NGHIÊN cứu PHÂN lập và CHUYỂN GEN LIÊN QUAN đến TÍNH CHỊU hạn vào GIỐNG lúa ở VIỆT NAM

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Cao Lệ Quyên NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀO GIỐNG LÚA Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2016 Công trình đƣợc hoàn thành tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Xuân Hội PGS.TS Đinh Đoàn Long Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án đƣợc bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Quốc gia họp tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội vào hồi…giờ 00, ngày…tháng…năm… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm thông tin - Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội Đặt vấn đề Gần đây, ảnh hƣởng tƣợng biến đổi khí hậu toàn cầu, hạn hán xảy ngày thƣờng xuyên hơn, với mức độ ngày trầm trọng, gây tác động lớn tới tổng sản lƣợng lƣơng thực quốc gia, ảnh hƣởng tới công tác xuất lúa gạo, đe doạ trực tiếp tới an ninh lƣơng thực khu vực giới.Trong điều kiện khí hậu toàn cầu biến đổi mạnh mẽ, việc tạo giống trồng có suất cao, đồng thời chống/chịu đƣợc với điều kiện bất lợi môi trƣờng trở thành nhiệm vụ then chốt khoa học nông nghiệp Tuy nhiên, tất giống trồng chống chịu điều kiện môi trƣờng bất lợi đƣợc sử dụng sản xuất đƣợc lai tạo dựa phƣơng pháp chọn giống truyền thống, hầu nhƣ chƣa có giống trồng chịu hạn đƣợc tạo b ng phƣơng pháp công nghệ sinh học Sang k I, với phát triển b ng nổ sinh học phân tử công nghệ tế bào, hai định hƣớng chọn giống chịu hạn đƣợc nhà khoa học đặc biệt quan tâm chọn giống phân tử chọn giống chuyển gen Tính trạng chịu hạn tính trạng đa gen (với tham gia hàng trăm gen khác nhau), định hƣớng chọn giống phân tử gặp khó khăn lớn việc quy tụ tính trạng, gen quan trọng liên quan đến chịu hạn Gần đây, dựa thành tựu nghiên cứu chức hệ gen thực vật, c ng với phát triển kỹ thuật microaray, proteomic , nhà khoa học phát chứng minh vai trò quan trọng nhóm gen điều khiển việc tăng cƣờng tính chịu hạn thực vật Nhóm gen điều khiển mặc d không tham gia trực tiếp vào trình đáp ứng với điều kiện hạn thực vật nhƣng biểu chúng lại có vai trò điều hòa biểu nhiều gen chức khác tham gia vào trình đáp ứng hạn, dẫn tới làm tăng cƣờng khả chịu hạn thực vật Phát mở hƣớng nghiên cứu cho lĩnh vực chọn giống chuyển gen thực vật, ch cần chuyển hay vài gen điều khiển thay vài trăm gen chức vào để tăng cƣờng tính chống chịu trồng Chính lí mà nghiên cứu phân lập, đặc tính hoá gen điều khiển liên quan đến tính chịu hạn trở thành định hƣớng nghiên cứu đầy tiềm việc chọn tạo giống chịu hạn Ở Việt Nam, khoảng 10 năm trở lại đây, nghiên cứu phân lập gen chịu hạn tạo giống trồng chống chịu hạn b ng công nghệ chuyển gen thực vật bắt đầu đƣợc số phòng thí nghiệm quan tâm Tuy nhiên, hầu hết chƣơng trình, dự án nghiên cứu gen chống chịu stress môi trƣờng nói chung chống chịu hạn nói riêng sử dụng nguồn gen từ nƣớc gen đƣợc công bố nhóm nghiên cứu khác giới Cho đến nay, chƣa có đề tài nghiên cứu hoàn ch nh phân lập gen liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn thực vật Từ đó, đề xuất tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu phân lập chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa Việt Nam” với mục đích để tạo nguồn vật liệu, số liệu quan trọng việc tạo giống trồng chuyển gen có khả chống chịu điều kiện hạn Mục tiêu nghiên cứu i) Phân lập đƣợc gen mã hóa nhân tố phiên mã s R /2 liên quan tính chịu hạn giống lúa Việt Nam ii) Tối ƣu hoá đƣợc quy trình biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens số giống lúa Việt Nam iii) Tạo đƣợc số dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã s R /2 có kiểu hình tƣơng đồng đối chứng (cây không chuyển gen) điều kiện bình thƣờng có khả chống/chịu (tiếp tục sinh trƣởng, cho thu hạt) bị xử l hạn điều kiện phòng thí nghiệm Đối tƣợng v nội ung nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu luận án gen OsDREB1A/2A mã hóa nhân tố điều hòa phiên mã liên quan tới tính chịu hạn giống lúa Việt Nam vai trò, biểu gen mã hóa nhân tố phiên mã dòng chuyển gen dƣới điều khiển promoter liên tục cảm ứng ác n i ung nghiên cứu  Nội dung 1: Phân lập gen hai gen OsDREB1A OsDREB2A liên quan đến tính chịu hạn từ thƣ viện c N giống lúa Việt Nam; thiết kế cấu trúc chuyển gen thực vật (binary vector) cho gen OsDREB1A/OsDREB2A dƣới điều khiển promoter liên tục (Ubiquitine)/cảm ứng (Lip9)  Nội dung 2: Tối ƣu hóa trình phát sinh callus tái sinh từ callus số giống lúa Việt Nam; hoàn thiện kỹ thuật biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens số giống lúa Việt Nam có tiềm phát sinh callus khả tái sinh cao  Nội dung 3: iến nạp cấu trúc biểu nhân tố phiên mã vào giống lúa Việt Nam sàng lọc dòng chuyển gen (kiểu hình- so sánh với đối chứng, kiểu gen- xác định tồn ổn định số lƣợng cấu trúc biến nạp chuyển gen)  Nội dung 4: Đánh giá biểu (kiểu hình kiểu gen) dòng chuyển gen (T3, cấu trúc biến nạp) điều kiện xử l hạn phòng thí nghiệm Địa điểm nghiên cứu Luận án đƣợc thực địa điểm chính: ộ môn ệnh học Phân tử, Viện i truyền Nông nghiệp (Viện hoa học Nông nghiệp Việt Nam) địa ch uy tín, dẫn đầu nƣớc công tác phân lập, nghiên cứu chức gen mã hóa nhân tố phiên mã; Phòng Thí nghiệm tƣơng tác trồng-vi sinh vật thuộc Trung tâm nghiên cứu phát triển (IR ) ontpellier phòng thí nghiệm có trang bị đại, có chuyên gia uy tín nghiên cứu chức năng, biểu gen/bộ gen thực vật (đặc biệt lúa) Đóng góp luận án Luận án công trình Việt Nam thực cách có hệ thống nghiên cứu theo định hƣớng ứng dụng hai gen mã hóa nhân tố phiên mã OsDREB1A OsDREB2A liên quan tính chịu hạn Trong nghiên cứu này, trình tự mã hóa OsDREB1A/OsDREB2A dƣới điều khiển promoter hoạt động liên tục (Ubiquitin) promoter cảm ứng stress (Lip9) đƣợc nghiên cứu biểu ảnh hƣởng đến lúachuyển gen điều kiện thông thƣờng điều kiện bất lợi Luậnánđã chọn đƣợc 04 dòng lúa Chành trụi chuyển gen (OsDREB1A) kiểu hình bình thƣờng có khả tăng cƣờng chịu hạn (đã trì đến T3) Ngoài ra, nghiên cứu này, lần Việt Nam tiến hành khảo sát chi tiết khả phát sinh callus khả tái sinh hoàn ch nh từ callus nhiều giống lúa Việt Nam (giống phổ biến, giống chịu hạn, giống địa phƣơng ) ết nghiên cứu ch số giống lúa có tiềm để tiếp tục tối ƣu quy trình chuyển gen cho giống lúa sau Đây tiền đề cho nghiên cứu nh m tạo giống lúa công nghệ sinh học b ng công nghệ ch nh sửa hệ gen không qua lai tạo có đặc điểm nông sinh học vƣợt trội mà giữ phẩm chất giống gốc ban đầu Luận án lần Việt Nam thành công việc ứng dụng phản ứng PCR định lƣợng việc ƣớc tính số lƣợng cấu trúc chuyển gen xác định dòng chuyển gen đồng hợp từ hệ T1 Với kết từ nghiên cứu này, tin r ng phƣơng pháp ph hợp cho điều kiện phòng thí nghiệm nhiều hạn chế nƣớc tiến hành nghiên cứu, sàng lọc dòng chuyển gen Ứng ụng thực tiễn luận án ết nghiên cứu luận án tạo đƣợc dòng T (đồng hợp, gen OsDREB1A dƣới điều khiển promoter cảm ứng Lip9) có kiểu hình tƣơng đồng đối chứng không chuyển gen đặc biệt có khả phục hồi kết hạt sau tuần ngừng tƣới nƣớc Đây kết quan trọng, chứng tỏ tiềm ứng dụng OsDREB1A điều hòa biểu gen mã hóa nhân tố phiên mã dƣới điều khiển promoter cảm ứng công tác tạo giống chuyển gen chịu hạn Trên sở kết luận án, vector biểu gen OsDREB1A OsDREB2A luận án tạo đƣợc nghiên cứu chuyển vào giống trồng quan trọng nhƣ ngô, đậu tƣơng, bông… để chọn tạo giống chuyển gen chịu hạn nh m đáp ứng nhu cầu cấp thiết sản xuất điều kiện thay đổi khí hậu toàn cầu Các dòng chuyển gen đƣợc trì theo dõi nhà lƣới để làm nguyên liệu cho công tác lai tạo giống điều kiện thực tế cho phép (chấp nhận lúa chuyển gen vật liệu di truyền kiện chuyển gen tạo ra) Bố cục luận án Luận án gồm 137 trang, bao gồm: Phần mở đầu (06 trang); Tổng quan tài liệu (32 trang); Nguyên liệu phƣơng pháp nghiên cứu (18 trang); Kết nghiên cứu thảo luận (36 trang); Kết luận (02 trang); Kiến nghị (01 trang); Các công trình khoa học tác giả liên quan đến luận án (01 trang); Tài liệu tham khảo (12 trang) với 135 tài liệu gồm thứ tiếng: tiếng Việt (12 tài liệu) tiếng Anh (123 tài liệu); Phụ lục (14 trang) Luận án có 18 bảng, 24 hình Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ẢNH HƢỞNG CỦA HẠN HÁN ĐẾN NÔNG NGHIỆP & THỰC VẬT Hạn thực vật khái niệm đƣợc d ng để ch trạng thái thiếu nƣớc môi trƣờng gây nên suốt trình sống hay giai đoạn sống, làm ảnh hƣởng đến trình sinh trƣởng phát triển thực vật ôi trƣờng khô hạn gây hàng loạt tác động tiêu cực tới thực vật tất cấp độ, từ hình thái tới phân tử tất giai đoạn phát triển Để đối phó với điều kiện hạn hán, thực vật khởi động chế phòng vệ chống lại thiếu hụt nƣớc, sau loạt chế cấp độ khác Đáp ứng chống chịu stress hạn thực vật đƣợc thực thông qua chuỗi trình phức tạp với tham gia hàng loạt yếu tố chia thành giai đoạn: nhận tín hiệu – dẫn truyền tín hiệu – đáp ứng chống chịu khởi đầu chuỗi truyền tín hiệu 1.2 PHẢN ỨNG CỦA THỰC VẬT TR NG ĐIỀU KIỆN HẠN Thực vật thích nghi với môi trƣờng sống nhờ khả điều hòa nhanh biểu gen chức Quá trình điều hòa biểu gen đóng vai trò quan trọng đáp ứng thực vật với điều kiện stress phi sinh học, có hạn hán Các nghiên cứu gần chứng minh stress hạn tác động tới tất bƣớc trình điều hòa hoạt động gen thực vật, bao gồm: điều hòa trình phiên mã, điều hòa sau phiên mã, điều hòa trình dịch mã, điều hòa sau dịch mã, điều hòa hoạt động gen thông qua phân tử RNA không mã hóa yếu tố di truyền ngoại sinh (ví dụ nhƣ trình methyl hóa DNA hay trình biến đổi histone) 1.3 VAI TRÒ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN Ã TR NG ĐÁP ỨNG STRESS HẠN Trong hệ gen thực vật có khoảng 7% gen mã hóa nhân tố phiên mã (TF), số có nhiều gen liên quan đến đáp ứng chống chịu stress Các TF tham gia mạng lƣới điều hòa hoạt động gen đáp ứng stress hạn biết đƣợc xác định thuộc hầu hết nhóm TF lớn thực vật, đƣợc nghiên cứu nhiều nhóm AP2/ERF, NAC, WRKY, MYB/MYC, bZIP hay ZF 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNxG LÚA CHUYỂN GEN CHỊU HẠN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM Việc phát triển giống lúa chịu hạn giảm lƣợng nƣớc tiêu thụ sản xuất lúa gạo có nghĩa vô c ng to lớn để tăng sản lƣợng đảm bảo an ninh lƣơng thực Một hƣớng nghiên cứu phổ biến đƣợc quan tâm tăng cƣờng biểu gen đáp ứng liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn lúa chuyển gen o chế chống chịu hạn phức tạp thực vật, việc sử dụng gen điều hòa (mã hóa protein tham gia vào mạng lƣới điều hòa đáp ứng stress) nghiên cứu chuyển gen tạo giống lúa chịu hạn thƣờng mang lại hiệu cao so với gen chức (mã hóa protein/enzyme trực tiếp tham gia vào đáp úng chống chịu stress) Tuy nhiên, ch có vài nghiên cứu chứng minh khả chịu hạn dòng lúa chuyển gen điều kiện thử nghiệm đồng ruộng Ở Việt Nam, chƣa có nghiên cứu hoàn ch nh gen liên quan đến đáp ứng chống chịu stress thực vật, đặc biệt nhóm gen mã hoá nhân tố phiên mã liên quan tới tăng cƣờng đáp ứng chống chịu hạn lúa Chƣơng KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 3.1 PHÂN LẬP THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN OSDREB1A/OSDREB2A 3.1.1 Phân lập trình tự mã hóa gen OsDREB1A/OsDREB2A Trình tự mã hóa gen OsDREB1A đƣợc phân lập b ng phản ứng PCR với cặp mồi gen OsDREB1A-Fw/Rv từ DNA hệ gen giống Cƣờm Dạng thƣ viện cDNA xử lý hạn giống lúa Mộc tuyền Trình tự mã hóa s R đƣợc phân lập b ng phản ứng PCR với cặp mồi gen OsDREB2A-Fw/Rv từ khuôn cDNA xử lý hạn giống lúa Cƣờm Dạng Sản phẩm khuếch đại trình tự mã hóa hai gen đƣợc nhân dòng vào vector pUC19 Vector tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E coli chủng H5α, sàng lọc b ng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc màu trắng(hình 3.5) tiếp đƣợc giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger với cặp mồi vector Hình 3.5 | Kết PCR kiểm tra trực tiếp khuẩn lạc mang vector pUC19 tái tổ hợp ên tráii h ợc biến n p vector tái tổ hợ i giế g - 5: sản ph h h n l c biến n p sản ph m ghép n i với o n chèn sản ph m khuế h i trình tự mã hóa OsDREB1A t DNA tổng s gi g ú ờm D ng; (ii) giếng 6-9: sản ph h h n l c biến n p sản ph m ghép n i với o n chèn sản ph m khuế h i trình tự mã hóa OsDREB1A t cDNA xử lý h n gi ng lúa M c Tuyề giế g i chứng âm (không có DNA khuôn) ên ph ii h ợc biến n p vector tái tổ hợp pUC19/OsDREB2A: giế g i chứng âm (không có DNA khuôn); 12-15: sản ph h h n l c biến n p sản ph m ghép n i pUC19 sản ph m khuế h i trình tự mã hóa OsDREB2A t cDNA gi g ú ờm D ng Ghi chú: 3.1.2 Thiết kế vector chuyển gen Trình tự mã hoá OsDREB1A/OsDREB2A vector pUC19 vector chuyển gen pBIG - Lip9/Ubi đƣợc cắt xử lý b ng enzyme giới hạn BamHI, đƣợc ghép nối b ng enzyme T4 ligase theo quy trình giản lƣợc hình 2.2 Vector pBIG-Lip9/Ubi tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E coli chủng DH5α, sử dụng phƣơng pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc để sàng lọc thể tái tổ hợp trình tự mã hóa n m chiều với promoter điều khiển cấu trúc chuyển gen (hình 3.10) Hình 3.10 | Điện i sản phẩm PCR khuẩn lạc gel agarose 1% i- Sản ph m PCR t khu n l c mang pBIG-Lip9-OsDREB1A Giếng M: Thang chu n DNA 1kb; giếng 1, 2: khu n l c 2; giế g i chứng âm B- Sản ph m PCR t khu n l c mang pBIG-Lip9-OsDREB2A Giếng M: Thang chu n DNA 1kb; giế g i chứng âm; giếng 2-5: khu n l c 1-4 NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CHUYỂN G N VÀ 3.2 GIỐNG LÚ Ở VIỆT N 3.2.1 Khả hình th nh callus tập đo n giống lúa Việt Nam Sử dụng 03 loại môi trƣờng MS (nồng độ 2,4D từ 1,5 mg/l đến 2,5 mg/l) để khảo sát khả tạo callus 47 giống lúa Việt Nam nhận thấy có 26 giống