Các vector chỉ thực hiện được chức năng của mình khi chúng có một số đặc tính như: Có khả năng tự sao chép độc lập và tích cực trong tế bào vật chủ; có kích thước nhỏ, dễ chèn gen mục tiêu, dễ xâm nhập và được sao chép; mang một số dấu hiệu chọn lọc giúp phân biệt các tế bào mang plasmid tái tổ hợp với các tế bào không có plasmid tái tổ hợp; tồn tại bền vững trong tế bào vật chủ. Các đặc tính này là cơ sở quyết định các thành phần chính của plasmid với: gen quan tâm được gắn thêm đoạn khởi động và đoạn kết thúc; gen chỉ thị chọn lọc; các thành phần khác như vùng khởi đầu sao chép và vùng trình tự nhân dòng đa điểm cắt (MCS - Multi cloning sites) [10]. Đa số các vector chuyển gen như vector pCAMBIA1301 có kích thước khoảng 12-13 kb với các thành phần chính như sau:
(1). Đoạn khởi động gen (promoter)
Các gen ngoại lai có thể được biểu hiện thành protein cần phải có mặt các tín hiệu điều khiển thích hợp ở những vị trí thích hợp tương ứng. Những tín hiệu không thể thiếu trong quá trình biểu hiện gen bao gồm đoạn khởi động gen và đoạn kết thúc gen. Đoạn khởi động bao gồm trình tự nucleotide phía đầu 5’ của các gen cấu trúc. Nó đóng vai trò điều khiển quá trình phiên mã nhờ khả năng đảm bảo các vị trí nhận biết cho RNA polymerase, các yếu tố hoạt hóa và khởi động. Trong thực tế, phần lớn promoter 35S từ virus khảm hoa súp lơ (Cauliflower Mosaic virus 35S promoter, viết tắt CaMV 35S) được sử dụng cho sự biểu hiện của gen biến nạp ở tất
29
cả các loại mô và tế bào [17]. Tuy nhiên, CaMV 35S-promoter có khả năng hoạt động mạnh và rộng rãi ở nhiều loại mô của cây hai lá mầm nhưng lại ít hoạt động ở cây một lá mầm. Để khắc phục nhược điểm này CaMV35S-promoter được sử dụng kết hợp với các thành phần khởi động khác, chẳng hạn promoter pEmu chứa nhiều bản sao của các tiểu phần phản ứng kị khí của gen Adh1 từ ngô và các tiểu phần của gen tổng hợp octopine từ A. tumefaciens đã làm gia tăng sự biểu hiện của gen trong cây một lá mầm lên hàng chục lần [13].
Promoter 35S có kích thước 835bp gồm 3 thành phần như sau:
Hình 1.2. Cấu trúc của promoter CaMV 35S
Hộp TATA ở vị trí từ -46 đến +8.
Vùng tăng cường A (enhancer) từ vị trí –90 đến -46, làm tăng biểu hiện gen ngoại lai ở rễ.
Vùng tăng cường B (enhancer) từ vị trí -343 đến -90, làm tăng biểu hiện gen ngoại lai ở lá.
(2). Vùng khởi động sao chép DNA (DNA-ori).
Các kĩ thuật di truyền liên quan rất nhiều đến E. coli mà Ti-plasmid thiếu điểm khởi đầu sao chép trong E. coli. Do đó, cần thiết kế thêm điểm khởi đầu sao chép để Ti-plasmid vừa có thể tự sao chép trong E. coli và A. tumefaciens.
+ Vùng pUC ori khởi động sao chép trong E. coli có nguồn gốc từ vector pUC19.
+ Vùng pRK2 oriV khởi động sao chép trong A. tumefaciens có nguồn gốc từ plasmid pRK2.
30
Trong vùng này chứa trình tự điểm cắt của một số enzyme giới hạn như:
HindIII, SmaI, BamHI, SacI, XbaI, SphI, PstI, EcoRV,EcoRI… (4). Vùng kết thúc (terminator).
Vùng kết thúc (vùng 3’) của các gen có các trình tự đặc trưng riêng. Vùng 3’ bao gồm các trình tự cho phép RNA polymerase nhận biết dấu hiệu ngừng phiên mã, và các trình tự kết thúc một gen để phân biệt gen này với gen khác [15]. Các đoạn kết thúc thường có đuôi poly A như: AATTAA hoặc AACCAA.
(5). Gen chỉ thị.
Các gen chỉ thị trong chuyển gen thực vật thường có nguồn gốc từ vi khuẩn hoặc thực vật, gồm 2 loại như sau:
+ Gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker gene): Các gen có nguồn gốc từ plasmid của vi khuẩn, gen mã hóa cho các enzyme phân hủy kháng sinh hoặc các chất chọn lọc đặc hiệu.
+ Gen chỉ thị sàng lọc (screenable marker gene hoặc reporter gene): gen chỉ thị sàng lọc cần có một số đặc điểm như: sản phẩm chỉ thị là duy nhất và không độc với tế bào thực vật, các enzyme chỉ thị phải có khả năng dịch mã ổn định cao, phương pháp phân tích thuận tiện, rẻ tiền, độ nhạy cao và có khả năng phản ứng với các polypeptide ngoài mà không ảnh hưởng hoạt tính enzyme. Ví dụ, chỉ thị β- glucuronidase (Gus) cho phép sàng lọc hoạt tính enzyme dễ dàng trên cơ sở kĩ thuật nhuộm tế bào với dung dịch X-gluc. Tế bào, mô chuyển gen sẽ có màu xanh đặc trưng.
31
CHƢƠNG 2.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU