kích thước khoảng 9kb và 500 bp tương ứng với vector pCAMBIA1301 đã loại bỏ gen Gus và gen arsC theo lý thuyết. Như vậy plasmid tái tổ hợp pCAMBIA1301-arsC được thiết kế thành công.
Vậy qua kiểm tra bằng xử lý enzyme giới hạn và phản ứng PCR – colony cho kết quả tốt. Do đó chúng tôi có thể khẳng định vector pCAMBIA1301 – arsC
53
3.2.Biến nạp vector pCAMBIA1301 – arsC vào vi khuẩn A. tumefaciens
Chúng tôi sử dụng 5-10 µl plasmid pCAMBIA1301-arsC đã được thiết kế thành công ở trên để biến nạp vào tế bào khả biến A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện. Sản phẩm của quá trình biến nạp được nuôi trên môi trường LB đặc có chứa Kanamycin 50 mg/l và Rifamycin 50 mg/l, ủ đĩa ở 28oC, sau 2 ngày nuôi cấy, kết quả thu được một lượng lớn khuẩn lạc trên đĩa thạch trong đó có nhiều khuẩn lạc tròn, nằm độc lập, thể hiện ở hình 3.7.
Hình 3.7. Ảnh kết quả biến nạp vector pCAMBIA1301-arsC vào vi khuẩnA. tumefaciens
Các khuẩn lạc có thể chứa plasmid tự đóng vòng hoặc gen bị đứt gãy. Vì vậy, để chọn ra những dòng khuẩn lạc như mong muốn (mang vector chuyển gen), chúng tôi đã tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR – colony. Kết quả kiểm tra vector pCAMBIA1301-arsC được biến nạp vào A. tumefaciens bằng phản ứng PCR - colony, thể hiện ở hình 3.8.
54
Hình 3.8.Ảnh điện di sản phẩm PCR-colony của 7 khuẩn lạc A. tumefaciens C58 được biến nạp pCAMBIA130-arsC.
M: Marker Fermentas 1Kb
1-7: dòng khuẩn lạcA. tumefaciens
(+): đối chứng dương (pCAMBIA1301-arsC) (-): đối chứng âm (pCAMBIA1301)
Dựa vào kết quả trên cho thấy, cả 7 dòng khuẩn lạc cho kết quả dương tính và cho cùng kích thước với vạch băng đối chứng là khoảng 500 bp. Đối chứng dương plasmid pCAMBIA1301-arsC cũng cho 1 vạch băng tương ứng với kích thước của gen arsC theo tính toán lý thuyết khoảng 500 bp. Đối chứng âm là vector pCAMBIA1301 không cho vạch băng nào. Vậy 7 dòng khuẩn lạc A. tumefaciens ở đây chính là nguồn nguyên liệu để chuyển gen arsC vào cây thuốc lá.
3.3. Tạo cây thuốc lá chuyển gen arsC
Dòng vi khuẩn A. tumefaciens C58 chứa plasmid pCAMBIA1301-arsC được chuyển vào giống thuốc lá K326 theo phương pháp của Topping có cải tiến [63] (phụ lục 2). Chúng tôi tiến hành chuyển gen arsC vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Kết quả theo dõi quá trình tái sinh của các dòng thuốc lá qua các lần thí nghiệm và các giai đoạn chọn lọc khác nhau được thể hiện trong hình 3.9, hình 3.10, hình 3.11 và bảng 3.1.
55
Giai đoạn mảnh lá tái sinh đa chồi sau chuyển gen.
Chọn các lá bánh tẻ, và cắt 4 cạnh mép lá theo kích thước 1 cm2biến nạp với dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens mang vector pCAMBIA1301-arsC. Chuyển các mảnh lá lên môi trường đồng nuôi cấy MS có bổ sung BAP 1mg/l (CT1 - phụ lục 4) (hình 3.9A). Sau 2 - 3 ngày đồng nuôi cấy, ta chuyển các mảnh lá lên môi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh Cefotaxime 500 mg/l và Hygromycin5 mg/l (CT2 - phụ lục 4). Ta thấy các mảnh lá chuyển gen có khả năng hình thành chồi trên môi trường chọn lọc CT2 này (hình 3.9B). Các chồi hình thành từ các cạnh của mảnh lá. Cũng trên môi trường CT2 này, ta đồng thời nuôi cấy những mảnh lá đối chứng không mang gen arsC ta thấy rằng những mảnh lá này không thể tái sinh được, các mảnh lá vàng dần và chết (hình 3.9D). Những mảnh lá đối chứng không mag gen arsC cũng được nuôi cấy trên môi trường MS không có bổ sung kháng sinh (hình 3.9C). Ta thấy rằng những mảnh lá đối chứng này có khả năng hình thành chồi trên môi trường không có chứa kháng sinh.
56
(A) (B)
(C) (D)
Hình 3.9. Hình ảnh chọn lọc mảnh lá tái sinh đa chồi sau chuyển gen
(A): Mảnh lá chuyển gen arsC được nuôi cấy trên môi trường đồng nuôicấy
(B): Mảnh lá chuyển gen arsC được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc gen lần 1 có bổ sung Cefotaxime 500 mg/l và Hygromycin5 mg/l.
(C): Mảnh lá đối chứng nuôi cấy trên môi trường không có kháng sinh
(D): Mảnh lá đối chứng được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc gen lần 1 có bổ