có khả tạo callus tốt Trong đó, có 05 giống bao gồm giống 20, 26, 34, 44 47 có tiềm tạo callus cao Cụ thể với giống 20 môi trƣờng có bổ sung 1,5mg/l 2,4 (môi trƣờng S1) cho tỷ lệ tạo callus cao (78,49%) môi trƣờng có bổ sung 2mg/l 2,4 ( môi trƣờng S2) thích hợp cho hình thành callus giống lúa 26, 34, 44 47 (tƣơng ứng 84,94, 76,53%, 79,61% 90,06%) 3.2.2 Khả tái sinh tập đo n giống lúa Việt Nam 26 giống lúa có khả tạo callus tốt mục 3.2.1 đƣợc nghiên cứu đánh giá khả tái sinh chồi từ callus 04 loại môi trƣờng MS có bổ sung BAP kinetin Kết khảo sát cho thấy, có 05 giống bao gồm YUNLU103-1 , giống LUYIN46, LP5M, IR80416-B-152-4 Chành trụi có khả tạo callus tốt đƣợc lựa chọn tiếp tục nghiên cứu đánh giá khả tiếp nhận gen hoàn thiện quy trình chuyển gen 3.2.3 Khảo sát khả tiếp nhận gen giống lúa Việt Nam Bảng 3.5 | tiếp nhận gen giống lúa Việt Nam YUNLU10 Ch nh trụi 3-1B LUYIN46 Qui trình IR80416-B152-4 LP-5M Chọn lọc 50 ± 2,04 20,33± 1,67 15,53± 1,78 19,39± 1,57 21,53± 1,98 Chọn lọc 38 ± 1,53 5,26± 1,01 2,34± 0,67 4,33± 0,51 6,21± 0,62 Tái sinh 27,67± 1,62 0 0 PCR 17,33± 1,12 Chọn lọc 55,05± 1,94 20,13± 1,94 10,53± 1,94 17,32± 1,94 11,06± 1,94 Rahman Chọn lọc 15,12± 1,94 7,05± 1,94 (2011) Tái sinh Phòng Bệnh học phân tử 1,12± 1,94 3,54± 1,94 4,57± 1,94 PCR Chọn lọc 40 20,33 15,53 19,39 9,34 Hiei Chọn lọc 15,24 5,19 4,31 8,03 3,47 (2008) Tái sinh 0 0 PCR 05 giống có khả tạo callus tái sinh tạo chồi tốt đƣợc nghiên cứu đánh giá khả tiếp nhận gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens với 03 quy trình khác (Bảng 3.5) bao gồm: 01 quy trình phát triển tác giả 01 quy trình cho lúa japonica (Hiei, 2008) 01 quy trình cho lúa india (Rahman, 2011) ết nghiên cứu cho thấy ch có giống Chành Trụi có khả tiếp nhận gen lạ thông qua vi khuẩn A tumefaciens sử dụng quy trình đƣợc phát triển nghiên cứu sinh (Hình 3.15) Hình 3.15 | Quy trình chuyển gen Ch nh trụi môi trƣờng MS Q y ì h ợc thiết lập cho gi ng Chành trụi t i hó thời gian t g b ớc, nồ g chất bổ sung, nhiệ Chú ý nồ g vi khu ef ie ã i 600 = 0,03, sử dụng vi khu n nồ g o hơ ,5 h t s nghiên ó ó h gây giảm hiệu củ i ờng chọn lọ b ớc rễ (7) có th sử dụ g i ờng MS giảm m t nửa nồ g (MS/2) giúp rễ xuất sớm (rễ mảnh phân chia nhiề hơ , y hiê b ớc (8) cầ hú ý hi ây v o ù hè hó i o m nhiệ ) Cây sau h ới 03 tuần ợc thu mẫu lá, tách DNA tổng s sàng lọc bằ g x ịnh ây d g í h MS: i ờng Murashige and Skoog 3.3 TẠO GIỐNG LÚA CHÀNH TRỤI CHUYỂN GEN Các cấu trúc p IG-Lip9:OsDREB1A, pBIG-Ubi:OsDREB1A, pBIG-Lip9:OsDREB2A pBIG-Ubi: s R , vector trống p IG- Lip9 pBIG-Ubi đƣợc biến nạp vào giống lúa Chành trụi theo quy trình giản lƣợc hình 3, kết từ 600 callus ban đầu thu đƣợc 99 chồi tái sinh ết theo dõi chuyển gen sử dụng phƣơng pháp PCR, qRT- PCR với mồi đặc hiệu gen mồi vector xác định đƣợc 44 dòng chuyển gen copy ch có 10 dòng cho hạt ( ảng 3.7) Bảng 3.1 | Kết kiểm tra chuyển gen T0 Cấu trúc gen chuyển Tái sinh PCR ƣơng tính Lip9: OsDREB2A 15 12 Ubi: OsDREB2A 12 10 Lip9: OsDREB1A 23 19 13 Ubi: OsDREB1A 20 15 11 pBIG-Lip9 16 10 5 pBIG-Ubi 13 Tổng 99 75 44 31 Số copy qRT-PCR copy > copy Tiếp tục đánh giá chuyển gen T1 b ng kỹ thuật qRT-PCR, nảy mầm Hygromycin lựa chọn đƣợc dòng chuyển gen đồng hợp copy để tiếp tục theo dõi đánh giá khả chịu hạn hệ Tuy nhiên số có 03 dòng L4, U2 U3 không cho hạt T2 nên ch 06 dòng đƣợc tiếp tục nghiên cứu thí