Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật di truyền phân tử để xác định gen liên quan đến tính trạng sinh sản của lợn tại Việt nam. Lê Thị Thuý , Phạm Doãn Lân, Nguyễn Văn Hậu, Trần Thu Thuỷ, Lu Quang Minh, Nguyễn Đăng Vang 1. Đặt vấn đề Hiệu quả của chăn nuôi lợn phụ thuộc rất nhiều vào khả năng sinh sản, đặc biệt là số lứa đẻ và số con trên 1 lứa đẻ. Trong hơn 40 năm qua, bằng rất nhiều các biện pháp nh thay đổi điều kiện chăm sóc nuôi dỡng, sử dụng các dòng mẹ cao sản thông qua sự lai tạo đ cải tiến và nâng cao số con trên một lứa đẻ trong các giống lợn trên thế giới. Tuy nhiên sự đáp ứng chọn lọc tính trạng này trên lợn hết sức biến động (Bolet và CS, 1989), chọn lọc chỉ dựa vào chỉ số tỷ lệ trứng chín và sức sống của phôi (Neal, 1989). Sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử mở ra triển vọng xác định những gen đơn điều khiển tính trạng sinh sản. Gần đây, tổ hợp với sự sai khác di truyền ở locus của gen tiếp nhận oestrogen (ESR) cũng đ đợc khám phá (Rothschild, 1997). Ông cũng phát hiện ra rằng, gen tiếp nhận Oestrogen không những ảnh đến số con sinh ra, số con còn sống/lứa đẻ cũng nh số vú mà còn ảnh h- ởng đến tăng trọng /ngày và độ dày mỡ lng. Bằng kỹ thuật này áp dụng cho công tác chọn giống, trên cơ sở tăng tần số các alen mong muốn đ làm tăng đợc số con/lứa từ 1,25 con lên 1,5 con ở lợn Meishan, lợn Large White ( Rothschild và CS, 1994, 1996 và Short ,CS 1995) với P<0.01. Lợn Bản nuôi tại nuôi tại Sơn la, Hà Giang cho số con đẻ ra rất thấp, chỉ đạt 7 con/lứa, trong khi lợn Móng cái, lợn Lang Hồng có thể cho trung bình đến 11-12 con, có cá thể cho đến 16-18 con/lứa, lơn ỉ đạt 10 con/lứa lợn Landrace, Đại Bạch đạt 8,5-9,5 con/lứa . Đây là sự sai khác rất lớn giữa các giống lợn nuôi tại Viêt nam Mục đích nghiên cứu: * Khảo sát ảnh hởng của locus ESR đến số con /lứa ở giống lợn Móng cái, Lợn ỉ, lợn Bản, HMông, và lợn Landrace, đồng thời theo dõi sự ảnh hởng đến tính trạng này lên tốc độ sinh trởng và tỷ lệ thịt xẻ. So sánh xem những kết quả đ tiến hành trên các giống lợn Meishan, lợn Large White ở nớc ngoài có giống với kết quả trên các giống lợn nuôi tại Việt nam không bằng sự thiết kế phản ứng PCR, cắt đa hình gen Oestrogen, xác định vị trí từng locus, xác định tần số gen và tần số các alen, xác định mối liên hệ giữa chúng đến các tính trạng trên, phục vụ cho công tác chọn giống lợn nâng cao số con/lứa và chất lợng thịt xẻ ở mức phân tử. 2. Các bớc tiến hành 1. Chuẩn hoá phơng pháp, kỹ thuật PCR, RFLPs, tìm ra và phát hiện gen tiếp nhận Oestrogen . 2. Phân tích sự sai khác di truyền về gen tiếp nhận Oestrogen giữa các cá thể và các giống lợn. 3. Nghiên cứu sự ảnh hởng của gen tiếp nhận Oestrogen đến các tính trạng số con trên lứa, tốc độ sinh trởng và tỷ lệ thịt xẻ của lợn. 3. Kết quả và thảo luận. Sau khi cắt sản phẩm PCR đoạn gen tiếp nhận Oestrogen bằng enzym AvaI cho thấy alen A cho 2 băng có kích thớc 109 và 76 bp và alen B cho 3 băng có kích thớc 76, 62 và 47 bp. Trong đó alen A là dạng bình thờng còn alen B là dạng đột biến do nucleotit T chuyển thành C tại vị trí 1665 . Sự thay đổi này sẽ dẫn đến enzym AvaI nhận ra và cắt tại vị trí đó, do vậy từ băng 109 bp sẽ tạo ra hai băng nhỏ là 62 và 47 bp. Nh vậy kiểu gen bình thờng AA chỉ cho 2 băng, kiểu gen AB sẽ cho 4 băng và