Dòng vi khuẩn A. tumefaciens C58 chứa plasmid pCAMBIA1301-arsC được chuyển vào giống thuốc lá K326 theo phương pháp của Topping có cải tiến [63] (phụ lục 2). Chúng tôi tiến hành chuyển gen arsC vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Kết quả theo dõi quá trình tái sinh của các dòng thuốc lá qua các lần thí nghiệm và các giai đoạn chọn lọc khác nhau được thể hiện trong hình 3.9, hình 3.10, hình 3.11 và bảng 3.1.
55
Giai đoạn mảnh lá tái sinh đa chồi sau chuyển gen.
Chọn các lá bánh tẻ, và cắt 4 cạnh mép lá theo kích thước 1 cm2biến nạp với dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens mang vector pCAMBIA1301-arsC. Chuyển các mảnh lá lên môi trường đồng nuôi cấy MS có bổ sung BAP 1mg/l (CT1 - phụ lục 4) (hình 3.9A). Sau 2 - 3 ngày đồng nuôi cấy, ta chuyển các mảnh lá lên môi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh Cefotaxime 500 mg/l và Hygromycin5 mg/l (CT2 - phụ lục 4). Ta thấy các mảnh lá chuyển gen có khả năng hình thành chồi trên môi trường chọn lọc CT2 này (hình 3.9B). Các chồi hình thành từ các cạnh của mảnh lá. Cũng trên môi trường CT2 này, ta đồng thời nuôi cấy những mảnh lá đối chứng không mang gen arsC ta thấy rằng những mảnh lá này không thể tái sinh được, các mảnh lá vàng dần và chết (hình 3.9D). Những mảnh lá đối chứng không mag gen arsC cũng được nuôi cấy trên môi trường MS không có bổ sung kháng sinh (hình 3.9C). Ta thấy rằng những mảnh lá đối chứng này có khả năng hình thành chồi trên môi trường không có chứa kháng sinh.
56
(A) (B)
(C) (D)
Hình 3.9. Hình ảnh chọn lọc mảnh lá tái sinh đa chồi sau chuyển gen
(A): Mảnh lá chuyển gen arsC được nuôi cấy trên môi trường đồng nuôicấy
(B): Mảnh lá chuyển gen arsC được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc gen lần 1 có bổ sung Cefotaxime 500 mg/l và Hygromycin5 mg/l.
(C): Mảnh lá đối chứng nuôi cấy trên môi trường không có kháng sinh
(D): Mảnh lá đối chứng được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc gen lần 1 có bổ sung Cefotaxime 500 mg/l và Hygromycin5 mg/l.
57
Giai đoạn chọn lọc cụm chồi sau chuyển gen
Khi những cụm chồi từ các mảnh lá tái sinh đa chồi tốt, ta tiến hành tách từng chồi riêng rẽ và được chuyển sang môi trường chọn lọc cây chuyển gen lần 2có bổ sung Cefotaxime 400 mg/l và Hygromycin 10 mg/l (CT3 – phụ lục 4)để tiếp tục sàng lọc những cụm chồi mang gen arsC( hình 3.10).
Hình 3.10. Hình ảnh chồi thuốc lá trong môi trường chọn lọc gen lần 2 có bổ sung
Cefotaxime 400 mg/l và Hygromycin10 mg/l.
Chúng tôi nhận thấy rằng trong cùng môi trường chọn lọc cây chuyển gen lần 2 có bổ sung Cefotaxime 400 mg/l và Hygromycin 10 mg/l, những chồi chưa được
58
chuyển gen sẽ dần chuyển sang màu vàng, những chồi thuốc lá được chuyển gen thành công sẽ phát triển xanh tốt.
Giai đoạn chọn lọc cây tái sinh hoàn chỉnh
Từ những chồi phát triển mạnh ở môi trường chọn lọc cây chuyển gen lần 2 (CT3) ta chuyển chúng sang môi trường ra rễ có bổ sung NAA 0.1 mg/l, Cefotaxime 400 mg/l và Hygromycin 10 mg/l (CT4 - phụ lục 4).
59
(A) (B)
(C)
Hình 3.11.Hình ảnh cây thuốc lá tái sinh hoàn chỉnh sau 2 tuần nuôi cấy
(A):Cây thuốc lá chuyển gen tái sinh hoàn chỉnh trên môi trường ra rễ có kháng sinh Cefotaxime 400 mg/l +Hygromycin 10 mg/l.
(B): Cây đối chứng và cây chuyển gen cấy trên môi trường ra rễ có kháng sinh Cefotaxime 400 mg/l+Hygromycin 10 mg/l.
60
Đối với cây thuốc lá, chồi cũng có thể ra rễ ngay trên môi trường đa chồi có bổ sung kháng sinh cefotaxime 400 mg/l và hygromycin 10 mg/l nhưng tỷ lệ ra rễ ít hơn so với môi trường ra rễ có bổ sung thêm NAA 0.1 mg/l.Hình 3.11A cho thấy, cây thuốc lá mang gen arsCsinh trưởng và phát triển khỏe mạnh trong môi trường ra rễ và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Hình 3.11B, trong môi trường ra rễ có bổ sung kháng sinh cây chuyển gen có khả năng hình thành rễ và phát triển, còn cây đối chứng không ra rễ, cây yếu, lá héo dần và chết sau 6 tuần nuôi cấy.Hình 3.11C, những cây đối chứng không chuyển gen được nuôi cấy trên môi trường không có kháng sinh vẫn có khả năng ra rễ và phát triển bình thường.