nghiệm đánh giá kiểu hình ( ảng 3.10) Bảng 3.2 | Kết sinh trƣởng òng chuyển gen đồng hợp Số Sinh trƣởng bình thƣờng Trổ Kết hạt Thu hạt T2 L1 2 1 L2 2 1 L3 2 2 L4 L5 1 1 Ubi: U1 2 2 OsDREB1A U2 Cấu trúc gen Lip9: OsDREB1A Tổng U3 1 U4 2 2 17 12 11 9 3.4 ĐÁNH GIÁ IỂU HÌNH C Y CHUYỂN GEN Các chuyển gen T2 đƣợc nghiên cứu đánh giá kiểu hình so sánh với đối chứng điều kiện hạn điều kiện hạn Kết so sánh đánh giá điều kiện bình thƣờng có 04 dòng chuyển gen copy có kiểu hình tƣơng đồng với đối chứng không chuyển gen (Bảng 3.11) Bảng 3.3 | Một số tiêu sinh trƣởng chuyển gen đối chứng Chỉ tiêu sinh trƣởng Lƣợng hạt Chiều cao (cm) Cây Số nhánh/ khóm Cây đối chứng 5,02 ± 1,21 110,65 ± 3,51 110 ± 3,5 110 ± L1 4,51 ± 1,09 90,12 ± 1,56 100 ± 1,2 105 ± L2 4,49 ± 0,82 115,68 ± 2,02 100 ± 3,5 116 ± L3 5,12 ± 0,89 105,79 ± 2,50 115 ± 2,5 107 ± L5 5,09± 0,95 108,54 ± 1,59 116 ± 1,8 106 ± U1 4,99 ± 0,32 105,12 ± 2,01 107± 3,5 106 ± U4 5,16 ± 0,98 112,46 ±1,58 109± 2,5 108 ± Thời gian sinh trƣởng (ngày) Khả giữ nƣớc ch tiêu quan trọng để đánh giá tính chịu hạn thực vật khả phụ thuộc vào đặc tính nhƣ: cuộn lá, đóng mở khí khổng, tham gia chế giảm áp suất trƣơng lá, giảm lƣợng nƣớc bị hoạt hoá biểu hàng loạt gen liên quan đến tính chịu hạn Trong thí nghiệm chúng tôi, mặc d gen điều khiển chịu hạn đƣợc xác định tồn biểu tốt chuyển gen Tuy nhiên, nghiên cứu khả giữ nƣớc cho kết có khác biệt chuyển gen đối chứng không chuyển gen (Bảng 3.12) Bảng 3.4 | Khả giữ nƣớc òng lúa chuyển gen Độ hụt khối lƣợng tƣơng đối (%) Tỷ lệ sống sót Sau Sau Sau 7giờ (%) Cây đối chứng 10,00 ± 0,25 14,55 ± 0,45 30,55 ± 0,36 30,55 ± 0,36 L3 9,67 ± 0,36 14,01 ± 0,56 27,08 ± 0,52 80,08 ± 0,52 L5 8,67 ± 0,32 13,98 ± 0,49 26,57 ± 0,78 90,57 ± 0,78 U1 9,67 ± 0,23 14,01 ± 0, 32 28,45 ± 0,62 78,45 ± 0,62 U4 8,99 ± 0,36 13,95 ± 0,28 27,45 ± 0,54 83,45 ± 0,54 Hình 3.20 | Khả giữ nƣớc òng lúa chuyển gen Ngƣợc lại thí nghiệm đánh giá khả phục hồi cho thấy có khác biệt lớn chuyển gen đối chứng Các sau thí nghiệm đánh giá khả giữ nƣớc đƣợc trồng trở lại điều kiện bình thƣờng, khả phục hồi đƣợc ghi nhận ngày thứ Kết cho thấy đối chứng phát triển yếu xuất vàng xoăn; chuyển gen phát triển khỏe mạnh bình thƣờng xanh khỏe mạnh Tỷ lệ sống sót đối chứng dòng chuyển gen có khác biệt lớn đối chứng ch sống sót có 30,55% dòng chuyển gen có tỷ lệ sống sót cao từ 78,45 – 90,57% Kết cho thấy chuyển gen OsDREB1A có khả phục hồi tốt sau trình nƣớc (Hình 3.20) Bảng 3.5 | Khả phục hồi v kết hạt òng lúa chuyển gen sau xử lý hạn Đối chứng Xử Số sống lý Sinh trƣởng hạn Kết hạt tuần 0/30 Xử Số sống lý Sinh trƣởng hạn Kết hạt tuần 0/30 Thu hạt Thu hạt L3 L5 U1 U4 7/30 (23,3%) 9/30 (30%) 6/30 (20%) 7/30 (23,3%) - 7/30 (23,3%) 9/30 (30%) 6/30 (20%) 7/30 (23,3%) - 7/30 (23,3%) 9/30 (30%) 6/30 (20%) 7/30 (23,3%) - 5/7 (71,43%) 6/9 (66,67%) 4/6 66,67%) 5/7 (71,43%) 0/30 4/30 (13,33%) 0/30 0/30 - - 4/30 (13,33%) - - - - 4/30 (13,33%) - - - - 2/30 (6,67%) - - Các dòng chuyển gen đồng hợp tử hệ T2 sinh trƣởng gần tƣơng đƣơng với đối chứng đƣợc tiến hành kiểm tra khả chịu hạn khả tạo hạt sau xử l hạn ết kiểm nghiệm cho thấy đối chứng gần nhƣ khả phục hồi sau tuần ngừng tƣới, tỷ lệ chồi sinh thấp khả tạo hạt; dòng chuyển gen có khả phục hồi từ 20 – 30% có dòng L5 có khả phục hồi cao (30%), dòng chuyển gen dƣới điều khiển promoter Lip9 có phục hồi cao dòng chuyển gen dƣới