kiểu gen đột biến BB sẽ cho 3 băng trên điện di. AvaI Allele A 109 bp 76 bp AvaI AvaI Allele B 47 bp 62 bp 76 bp Sơ đồ vị trí cắt của enzym AvaI Tổng số 136 mẫu của 6 giống lợn đợc tiến hành phân tích, trong đó gồm có 5 giống lợn nội và một giống lợn ngoại, kết quả kiểu gen và tần số alen của mỗi giống đợc trình bày trong bảng sau: Tần Giống Tần số kiểu gen AA (%) Tần số kiểu gen AB (%) Tần số kiểu gen BB (%) Tần số allele A ( %) Tần số allele B ( %) Móng cái n=26 0 7.7 92.3 3.85 96.15 Bản (Thái) n=26 0 0 100 0 100 ỉ n=20 0 0 100 0 100 Lang Hồng n=20 5 5 90 5 95 HMông n=20 0 10 90 5 95 Landrace n=24 70.84 29.16 0 85.42 14.58 Từ kết quả trên cho thấy, tần số kiểu gen đột biến BB và tần số alen B ở các giống lợn nội Việt Nam rất cao trong khi ở giống lợn ngoại Landrace lại rất thấp (90, 92,4 và 100% ở lợn Lang Hồng, Móng cái, lợn Bản và lợn ỉ so với 29.16% ở lợn Landrace). Ngợc lại tần số kiểu gen bình thờng AA và alen A rất cao ở lợn Landrace và rất thấp ở lợn Nội (70,84 và 85,42 so với 0 đến 3,85 và 5 %. ở lợn ỉ, Bản , Móng cái và Hmông tơng ứng. Nếu đem so sánh kết quả nghiên cứu này của chúng tôi với kết quả của C. Drogemuler và cộng sự (1997) là tần số alen bình th- ờng A ở các giống lợn ngoại Landrace, Duroc, Yorkshire rất cao, đạt 87% trong khi đó tần số alen đột biến B chỉ có 13%. Kết quả trên cho thấy giữa các giống lợn nội Việt Nam và các giống lợn ngoại có sự sai khác rõ rệt về sự thay đổi trong gen tiếp nhận Oestrogen, đây là một điều cần tiếp tục đuợc nghiên cứu nh sự liên quan của sự thay đổi này với các tính trạng khác nh số con trên ổ, tốc độ tăng trọng giữa các giống lợn nôi và ngoại cũng nh giữa các giống lợn nội với nhau. So sánh tần số kiểu gen và tần số alen giữa các giống lợn nôi, ta cũng thấy có sự khác nhau rõ rệt.Lợn Bản và lợn ỉ, chỉ có một kiểu gen BB với tần số kiểu gen BB và alen B chiếm 100%, không có kiểu gen AA và AB, trong khi đó ở lợn Móng cái và lợn Hmông, có 2 kiểu gen với tần số kiều gen AB và BB tơng ứng là 7.7 và 10%; 92,3 và 90%. Lợn Lang hồng có cả 3 kiểu gen: AA chiếm : 5 %, AB: 5% và BB: 90% Điều này cứng tỏ tính đồng nhất ở lợn ỉ và lợn Bản cao, còn lợn Móng cái, Lang hồng và cả lợn Hmông đ có sự thay đổi vể tần số kiểu gen và alen, có sự biến đổi di truyền trong quá trình chọn lọc tự nhiên và nhân tạo. Sự phát hiện này hết sức lý thú và quan trọng trong việc tìm hiểu sàng lọc các đoạn gen liên quan đến các tính trạng kinh tế quan trọng, đồng thời xác định đ- ợc tính đồng nhất trong quần thể của giống. 4. Kết luận * Bớc đầu phát hiện sự sai khác di truyền kiểu gen tiếp nhận Oestrogen giữa các giống lợn. Có 3 kiểu gen AA, AB và BB trong đó kiểu gen bình thờng AA ở lợn ngoại, còn kiểu gen đột biến BB chiếm chủ yéu ở các giống lợn nội. * Lơn ỉ, lợn Bản, chỉ có 1 kiểu gen BB. Với tần só kiều gen BB và alen B chiếm tỷ lệ tơng ứng là 100% * Lợn Móng cái có 2 kiểu gen: AB và BB trong đó AA có 7,7% và BB chiếm tới 92,3%, tơng ứng với tần số alen A và B : 3,85% và 96,15%. * Lợn Lang hồng có cả 3 kiểu gen: AA, AB và BB với tần số kiểu gen tơng ứng là: 5%, 5% và 90%. Tần số alen: A và B tơng ứng là 5% và 95% * Lơn Landrace chỉ có 2 kiểu gen: AA và AB nhng ngợc lại với lợn nội, tần số kiẻu gen AA rất trội chiếm 70,84 % và AB chiếm 29,16%. Tần số alen A và B tơng ứng 85,42% và 14,58%. - Có sự sai khác rất đáng kể về kiểu gen, tần số kiểu gen và alen giữa các giống lợn truyền thống của Việt nam và lơn cao sản nhập nội Landrace. Điều này liên quan đén các tính trạng hoàn toàn khác nhau về số con sinh ra trên lứa đẻ, năng suất và chất lợng thịt giữa các giống và cần phải tiếp tục các nghiên cứu tiếp theo. Summary Study on application of the molecular genetic techniques to determine polymorphism of gene related to reproduction trait of pig breeds in Vietnam. 