Ta thấy rằng: các mảnh lá, cụm chồi và cây được chuyển gen có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt trên môi trường có kháng sinh chọn lọc hygromycin và cefotaxime (vì cấu trúc plasmid pCAMBIA1301-arsC có gen kháng kháng sinh hygromycin hpt (hygromycin phosphostransferase-hpt), khi được lây nhiễm vào các mảnh thuốc lá,gen này có khả năng tạo ra sản phẩm ức chế tác động của hygromycin được bổ sung trong môi trường chọn lọc). Cùng môi trường đó các mảnh thuốc lá không chuyển gen có xu hướng ngả màu vàng ở mép lá, lan dần vào phiến lá và chết (trong môi trường chọn lọc có bổ sung hygromycin, những mảnh lá, cụm chồi, cây không mang cấu trúc chuyển gen pCAMBIA1301-arsC cũng đồng thời không mang gen kháng hygromycin sẽ không thể tái sinh và phát triển được). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành 3 lần bố trí thí nghiệm, ta thu được kết quả về khả năng hình thành và phát triển của cây thuốc lá mang cấu trúc pCAMBIA1301-arsC trong bảng 3.1 dưới đây:
61
Bảng 3.1. Khả năng hình thành và phát triển của cây thuốc lá chuyển cấu trúc
vector pCAMBIA1301 tái tổ hợp mang gen đích.
WT1: Mảnh lá thuốc lá không chuyển gen trên môi trường có bổ sung kháng sinh. WT2: Mảnh lá thuốc lá không chuyển gen trên môi trường không có kháng sinh.
Từ bảng 3.1 ta thấy rằng: Với tổng số 136 mảnh lá được biến nạp A. tumefaciens-pCAMBIA1301-arsC trong 3 lần thí nghiệm, có tỉ lệ hình thành chồi trung bình khoảng 90.3%. Ta thực hiện tách và chọn ra 128 chồi để tiếp tục nuôi cấy qua các môi trường chọn lọc và môi trường ra rễ, kết quả cho ta về tỉ lệ số chồi có khả năng ra rễ trung bình khoảng 90.7%. Thí nghiệm thứ 2, các mảnh lá không chuyển gen được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có bổ sung kháng sinh. Ta thấy rằng các mảnh lá này không có khả năng hình thành chồi, các mảnh lá này sẽ bị vàng từ mép lá lan dần vào trong, rồi dẫn đến chết. Thí nghiệm thứ 3, các mảnh lá không chuyển gen được nuôi cấy trên môi trường MS không có bổ sung kháng sinh. Ta thấy các mảnh lá này vẫn có khả năng hình thành chồi, phát triển và ra rễ để hình thành cây bình thường.
62
Như vậy có thể kết luận đã hoàn thành việc chuyển gen và chọn cây in vitro
sau chuyển gen. Nhìn chung tỷ lệ tái sinh của các mẫu chuyển gen arsC là cao. Qua các giai đoạn chọn lọc in vitro, từ 136 mảnh lá chuyển gen trong 3 lô thí nghiệm đã thu được 28 dòng thuốc lá chuyển gen arsC phát triển tốt, lá xanh đậm, chồi mập, rễ dài, nhiều. Để tránh rủi ro mất dòngkhi trồng ra môi trường tự nhiên, các dòng thuốc lá mang gen arsC này sẽ được tiến hành nhân nhanh in vitro trước.
Giai đoạn ra cây vào giá thể đất: trấu: cát
Chọn mỗi dòng 3 cây sinh trưởng và phát triển tốt trong in vitro sau 1 tháng nuôi cấy được trồng ngoài tự nhiên trên giá thể trấu: đất: cát (tỷ lệ 1:1:1). Để cây thích nghi dần với môi trường đất và tránh mất nước đột ngột dẫn đến cây chết, sau khi đã ra cây vào bầu đất, cho vào túi ni lông sạch, ghim giữ ở phần trên túi và cho lại vào phòng nuôi cây điều khiển nhiệt độ 25-28oC, cường độ ánh sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày để cây phát triển ổn định. Sau 7 ngày đưa cây ra nhà lưới để cây thích nghi với điều kiện ánh sáng tự nhiên. Trong tổng số 28 dòng có 24 dòng cây thuốc lá phát triển tốt. Với đặc điểm là hệ rễ phụ của cây thuốc lá phát triển mạnh, có thể phát triển những đốt thân gần gốc nên tỷ lệ sống của các dòng khi vào giá thể khá cao (>85%), chứng tỏ cây thích nghi với điều kiện ngoại cảnh khá tốt (hình 3.12 A + B).
63
(A) (B)
Hình 3.12. Cây thuốc lá hoàn chỉnh được trồng trong bầu đất: trấu: cát
(A): Cây thuốc lá chuyển gen được trồng ở bầu đất sau 15 ngày (B): Cây thuốc lá chuyển gen sau 45 ngày ra cây
Tác giả Nguyễn Thu Trang đã thiết kế vector chuyển gen GSHI vào cây thuốc lá. Đây cũng là một gen có khả năng tích lũy asen. Tác giả đã thu được 114 dòng cây ra rễ trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc [21]. Dhankher và cộng sự cũng đã chuyển đồng thời gen arsC với gen khởi động rubisco từ đậu tương (SRS1p) và gen γ-ECS với gen khởi động actin của nấm men (ACT2p) vào Arabidopsis đã tạo ra cây chuyển gen có khả năng chống chịu và tích lũy asen cao nhiều lần so với cây đối chứng [39].
Tóm lại, việc chuyển gen arsC vào cây thuốc lá, chọn lọc sau chuyển gen, tái sinh thành cây hoàn chỉnh trên môi trường chọn lọc và trồng cây vào bầu đất đã đạt được kết quả bước đầu. Các dòng thuốc lá chuyển gen đã sẵn sàng cho việc đánh giá tiếp theo.
64