điều khiển promoter Ubiquitin (Ngƣợc lại thí nghiệm đánh giá khả phục hồi cho thấy có khác biệt lớn chuyển gen đối chứng Các sau thí nghiệm đánh giá khả giữ nƣớc đƣợc trồng trở lại điều kiện bình thƣờng, khả phục hồi đƣợc ghi nhận ngày thứ ết cho thấy đối chứng phát triển yếu xuất vàng xoăn; chuyển gen phát triển khỏe mạnh bình thƣờng xanh khỏe mạnh Tỷ lệ sống sót đối chứng dòng chuyển gen có khác biệt lớn đối chứng ch sống sót có 30,55% dòng chuyển gen có tỷ lệ sống sót cao từ 78,45 – 90,57% ết cho thấy chuyển gen OsDREB1A có khả phục hồi tốt sau trình nƣớc (Hình 3.20) ảng 3.5) Sau đánh giá khả chịu hạn dòng tiếp tục đƣợc trồng điều kiện bình thƣờng nhà lƣới, kết cho thấy dòng chuyển gen có khả phục hồi tốt, sinh trƣởng gần nhƣ bình thƣờng tƣợng bị vàng bị cháy ít, dòng hoa kết bình thƣờng Tỷ lệ hạt ch đạt từ 66,67% đến 71,43%, điều cho thấy hạn có khả ảnh hƣởng lớn đến suất trồng - Hình 3.21 | Khả phục hồi, tạo hạt òng T2 chuyển gen xử lý hạn tuần Ghi chú: 1: Cây đối chứng; 1: Dòng L3; 3: Dòng L5; 4: Dòng U1; 5: Dòng U4 Các hệ T3 dòng chuyển gen U1, U4, L3 L5 đƣợc gieo điều kiện nhà lƣới, tiến hành xử lý hạn giai đoạn mạ để đánh giá mức độ biểu gen quan tâm hai điều kiện xử lý hạn 48h không xử lý hạn Kết nghiên cứu biểu OsDREB1A không chuyển gen, chuyển gen điều kiện thƣờng điều kiện hạn b ng kỹ thuật RT-PCR sử dụng hai cặp mồi OsDREB1A-RT-Fw/Rv mồi Actin-Fw/Rv (sử dụng để nội chuẩn mức độ biểu OsDREB1A tất điều kiện) đƣợc biểu đồ hóa Hình Kết đánh giá cho thấy OsDREB1A biểu thấp Chành trụi không chuyển gen dòng chuyển gen L3 L5 điều kiện không xử lý hạn ngƣợc lại với thuộc dòng U1 U4 gen có mức độ biểu cao đáng kể (LogFC2 >2) Điều chứng tỏ với Chành Trụi OsDREB1A mức biểu cao mặc d giống lúa nƣơng dƣới điều khiển promoter Lip9 gen có mức biểu tƣơng đƣơng không chuyển gen điều kiện bình thƣờng Ngƣợc lại, dƣới điều khiển promoter liên tục gen có mức độ biểu mạnh (Hình 3.22) Hình 3.22 | Nghiên cứu mức độ biểu OsDREB1A chuyển gen T3 KẾT LUẬN Luận án phân lập đƣợc trình tự mã hóa OsDREB1A từ DNA tổng số giống Cƣờm dạng cDNA giống Mộc Tuyền trình tự mã hóa OsDREB2A từ cDNA giống Cƣờm dạng Đã nhân dòng thành công hai trình tự mã hóa riêng rẽ vào vector pUC19 Kết giải trình tự sau cho thấy hai trình tự mã hóa nhân tố phiên mã hai giống lúa Việt Nam có trình tự kích thƣớc (720 bp 825 bp) tƣơng đồng với hai gen tƣơng ứng ngân hàng gen giới OsDREB1A (AF300970) OsDREB2A (AM495895) giống Nipponbare Hai trình tự sau đƣợc đƣa thành công cách riêng rẽ vào hai hệ vector pBIG/Ubi (promoter Ubiquitine - nguốc gốc từ ngô, promoter biểu liên tục) pBIG/Lip (promoter Lip9 - nguồn gốc từ lúa, promoter cảm ứng hạn) để tạo 04 vector biểu (binary vector): Ubi:OsDREB1A, Ubi:OsDREB2A, Lip9:OsDREB1A Lip9:OsDREB2A làm vật liệu phục vụ công tác tạo giống trồng chịu hạn theo định hƣớng chuyển gen Luận án thành công bƣớc đầu việc đánh giá khả phát sinh callus (trên 04 môi trƣờng MS có bổ sung 2,4D nồng độ từ 1,5 – 2,5 mg/l) 47 giống lúa nƣơng Việt Nam khả tái sinh chồi từ callus (trên 04 môi trƣờng MS bổ sung BAP kinetine có nồng độ khác từ 0,5 – mg/l) 26 giống lúa nƣơng Việt Nam có khả tạo callus 50% Kết cụ thể cho thấy, tập đoàn 47 giống lúa nƣơng khảo sát có khả tạo calus không cao, ch có 05 giống lúa có khả tạo callus 75% (giống LP-5 môi trƣờng MS + 1,5 mg/l 2,4D, giống IR80416-B-152-4, YUNLU103-1B Nếp