NcoI và Eco72I
Để khẳng định thêm các dòng khuẩn lạc trên mang plasmid tái tổ hợp mong muốn, chúng tôi tiến hành lấy các plasmid trên đem thực hiện phản ứng cắt
52
bằng enzyme giới hạn NcoI và Eco72I, kết quả điện di sản phẩm cắt thể hiện ở hình 3.6.
Hình 3.6. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt vector pCAMBIA1301 - arsC bằng enzyme giới hạn NcoI và Eco72I.
M: Marker Fermentas 1Kb
1, 2: Plasmid của dòng khuẩn lạc
1’, 2’: Plasmid của các dòng khuẩn lạc ðýợc cắt bằng enzyme giới hạn NcoI và Eco72I.
Kiểm tra sản phẩm cắt của vector pCAMBIA1301-arsC trên gel agrose 1% được thể hiện ở giếng 1’, 2’ (hình 3.6): cho 2 vạch có kích thước khoảng 9kb và 500 bp tương ứng với vector pCAMBIA1301 đã loại bỏ gen Gus và gen arsC theo lý thuyết. Như vậy plasmid tái tổ hợp pCAMBIA1301-arsC được thiết kế thành công.
Vậy qua kiểm tra bằng xử lý enzyme giới hạn và phản ứng PCR – colony cho kết quả tốt. Do đó chúng tôi có thể khẳng định vector pCAMBIA1301 – arsC
53
3.2.Biến nạp vector pCAMBIA1301 – arsC vào vi khuẩn A. tumefaciens
Chúng tôi sử dụng 5-10 µl plasmid pCAMBIA1301-arsC đã được thiết kế thành công ở trên để biến nạp vào tế bào khả biến A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện. Sản phẩm của quá trình biến nạp được nuôi trên môi trường LB đặc có chứa Kanamycin 50 mg/l và Rifamycin 50 mg/l, ủ đĩa ở 28oC, sau 2 ngày nuôi cấy, kết quả thu được một lượng lớn khuẩn lạc trên đĩa thạch trong đó có nhiều khuẩn lạc tròn, nằm độc lập, thể hiện ở hình 3.7.
Hình 3.7. Ảnh kết quả biến nạp vector pCAMBIA1301-arsC vào vi khuẩnA. tumefaciens
Các khuẩn lạc có thể chứa plasmid tự đóng vòng hoặc gen bị đứt gãy. Vì vậy, để chọn ra những dòng khuẩn lạc như mong muốn (mang vector chuyển gen), chúng tôi đã tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR – colony. Kết quả kiểm tra vector pCAMBIA1301-arsC được biến nạp vào A. tumefaciens bằng phản ứng PCR - colony, thể hiện ở hình 3.8.
54
Hình 3.8.Ảnh điện di sản phẩm PCR-colony của 7 khuẩn lạc A. tumefaciens C58 được biến nạp pCAMBIA130-arsC.
M: Marker Fermentas 1Kb
1-7: dòng khuẩn lạcA. tumefaciens
(+): đối chứng dương (pCAMBIA1301-arsC) (-): đối chứng âm (pCAMBIA1301)
Dựa vào kết quả trên cho thấy, cả 7 dòng khuẩn lạc cho kết quả dương tính và cho cùng kích thước với vạch băng đối chứng là khoảng 500 bp. Đối chứng dương plasmid pCAMBIA1301-arsC cũng cho 1 vạch băng tương ứng với kích thước của gen arsC theo tính toán lý thuyết khoảng 500 bp. Đối chứng âm là vector pCAMBIA1301 không cho vạch băng nào. Vậy 7 dòng khuẩn lạc A. tumefaciens ở đây chính là nguồn nguyên liệu để chuyển gen arsC vào cây thuốc lá.