Nghiên cứu và ứng dụng khả năng phân hủy thuốc trừ cỏ glyphosate bởi một số loài nấm mùn trắng

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TPHCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG KHẢ NĂNG PHÂN HỦY THUỐC TRỪ CỎ GLYPHOSATE BỞI MỘT SỐ LOÀI NẤM MÙN TRẮNG Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TPHCM Chủ nhiệm nhiệm vụ : LƯƠNG BẢO UYÊN Thành phố Hồ Chí Minh - 2018 ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TPHCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG KHẢ NĂNG PHÂN HỦY THUỐC TRỪ CỎ GLYPHOSATE BỞI MỘT SỐ LOÀI NẤM MÙN TRẮNG (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày 17/05/2018) Chủ nhiệm nhiệm vụ: Lương Bảo Uyên Cơ quan chủ trì nhiệm vụ Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TPHCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc TpHCM, ngày 30 tháng 05 năm 2018 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN I THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Nghiên cứu ứng dụng khả phân hủy thuốc trừ cỏ glyphosate số loài nấm mùn trắng Thuộc: Chương trình/lĩnh vực (tên chương trình/lĩnh vực): Nông nghiệp Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: LƯƠNG BẢO UYÊN Ngày, tháng, năm sinh: 01/06/1976 Nam/ Nữ: Nữ Học hàm, học vị: Tiến sĩ Chức danh khoa học: Chức vụ: Giảng viên Điện thoại: Tổ chức: 38 300 560 Nhà riêng: Mobile: 0909 278 443 Fax: E-mail: lbuyen@hcmus.edu.vn Tên tổ chức công tác: Khoa Sinh – Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-TPHCM Địa tổ chức : 227 Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, TpHCM Địa nhà riêng: 454 Võ Văn Kiệt, P Cô Giang, Quận 1, TpHCM Tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-TPHCM Điện thoại: 08 - 38 300 560 Fax: 08- 38 350 096 E-mail: Website: https://www.hcmus.edu.vn/ Địa chỉ: 227 Nguyễn Văn Cừ, P.4, Q.5, Tp Hồ Chí Minh Họ tên thủ trưởng tổ chức: TRẦN LINH THƯỚC Số tài khoản: 3713.1.1056908 Kho bạc: Kho bạc Nhà nước Quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh Tên quan chủ quản đề tài: Đại học Quốc gia TpHCM II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 12/ năm 2015 đến tháng 12/ năm 2017 - Thực tế thực hiện: từ tháng 12/ năm 2015 đến tháng 04/ năm 2018 - Được gia hạn (nếu có): - Lần từ tháng 01 năm 2018 đến tháng 06 năm 2018 - Lần … Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 570 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học: 570 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Số TT Thực tế đạt Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 12/2015 280 2016 223 Theo kế hoạch Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) 12/2015 280 2016 223 Ghi (Số đề nghị toán) 1 c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đối với đề tài: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Trả công lao động (khoa học, phổ thông) Nguyên, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng Theo kế hoạch Tổng NSKH Thực tế đạt Nguồn khác Tổng NSKH 177,635 177,635 177,635 177,635 268,675 268,675 268,675 268,675 56,71895 56,71895 56,71895 56,71895 503,02895 503,02895 503,02895 503,02895 Nguồn khác - Lý thay đổi (nếu có): Đối với dự án: Đơn vị tính: Triệu đồng Số TT Nội dung khoản chi Thiết bị, máy móc mua Nhà xưởng xây dựng mới, cải tạo Kinh phí hỗ trợ cơng nghệ Chi phí lao động Nguyên vật liệu, Theo kế hoạch Tổng NSKH Nguồn khác Thực tế đạt Tổng NSKH Nguồn khác lượng Thuê thiết bị, nhà xưởng Khác Tổng cộng - Lý thay đổi (nếu có): Các văn hành q trình thực đề tài/dự án: (Liệt kê định, văn quan quản lý từ cơng đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực có); văn tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh có) Số TT Số, thời gian ban hành văn Tên văn Ghi 159/2015/HĐSKHCN Hợp đồng khoán nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ 101/2017/PLHĐSKHCN 