môi trƣờng hau Để Dỏn S + mg/l 2,4 , đặc biệt có giống Chành Trụi có khả tạo callus lớn 80% môi trƣờng MS bổ sung 2,4D) Khả tái sinh chồi từ callus giống lúa nƣơng khảo sát luận án không cao, khó phát triển quy trình chuyển gen cho giống lúa Ch có 05/26 giống lúa (LUYIN46, IR80416-B-152-4, LHY-4, YUNLU1031B Chành Trụi) có khả tái sinh chồi từ callus đạt 70% môi trƣờng tái sinh TS2 (MS + 2mg/l BAP + 0,5mg/l kinetine) Luận án thành công việc thiết lập quy trình chuyển gen cho giống lúa Chành Trụi giống lúa nƣơng địa phƣơng Việt Nam kết chuyển gen thành công cho giống lúa địa Việt Nam đƣợc công bố Luận án thành công việc biến nạp 04 vector biểu Ubi:OsDREB1A, Ubi:OsDREB2A, Lip9:OsDREB1A Lip9:OsDREB2A vào giống lúa Chành Trụi Tỷ lệ chuyển gen giống Chành Trụi dao động từ 9% đến 15%, trung bình 10% Luận án lần áp dụng thành công kỹ thuật PCR định lƣợng (qRT-PCR) Việt Nam để thay cho: kỹ thuật lai Southern Blotting việc ƣớc tính số lƣợng cấu trúc chuyển gen chuyển gen hệ T0, T1; t lệ nảy mầm môi trƣờng Hygromycin để xác định chuyển gen T1 đồng hợp Luận án thành công việc sàng lọc đƣợc 04 dòng Chành Trụi (Lip9:OsDREB1A) sao, đồng hợp hệ T2 có kiểu hình (chiều cao cây, số nhánh, thời gian sinh trƣởng…) tƣơng đồng với đối chứng không chuyển gen điều kiện thông thƣờng 100% có khả phục hồi, kết hạt (tỷ lệ hạt đạt 40-60%) sau 03 tuần ngừng cung cấp nƣớc Luận án thành công việc sử dụng PCR định lƣợng bán định lƣợng cho gen chuyển (OsDREB1A) gen ch thị khả chịu hạn Dehydration-Induced Protein (DIP)/Salt-induced protein (SALT) chuyển gen T2 Kết cho thấy gen chuyển gen ch thị ch đƣợc tăng cƣờng biểu điều kiện gây hạn nhân tạo so với đối chứng (Fold change-FC: 2,5-3,3) KIẾN NGHỊ Dựa kết luận rút từ kết nghiên cứu đây, đƣa số hƣớng nghiên cứu nhƣ sau: - Tiếp tục nghiên cứu khả trì tính ổn định hệ T3, T4… 04 dòng chuyển gen Chành Trụi tạo nghiên cứu hệ (tính bền vững di truyền, khả trì tính chống chịu, suất…) - Mở rộng nghiên cứu chuyển gen OsDREB2A vào đối tƣợng trồng khác với promoter điều khiển hoạt động cảm ứng điều kiện stress để phục vụ công tác chọn tạo giống DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Cao Lệ Quyên, Phạm Thị Vân, Phạm uân Hội (2011), “Nghiên cứu khả tạo callus tái sinh từ số giống lúa nƣơng Việt Nam nhập nội phục vụ cho công tác chuyển gen”, hí Si h họ , 33(1), tr 80-85 Cao Lệ Quyên, Trần Tuấn Tú, Phạm Thị Vân, Phạm uân Hội (2012), “Thiết kế vector chuyển gen điều khiển OsDREB1A có tiềm tăng cƣờng khả chịu điều kiện bất lợi”, hí g ghệ Si h họ , 10(2), tr 271-279 Cao Lệ Quyên, Trần Tuấn Tú, Đinh Đoàn Long, Phạm uân Hội (2016), “Nghiên cứu chuyển gen nhân tố phiên mã MtOsDREB1A liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa Việt Nam” 19 hí N g ghiệ v h i N g h , 8, tr 13- ... hoàn ch nh phân lập gen liên quan đến đáp ứng chống chịu hạn thực vật Từ đó, đề xuất tiến hành thực đề tài: Nghiên cứu phân lập chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa Việt Nam với... khiển thay vài trăm gen chức vào để tăng cƣờng tính chống chịu trồng Chính lí mà nghiên cứu phân lập, đặc tính hoá gen điều khiển liên quan đến tính chịu hạn trở thành định hƣớng nghiên cứu đầy... tạo giống chịu hạn Ở Việt Nam, khoảng 10 năm trở lại đây, nghiên cứu phân lập gen chịu hạn tạo giống trồng chống chịu hạn b ng công nghệ chuyển gen thực vật bắt đầu đƣợc số phòng thí nghiệm quan