136 DNA tisues samples from five Vietnamese native pig breeds : Mong Cai, Lang hong, Ban, Hmong, I and one from exotic pig breed: Landrace in Vietnam were used in this study. All animals are unrelated Primer ESR3 and ESR4 were used.in PCR reaction for detecting Oestrogen receptor gene genotypes (ESR) The amplified flagment was digested with AvaI estriction enzyme. Electrophoresis was performed at constant voltage of 80 volts for 2 hours in 4%Agarose The gel were stained with Ethidium Bromide and photographed. DNA marker number 10 (M) is 0.2 àl of pBR322/MspI digested. Length of marker flagments are shown on the wing side. After digestion PCR products with AvaI enzyme, the amplified DNA segments (ESR-region) showed two alleles:from different bands: alleles A has two bands: 109 and 76 bp, alleles B has three bands with diffrerent flagments: 76 bp, 62 bp and 47 bp. In which alleles A is norman type and B was transform suddenly rerulting from mutation nucleotide T to C at 1665 position. Rerults from digestion of the amplified DNA segments of Oestrogen receptor gene with enzyme AvaI were shown two alleles: A and B resulting 3 genotypes: AA, AB and BB . Polymorphic restriction sites for identified at the AvaI position, alleles B and genotyes BB were dominant in the native pig breeds ranging from 90% to 100% On the contrary allele and genotype A and AA were dominant in Landrace pig ranging from 85.42% to 70.84% In the results showed that: * I and Ban pig breeds has only one genotype with frequency of allele and genotype frequency were 100%. *Mong cai pig has two genotypes: AB and BB in which AA genotype frequency occupied 7.7% and BB was 92.3 %. *Lang Hong pig has three genotypes: AA, AB and BB and genotype frequency were: 5%, 5% and 90% respectively. * Landrace pig has two genotypes: AA and AB with dominat in AA genotype: 70.84% and AB genotype occupied only 29.16% There was very different from alleles and genotypes between native and exotic pig breeds in Vietnam. This is very interesting rerults. Further research should be analysed in allele frequencies, the relationship between them, develop homozygous and sequencing and apply in improvement in a breeding progamme. . Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật di truyền phân tử để xác định gen liên quan đến tính trạng sinh sản của lợn tại Việt nam. Lê Thị Thuý , Phạm Doãn Lân, Nguyễn Văn Hậu, Trần Thu Thuỷ, Lu Quang. sức sống của phôi (Neal, 1989). Sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử mở ra triển vọng xác định những gen đơn điều khiển tính trạng sinh sản. Gần đây, tổ hợp với sự sai khác di truyền. hiện gen tiếp nhận Oestrogen . 2. Phân tích sự sai khác di truyền về gen tiếp nhận Oestrogen giữa các cá thể và các giống lợn. 3. Nghiên cứu sự ảnh hởng của gen tiếp nhận Oestrogen đến