1099/QĐ-SKHCN, ngày 9/12/2015 263/TB- SKHCN ngày 10/11/2015 Phụ lục hợp đồng khoán nghiên cứu khoa học phát triển công nghệ Quyết định việc phê duyệt đề tài nghiên cứu khoa học phát triển cơng nghệ Thơng báo cấp kinh phí đợt Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Tên tổ chức tham gia thực Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, không 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh GS.TS.Nguyễn Thơ Tên cá nhân Nội dung tham gia tham gia thực Lương Bảo Uyên Cố vấn phương pháp thử nghiệm khả phân hủy glyphosate đất ThS Trần ThS Trần Đăng Chọn chủng nấm, Đăng Khoa Khoa xác định thành phần mơi trường, tìm điều kiện để nấm phân hủy glyphosate tốt HVCH Lê Hoài HVCH Lê Hoài Xác định thành phần Diễm Phương Diễm Phương môi trường nuôi cấy nấm, tìm điều kiện in vitro để nấm phân hủy glyphosate tốt Sản phẩm chủ yếu đạt Mơ hình biobed Chủng nấm có khả phân hủy glyphosate Chế phẩm vi sinh có hoạt tính Lac (tối thiểu 450 U/L) MnP (tối Ghi chú* HVCH Nguyễn Hồ Thế Vinh HVCH Nguyễn Hồ Thế Vinh ThS.Lê Trường Bình HVCH Nguyễn Hồ Thế Vinh ThS Lâm Văn Hà HVCH Nguyễn Minh Quang Thử nghiệm nghiệm thức qui mơ phịng thí nghiệm Thử nghiệm nghiệm thức qui mơ phịng thí nghiệm thành nghiệm thức hỗn hợp vi sinh (biobed mix) ô sinh học Ứng dụng hỗn hợp sinh học có hoạt tính enzyme để phân hủy thuốc trừ cỏ glyphosate ngồi vườn thiểu 50 U/L) Nghiệm thức hỗn hợp vi sinh Hiệu nghiệm thức hỗn hợp vi sinh phân hủy glyphosate Mơ hình biobed - Lý thay đổi ( có): Tình hình hợp tác quốc tế: Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Theo kế hoạch Số (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa TT điểm ) Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tóm tắt nội dung, công việc chủ yếu: (Nêu mục 15 thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngồi) Số TT Các nội dung, cơng việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) Tuyển chọn chủng nấm có khả phân hủy glyphosate từ chủng Xác định thành phần môi trường nuôi cấy cho nấm mùn trắng sinh tổng hợp enzyme tốt Thời gian (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Theo kế Thực tế hoạch đạt 12/2015 – 12/2015 4/2016 – 4/2016 5/2016 – 10/2016 5/2016 – 10/2016 Người, quan thực Lương Bảo Uyên Trần Đăng Khoa Lương Bảo Uyên Trần Đăng Khoa Lê Hoài Diễm Phương Tìm điều kiện in vitro để nấm phân hủy glyphosate tốt 11/2016 – 11/2016 2/2017 – 2/2017 Lương Bảo Uyên Trần Đăng Khoa Thử nghiệm nghiệm thức qui mơ phịng thí nghiệm thành nghiệm thức hỗn hợp vi sinh (biobed mix) ô sinh học Ứng dụng hỗn hợp sinh học có hoạt tính enzyme để phân hủy thuốc trừ cỏ glyphosate lấy từ vườn bị nhiễm loại thuốc trừ sâu 3/2017 – 5/2017 3/2017 – 10/2017 Lương Bảo Uyên Nguyễn Minh Quang Nguyễn Hồ Thế Vinh 6/2017 – 12/2017 11/2017 – 3/2018 Lương Bảo Uyên Nguyễn Hồ Thế Vinh - Lý thay đổi (nếu có): III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ Sản phẩm KH&CN tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I: Số TT Tên sản phẩm tiêu chất lượng chủ yếu Chủng nấm có khả chịu nồng độ glyphosate môi trường nuôi cấy tối thiểu 4000 ppm Chế phẩm vi sinh có hoạt tính MnP tối thiểu 50 U/L laccase tối thiểu 450 U/L Mơ hình sinh học phân hủy 25 ppm glyphosate từ nguồn nước thu từ vườn Theo kế hoạch Thực tế đạt lít 2 Mơ hình 1 Đơn vị đo Chủng Số lượng - Lý thay đổi (nếu có): b) Sản phẩm Dạng II: Số TT Tên sản phẩm Báo cáo khoa học đề tài Bài báo tạp chí chuyên ngành Đào tạo cử nhân Đào tạo thạc sĩ Yêu cầu khoa học cần đạt Theo kế hoạch Thực tế đạt 2 2 2 Ghi - Lý thay đổi (nếu có): c) Sản phẩm Dạng III: Số TT Tên sản phẩm Yêu cầu khoa học cần đạt Theo Thực tế kế hoạch đạt - Lý thay đổi (nếu có): Số lượng, nơi cơng bố (Tạp chí, nhà xuất bản) d) Kết đào tạo: Số TT Cấp đào tạo, Chuyên ngành đào tạo Thạc sỹ Tiến sỹ Số lượng Theo kế Thực tế đạt hoạch 2 0 Ghi (Thời gian kết thúc) - Lý thay đổi (nếu có): đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu cơng nghiệp: Số TT Kết Tên sản phẩm đăng ký Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi (Thời gian kết thúc) - Lý thay đổi (nếu có): e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN ứng dụng vào thực tế Số TT Tên kết ứng dụng Thời gian Địa điểm (Ghi rõ tên, địa nơi ứng dụng) Kết sơ 2 Đánh giá hiệu nhiệm vụ mang lại: a) Hiệu khoa học công nghệ: (Nêu rõ danh mục công nghệ mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công nghệ so với khu vực giới…) Hỗn hợp sinh học (biomixture) ô sinh học với thành phần phế phụ phẩm nông nghiệp phổ biến Việt Nam, mạt dừa Mạt dừa nguồn vật liệu gây ô nhiễm môi trường Bến Tre Vậy, việc sử dụng mạt dừa vừa có ý nghĩa kinh tế vừa giúp giải vấn đề ô nhiễm môi trường Đề tài đưa mơ hình sinh học (biobed) để xử lý tồn dư thuốc bảo vệ thực vật cách hiệu quả, vấn đề ô nhiễm nhiều nước giới quan tâm, có Việt nam, nước có nơng nghiệp ngành kinh tế quan trọng b) Hiệu kinh tế xã hội: (Nêu rõ hiệu làm lợi tính tiền dự kiến nhiệm vụ tạo so với sản phẩm loại thị trường…) Mơ hình sinh học (biobed) vừa có khả xử lý mơi trường tốt vừa mang tính kinh tế (chi phí xây dựng sinh học không cao) hộ nông dân Các mơ hình sinh học sử dụng vườn có sử dụng thuốc bảo vệ thực vật Đặc biệt mơ hình giúp cho vùng đất trồng trọt tạo sản phẩm nông nghiệp đạt chuẩn Global GAP Biobed cổ điển Thụy Điển có thành phần vi sinh vật tự nhiên vùng đất cần “làm sạch” Ngoài biobed thiết kế cách lấy phần diện tích đất trồng trọt biobed dùng để xử lý tồn dư thuốc bảo vệ thực vật bồn chứa dùng để phun vườn câym, đồng ruộng Mơ hình có nhược điểm thiết kế Việt nam là: diện tích đất trồng bị thu hẹp dành cho biobed, thời gian phân hủy phụ thuộc vào hệ vi sinh vật vùng đất Các mơ hình cải tiến biobed số cơng ty khác (ví dụ: Bayer Phytobac) có tính linh động thành phần vi sinh vật chủ yếu sử dụng hệ sinh vật có sẵn đất vùng cần xử lý Mơ hình biobed đề tài có chứa chủng nấm đặc trưng với hệ enzyme ligninase, có khả phân hủy chất bảo vệ thực vật, đặc biệt glyphosate Chủng nấm Phanerochaete chrysosporium sinh trưởng tốt điều kiện nhiệt độ miền Nam Việt nam có khả sinh tổng hợp MnP điều kiện Bên cạnh Phanerochaete chrysosporium có khả chịu nồng độ glyphosate diện môi trường sinh trưởng khoảng 9.000ppm (nồng độ cao nhiều so với nồng độ thực tế bị nhiễm vườn cây) sức sinh trưởng cao, lan tơ tốt Đồng thời mơ hình bổ sung laccase (một enzyme hệ ligninase có khả phân hủy glyphosate) để nâng cao hiệu xử lý Tình hình thực chế độ báo cáo, kiểm tra nhiệm vụ: Số TT Nội dung I II Báo cáo tiến độ Báo cáo giám định Thời gian thực Tháng 18/4/2017 Chọn chủng nấm có khả chịu nồng độ glyphosate môi trường nuôi cấy tối thiểu 4.000 ppm Trần Đăng Khoa Lương Bảo Uyên Nội dung 1: Tuyển chọn chủng nấm có khả phân hủy glyphosate từ chủng: Phanerochate chrysosproium, Pleurotus sp., Ganoderma lucidium, Trametes sp Nội dung 2: Xác định thành phần môi trường nuôi cấy cho nấm mùn trắng sinh tổng hợp enzyme tốt III Nghiệm thu sở Ghi (Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…) Thành phần môi trường điều kiện để nấm mùn trắng sinh tổng hợp enzyme tốt (hoạt tính laccase tối thiểu 450 U/L hoạt tính MnP tối thiểu 50 U/L) Lê Hoài Diễm Phương Lương Bảo Uyên Tháng 4/2018 MnP ổn định hoạt tính 25°C 55°C với giá trị cực đại 35°C Dung dịch đệm sodium acetate pH 4,5 nhiệt độ 35°C dùng để bảo quản MnP thô sau cô đặc tiến hành thực phản ứng phân hủy glyphosate điều kiện Lê Hoài Diễm Phương - Thành phần môi trường rắn nuôi cấy Pleurotus sp để chuyển thành hỗn hợp vi sinh (biobed mix) ô sinh học bao gồm mạt dừa, bột bã dầu mè, urê, đường mía, KH2PO4 bổ sung dung dịch khống Sau 12 ngày ni cấy hoạt tính laccase đạt cao Nội dung 3: Tìm điều kiện in vitro để nấm phân hủy glyphosate tốt Nội dung 4: Thử nghiệm nghiệm thức qui mơ phịng thí nghiệm thành nghiệm thức hỗn hợp vi sinh (biobed mix) ô sinh học 0,326 U/g - Thành phần môi trường rắn nuôi cấy Phanerochaete chrysosporium chuyển thành hỗn hợp vi sinh (biobed mix) ô sinh học bao gồm mạt dừa, rơm, dung dịch khoáng Sau 14 ngày ni cấy hoạt tính laccase đạt cao 0,25 U/g Nguyễn Hồ Thế Vinh Nguyễn Minh Quang Lương Bảo Un - Ở mơ hình tích 30 x 15 x 20 cm3, ni cấy Pleurotus sp., lượng glyphosate thải môi trường thu dịch lần giảm 72,03%, giảm 92,13% dịch thu lần - Ở mơ hình tích 30 x 15 x 20 cm3, ni cấy Phanerochaete chrysoporium, so với lượng glyphosate đưa vào hệ thống ban đầu dịch thu lần 1có lượng glyphosate giảm 34%, 26,96% 30,04% Biobed10, Biobed50 Biobed100 Sau 10 ngày xử lý lượng dịch từ hệ thống thải giảm 80 - 90% lượng glyphosate ban đầu - Ở mơ hình tích 64 x 60 x 30 cm3, mơ hình Biobed100-Lac chứa chế phẩm vi sinh Phanerochaete chrysoporium, có bổ sung chế phẩm laccase glyphosate thải môi trường thu dịch lần giảm 46,65%, giảm 90,51% dịch thu lần Nguyễn Hồ Thế Vinh Nguyễn Minh Quang Lương Bảo Uyên Thủ trưởng tổ chức chủ trì (Họ tên, chữ ký đóng dấu) Nội dung 5: Ứng dụng mơ hình sinh học có hoạt tính enzyme để phân hủy thuốc trừ cỏ glyphosate lấy từ vườn nhiễm loại thuốc trừ cỏ Chủ nhiệm đề tài (Họ tên, chữ ký) LƯƠNG BẢO UYÊN 10 Bảng 3.20 Hiệu xử lý dịch glyphosate biobed có ni cấy Pleurotus sp Mẫu Biobed Lượng glyphosate ban đầu (mg) 49,95 Tổng lượng glyphosate dịch thu lần (mg) 13,97 Lượng glyphosate lại biomix sau thu dịch lần (mg) 35,98 Tổng lượng glyphosate dịch thu lần (mg) 3,93 Tổng % Lượng lượng glyphosate glyphosate dịch thu lần biomix sau giảm so với ban đầu ngày xử lý (mg) 15,29 72,03 % Lượng glyphosate biomix giảm sau ngày xử lý so với ban đầu 61,52 % Lượng glyphosate giảm dịch thu lần (so với ban đầu) % Lượng glyphosate giảm dịch thu lần (so dịch thu lần 1) 92,13 71,87 Ở ngày nuôi thứ 12, tiến hành dẫn 500 ml dung dịch (L1) chứa glyphosate có nồng độ 99,9 ppm vào biobed, sau thu 220 ml mẫu nước dẫn qua biobed (L2) có nồng độ 63,5 ppm Như vậy, nồng độ glyphosate nước dẫn qua biomixture giảm 36,44%, lượng glyphosate giữ lại biomixture Vào ngày thứ 20, nồng độ glyphosate biomixture biobed (V5) phát 16,99 ppm Khi dẫn 500 ml nước cất qua biomixture, thu 175 ml mẫu nước qua vịi biobed (L3) có nồng độ 22,43 ppm Như vậy, với kết bảng cho thấy tổng lượng glyphosate ban đầu đưa vào biobed 49,95 mg, lượng glyphosate thải môi trường thu dịch lần 13,97 mg, giảm 72,03%, giảm 92,13% dịch thu lần Kết thí nghiệm 3.4.2 cho thấy, chai thủy tinh tích 500 ml khả sinh trưởng hoạt tính laccase Pleurotus sp cao mơ hình biobed 77 Một điều lưu ý trình thiết kế biobed, mơi trường khử trùng mơ hình, sau nấm nuôi cấy phát triển biobed Mô hình thiết kế khơng kiểm sốt lượng khí cần thiết cho sinh trường sinh tổng hợp MnP Pleurotus sp nên khả sinh trưởng nấm yếu, hoạt tính laccase mơi trường thấp nên hiệu phân hủy glyphosate chưa phải tối ưu Do đó, phần thí nghiệm sau, mơ hình thiết kế lại đảm bảo lượng khí bên mơ hình cho sinh trưởng Phanerochaete chrysosporium, đồng thời nấm ni cấy bên ngồi, đảm bảo sinh trưởng tốt trước chuyển vào biobed để xử lý glyphosate Hơn theo kết phần 3.1, 3.3.1 cho thấy khả sinh tổng hợp MnP Phanerochaete chrysosporium tốt chủng khảo sát, đồng thời MnP có khả phân hủy glyphosate cao laccase Mơ hình Biobed Hệ thống sụt khí cho biobed Hình 3.34 Mơ hình biobed có hệ thống sụt khí B PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM Đánh giá khả phân hủy Glyphosan 480 SL MnP Bảng 3.21 Kết phân hủy Glyphosan 480 SL của MnP Mẫu A Gly+MnP 0,15 U/L (0h) Gly+MnP 0,15 U/L (24h) B Gly+MnP 0,15 U/L (0h) Gly+MnP 0,15 U/L (24h) C Gly+MnP 64U/L (0h) Gly+MnP 64U/L (15ngày) Nồng độ glyphosate (ppm) 6,16 3,2 20,8 13,2 1700 1020 Hiệu suất phân hủy glyphosate (%) 48,05 36,54 40 Mẫu A: Glyphosate (Glyphosan 480) + MnP (Sigma) 0,15 U/L Mẫu B: Glyphosate (Glyphosan 480) + MnP (thu nhận từ dịch nuôi cấy Phanerochaete chrysosporium) 0,15 U/L Mẫu C: Glyphosate (Glyphosan 480) + chế phẩm Phanerochaete chrysosporium có hoạt tính MnP 64 U/L 78 Luận văn thạc sĩ Kết bàn luận Theo Leticia Pizzul cộng [26], MnP laccase có khả phân hủy glyphosate cung cấp Dr.Ehrenstorfer GmbH (Augsburg,Germany), dạng hóa chất dùng phân tích Do đó, để đánh giá khả phân hủy glyphosate thương phẩm sử dụng để trừ cỏ, MnP hãng Sigma (mẫu A) sử dụng để xử lý glyphosate Glyphosan 480 Kết bảng cho thấy, MnP thương phẩm 0,15U/L làm giảm 48,05% lượng glyphosate Glyphosan 480, MnP thu nhận từ việc nuôi cấy Phanerochaete chrysosporium 0,15 U/L, với điều kiện phản ứng bao gồm glyphosate (0,06 mM≈10ppm), đệm sodium acetate (0,1 M, pH 4,5) (mẫu B) làm giảm 36,54% lượng glyphosate (xem 3.3.5) Điều cho thấy, chế phẩm thu có hiệu phân hủy glyphosate chênh lệch khoảng 12% so với thương phẩm Với hàm lượng glyphosate lớn khoảng 1700ppm, MnP Phanerochaete chrysosporium làm giảm 40% glyphosate Glyphosan 480 (kết khảo sát) Điều cho thấy hiệu phân hủy glyphosate chế phẩm Phanerochaete chrysosporium, tiến hành khảo sát thành phần mơi trường rắn nuôi cấy Phanerochaete chrysosporium để ứng dụng thành biomixture biobed xử lý glyphosate 3.5.3 Khả phân hủy glyphosate mơ hình biobed có ni cấy P chrysosporium Thử nghiệm khả phân hủy glyphosate MnP từ môi trường nuôi cấy rắn (theo 3.4.3) Mô hình Biobed thiết kế để thực xử lý dịch glyphosate nồng độ khác 10ppm, 50ppm 100ppm 500ml dịch glyphosate đưa vào mơ hình với nồng độ 10ppm, 50ppm, 100ppm, phần dịch thu sau qua biomix biobed sử dụng định lượng glyphosate với tên mẫu tương ứng L10, L50 L100, biomix biobed sau glyphosate chảy qua sử dụng phần để định lượng glyphosate với tên mẫu R10, R50, R100, kết trình bày bảng 3.22, 3.23, 3.24 Bảng 3.22 Kết định lượng glyphosate biobed chứa môi trường nuôi cấy Phanerochaete chrysosporium Hàm lượng Mẫu Hàm lượng Hàm glyphosate sau glyphosate sau lượng glyphosate Mẫu xử lý xử lý ban đầu (ppm) (ppm) ppm 10 L10 8,5 R10 3,36 50 L50 32,1 R50 16,44 100 L100 75,1 R100 23,76 Dư lượng glyphosate lại biomix tiếp tục ủ vòng 10 ngày đánh giá khả xử lý glyphosate hệ thống, kết trình bày bảng 3.22 79 Luận văn thạc sĩ Kết bàn luận Bảng 3.23 Kết định lượng glyphosate biobed sau 10 ngày xử lý môi trường nuôi cấy Phanerochaete chrysosporium Hàm Hàm lượng Mẫu Hàm lượng lượng glyphosate sau glyphosate sau glyphosate Mẫu xử lý xử lý ban đầu (ppm) (ppm) ppm 10 L10 2,64 R10 50 L50 8,36 R50 0,3 100 L100 12,92 R100 2,52 Hiệu xử lý glyphosate dịch chảy qua biobed có chế phẩm Phanerochaete chrysosporium: Thể tích thu L10: 200ml; L50: 210ml; L100: 200ml Lượng glyphosate dịch thu sau qua biomix (dịch thu lần 1) dư lượng cịn biomix tính tốn trình bày bảng 3.28 Bảng 3.24 Hiệu xử lý glyphosate dịch chảy qua biobed có chế phẩm Phanerochaete chrysosporium Mẫu Lượng Tổng Tổng lượng % Lượng % Lượng glyphosate lượng glyphosate glyphosate glyphosate ban đầu glyphosate mẫu giảm giảm (mg) dịch biomix (mg) mẫu thu lần lỏng (mg) Biobed10 1,7 3,19 2,16 34,00 Biobed50 25 6,7 15,62 10,56 26,96 Biobed100 50 15,0 22,57 24,82 30,04 So với lượng glyphosate đưa vào hệ thống ban đầu dịch thu lần 1có lượng glyphosate giảm 34%, 26,96% 30,04% Biobed10, Biobed50 Biobed100 Kết ban đầu cho thấy tính khả thi hiệu hệ thống đặt nhiều biobed chồng lên nhau, lượng glyphosate giảm dần dịch ô nhiễm glyphosate đưa vào hệ thống, số lượng biobed tùy thuộc vào lượng glyphosate (hoặc thuốc bảo vệ thực vật) khu vực 80 Luận văn thạc sĩ Kết bàn luận Hình 3.35 Mơ hình Biobed10, Biobed50, Biobed100 81 Hiệu xử lý sau 10 ngày dịch glyphosate ủ biobed: Sau 10 ngày ủ biobed, bổ sung 500ml cho hệ thống thu dịch Thể tích dịch thu lần L10: 300ml; L50: 400ml; L100: 350ml Bảng 3.25 Hiệu xử lý sau 10 ngày dịch glyphosate ủ biobed Mẫu Lượng glyphosate ban đầu (mg) Biobed10 Biobed50 Biobed100 25 50 Tổng lượng Tổng lượng glyphosate glyphosate mẫu dịch thu biomix sau lần (mg) thu dịch lần (mg) 3,19 0,92 15,62 3,34 22,57 3,88 Tổng lượng glyphosate mẫu biomix sau thu dịch lần ủ 10 ngày (mg) 0,24 2,01 % Lượng glyphosate giảm so với ban đầu 81,52 85,66 88,22 % Lượng glyphosate giảm dịch thu lần (so với ban đầu) 81,52 86,62 92,25 % Lượng glyphosate giảm dịch thu lần (so dịch thu lần 1) 45,65 50,39 74,19 Sau 10 ngày xử lý lượng dịch từ hệ thống thải giảm 80 - 90% lượng glyphosate ban đầu, đồng thời dư lượng glyphosate biomix lại không đáng kể mg, 0,24 mg, 2,01 mg So sánh mơ hình biobed có ni cấy Pleurotus sp Phanerochaete chrysosporium hiệu xử lý glyphosate tương đương Tuy nhiên, P chrysosporium lại có khả sinh trưởng với khí hậu Việt nam tốt Pleurotus sp Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng Pleurotus sp khoảng 29 – 33oC, Phanerochaete chrysosporium sinh trưởng nhanh nhiệt độ 38 - 40oC Hơn thao tác tách chiết laccase từ Pleurotus sp đơn giản, enzyme giữ hoạt tính tốt, MnP enzyme thuộc nhóm peroxidase nên việc trì hoạt tính sau tách chiết cần điều kiện nghiêm ngặt Do đó, mơ hình cần phát triển với biomixture nuôi cấy Phanerochaete chrysosporium kết hợp với việc bổ sung chế phẩm laccase từ Pleurotus sp để nâng cao hiệu sử dụng biobed 82 Luận văn thạc sĩ Kết bàn luận 3.5.4 Khả phân hủy glyphosate mơ hình biobed có ni cấy P chrysosporium có bổ sung chế phẩm laccase Thử nghiệm khả phân hủy glyphosate MnP từ môi trường nuôi cấy rắn (theo 3.4.7) có bổ sung laccase Enzyme sinh môi trường nuôi cấy Phanerochaete chrysosporium chủ yếu MnP theo Leticia Pizzul cộng (2009) [26], laccase có khả phân hủy glyphosate Hơn nữa, thí nghiệm trình bày 3.3.1, 3.5.2 cho thấy laccase làm giảm hàm lượng glyphosate mẫu Do mơ hình thiết lập có bổ sung laccase với tổng hoạt tính 300U (cho 7,8kg biomixture) giúp nâng cao hiệu xử lý glyphosate mẫu Mơ hình Biobed thiết kế để thực xử lý dịch glyphosate nồng độ glyphosate 100ppm Đối với mơ hình (30 x 15 x 20 cm3), 500ml dịch glyphosate đưa vào mơ hình với nồng độ 100ppm, phần dịch thu sau qua biomix biobed sử dụng để định lượng glyphosate với tên mẫu L100-Lac, biomix biobed sau glyphosate chảy qua sử dụng phần để định lượng glyphosate với tên mẫu R100-Lac, kết trình bày bảng 3.26 Mơ hình đối chứng (30 x 15 x 20 cm3) chứa hỗn hợp thành phần để nuôi cấy Phanerochaete chrysosporium không cấy nấm có kí hiệu tương tự trên, mẫu lỏng L0-Control mẫu rắn R0-Control Đối với mơ hình (64 x 60 x 30 cm3) lít dịch glyphosate đưa vào mơ hình với nồng độ 100ppm, phần dịch thu sau qua biomix biobed sử dụng định lượng glyphosate với tên mẫu BL100-Lac, biomix biobed sau glyphosate chảy qua sử dụng phần để định lượng glyphosate với tên mẫu BR100-Lac, kết trình bày bảng 3.26 Bảng 3.26 Kết định lượng glyphosate biobed chứa môi trường nuôi cấy Phanerochaete chrysosporium bổ sung Laccase Hàm lượng Mẫu Hàm lượng Hàm lượng glyphosate sau glyphosate sau glyphosate Mẫu xử lý xử lý ban đầu (ppm) (ppm) (ppm) L0-Control 102,6 R0-Control 2,1 100 L100-Lac 100,6 R100-Lac 11,2 100 L100 75,1 R100 23,76 100 BL100-Lac 106,7 BR100-Lac 5,6 Dư lượng glyphosate lại biomix tiếp tục ủ vòng 10 ngày đánh giá khả xử lý glyphosate hệ thống, kết trình bày bảng 3.27 83 Luận văn thạc sĩ Kết bàn luận Bảng 3.27 Kết định lượng glyphosate biobed sau 10 ngày xử lý môi trường nuôi cấy Phanerochaete chrysosporium bổ sung Laccase Hàm lượng Hàm lượng Mẫu Hàm lượng glyphosate glyphosate glyphosate sau Mẫu ban đầu sau xử lý xử lý ppm (ppm) (ppm) L0-Control 3,7 R0-Control 7,6 100 L100-Lac 6,4 R100-Lac 6,9 100 L100 12,92 R100 2,52 100 BL100-Lac 21,9 BR100-Lac 6,2 Hiệu xử lý glyphosate dịch chảy qua biobed có chế phẩm Phanerochaete chrysosporium: Thể tích thu L0-Control: 300ml; L100-Lac: 180ml, BL100-Lac: 1500ml Lượng glyphosate dịch thu sau qua biomix (dịch thu lần 1) dư lượng cịn biomix tính tốn trình bày bảng 3.28 Bảng 3.28 Hiệu xử lý glyphosate dịch chảy qua biobed có chế phẩm Phanerochaete chrysosporium bổ sung Laccase Mẫu Lượng Tổng Tổng lượng % Lượng % Lượng glyphosate lượng glyphosate glyphosate glyphosate ban đầu glyphosate mẫu giảm giảm (mg) dịch biomix (mg) mẫu thu lần lỏng (mg) 50 30,8 2,0 34,45 38,44 Control (đối chứng) Biobed100_Lac 50 18,1 10,64 42,50 63,78 Biobed100 50 15,0 22,57 24,82 30,04 Biobed100_Lac 300 160,05 43,68 32,09 46,65 65 l So với lượng glyphosate đưa vào hệ thống ban đầu dịch thu lần 1có lượng glyphosate giảm 38,44% mẫu đối chứng, 63,78% mẫu Biobed xử lý dịch glyphosate 100ppm Mẫu biomixture (chế phẩm Phanerochaete chrysosporium có bổ sung laccase) làm giảm glyphosate với hiệu suất gấp lần so với mẫu đối chứng (khơng có nấm hỗn hợp) 84 Luận văn thạc sĩ Kết bàn luận Hiệu xử lý sau 10 ngày dịch glyphosate ủ biobed: Sau 10 ngày ủ biobed, bổ sung 500ml cho hệ thống thu dịch Thể tích dịch thu lần L0-Control 2: 300ml; L100-Lac 2: 390ml BL100-Lac 2: 1300ml Bảng 3.269 Hiệu xử lý sau 10 ngày dịch glyphosate ủ biobed % Lượng glyphosate giảm so với ban đầu % Lượng glyphosate giảm dịch thu lần (so với ban đầu) % Lượng glyphosate giảm dịch thu lần (so dịch thu lần 1) 1,44 Tổng lượng glyphosate mẫu biomix sau ủ 10 ngày sau thu dịch lần (mg) 6,08 84,95 97,11 95,31 21,25 1,92 5,52 85,12 96,16 89,40 22,57 96,27 3,88 28,47 2,01 47,74 88,22 74,60 92,25 90,51 74,19 82,21 Mẫu Lượng glyphosate ban đầu (mg) Control (đối chứng) Biobed100_ Lac Biobed100 Biobed100_ Lac 65 l 50 17,22 50 50 300 Tổng lượng Tổng lượng glyphosate glyphosate mẫu dịch thu biomix sau lần (mg) thu dịch lần (mg) Đối với mơ hình (30 x 15 x 20 cm3), sau 10 ngày xử lý lượng dịch từ hệ thống thải giảm 97% lượng glyphosate ban đầu, đồng thời dư lượng glyphosate biomix lại 6,08 mg, 5,52 mg Đối với hệ thống có qui mô lớn 64 x 60 x 30 cm3, biobed 100-Lac 65 l giảm 74,60% (nồng độ đưa vào 100ppm (3 lít) dịch chảy sau 10 ngày xử lý 21,9ppm (1,3 lít)), dư lượng glyphosate biomix cịn lại 47,74 mg (khá so với 300mg đưa vào ban đầu) 85 Luận văn thạc sĩ Kết bàn luận CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Các chủng nấm sử dụng để khảo sát đề tài Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus sp., Trametes sp, Ganoderma lucidum Trong đó, yêu cầu kỹ thuật thao tác nuôi cấy, thời gian sinh trưởng Phanerochaete chrysosporium Pleurotus sp thuận lợi cho việc thực thí nghiệm đề tài tính khả thi triển khai với qui mơ lớn, ứng dụng nuôi cấy thu dịch enzyme thực tế P chrysosporium nuôi cấy đề tài tạo chế phẩm có hoạt tính MnP 64,48 UI/L chịu 9.000ppm glyphosate mơi trường ni cấy Pleurotus sp sinh trưởng mơi trường khống tạo thành chế phẩm enzyme Lac với hoạt tính 1.027UI/L mơi trường ni cấy diện glyphosate chúng chịu đến nồng độ 4.000ppm Trong điều kiện in-vitro phịng thí nghiệm, chế phẩm MnP từ môi trường nuôi cấy P chrysosporium đặc để tăng nồng độ enzyme, thể tích giảm lần Thực phân hủy glyphosate MnP thu điều kiện in-vitro glyphosate (0,06 mM), đệm sodium acetate (0,1 M, pH 4,5) MnP (0,15 UI/ml) sau 24h ủ 35°C 150 rpm, lượng glyphosate giảm 36,54% Sử dụng Pleurotus sp hay Phanerochaete chrysoporium để tạo biomixture cho biobed có kết tương đương - Ở mơ hình tích 30 x 15 x 20 cm3, triển khai thử nghiệm nuôi cấy Pleurotus sp môi trường rắn với chất mạt dừa, tổng lượng glyphosate ban đầu đưa vào biobed 49,95 mg, lượng glyphosate thải môi trường thu dịch lần 13,97 mg, giảm 72,03%, giảm 92,13% dịch thu lần - Ở mơ hình tích 30 x 15 x 20 cm3, sử dụng môi trường chứa mạt dừa, trấu đất sét nung nuôi cấy Phanerochaete chrysoporium đưa vào hệ thống biobed, so với lượng glyphosate đưa vào hệ thống ban đầu dịch thu lần 1có lượng glyphosate giảm 34%, 26,96% 30,04% Biobed10, Biobed50 Biobed100 Sau 10 ngày xử lý lượng dịch từ hệ thống thải giảm 80 90% lượng glyphosate ban đầu, đồng thời dư lượng glyphosate biomix cịn lại khơng đáng kể mg, 0,24 mg, 2,01 mg - Ở mơ hình tích 64 x 60 x 30 cm3, mơ hình Biobed100-Lac chứa chế phẩm vi sinh Phanerochaete chrysoporium, có bổ sung chế phẩm laccase (nồng độ glyphosate đầu vào 100mg/kg), tổng lượng glyphosate ban đầu đưa vào biobed 300 mg, lượng glyphosate thải môi trường thu dịch lần 160,05 mg, giảm 46,65%, giảm 90,51% dịch thu lần ĐỀ NGHỊ Mơ hình sử dụng để xử lý glyphosate loại thuốc bảo vệ thực vật khác nông trại đáp ứng tiêu chuẩn Global GAP 86 Luận văn thạc sĩ Kết bàn luận Xác định lại xác tên chủng nấm sử dụng đề tài Thiết kế thí nghiệm để đánh giá chuyển hóa glyphosate mơi trường rắn Kết hợp việc sử dụng chế phẩm vi sinh chế phẩm enzyme chủng nấm Pleurotus sp Phanerochaete chrysoporium để mơ hình biobed hiệu Thử nghiệm hệ thống nhiều biobed (nước ô nhiễm thuốc bảo vệ thực vật di chuyển qua nhiều biobed, hàm lượng chất ô nhiễm giảm dần) để hiệu xử lý nhanh hiệu Thử nghiệm biomixture loại thuốc bảo vệ thực vật khác 87 Luận văn thạc sĩ Kết bàn luận TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Alam M.Z., Mansor M.F., Jalal K C A., “Optimization of lignin peroxidase production and stability by Phanerochaete chrysosporium using sewage-treatment-plant sludge as substrate in a stirred-tank bioreactor”, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, Vol.36, 2009, pp.757–764 [2] Andréa, M M d., Peres, T B., Luchini, L C., Bazarin, S., Papini, S., Matallo, M B., & Savoy, V L T, Influence of repeated applications of glyphosate on its persistence and soil bioactivity, Pesquisa Agropecuaria Brasileira, 38(11), 2003, 1329-1335 [3] Arunakumara, K., Walpola, B C., & Yoon, M.-H, Metabolism and degradation of glyphosate in aquatic cyanobacteria: A review, African Journal of Microbiology Research, 7(32), 2013, 4084-4090 [4] Castillo del Pilar Maria, Torstensson, L., Effect of biobed composition, moisture, and temperature on the degradation of pesticides, Journal of agricultural and food chemistry, 55(14), 2007, 5725-5733 [5] Castillo del Pilar Maria, Torstensson, L., Stenström, J., Biobeds for Environmental Protection from Pesticide Use – A Review, Journal of agricultural and food chemistry, 56(15), 2008, 6206-6219 [6] Castillo del Pilar Maria, Ander, P., Stenström, J., & Torstensson, L., Degradation of the herbicide bentazon as related to enzyme production by Phanerochaete chrysosporium in two solid substrate fermentation systems, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 16(3), 2000, 289-295 [7] Castillo del Pilar, M., von Wirén-Lehr, S., Scheunert, I., & Torstensson, L., Degradation of isoproturon by the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium, Biology and Fertility of Soils, 33(6), 2001, 521-528 [8] Couto S.R et al., Optimum stability conditions of pH and temperature for ligninase and manganese-dependent peroxidase from Phanerochaete chrysosporium, Application to in vitro decolorization of Poly R-478 by MnP, World Journal of Microbiology & Biotechnology, Vol.22, 2006, pp.607–612 [9] Dick, R., & Quinn, J., Glyphosate-degrading isolates from environmental samples: occurrence and pathways of degradation, Applied microbiology and biotechnology, 43(3), 1995, 545-550 [10] Dosoretz, C G., Chen, A H C., & Grethlein, H E., Effect of oxygenation conditions on submerged cultures of Phanerochaete chrysosporium, Applied microbiology and biotechnology, 34(1), 1990, 131-137 [11] Duke, S O., & Powles, S B., Glyphosate: a once‐in‐a‐century herbicide, Pest management science, 64(4), 2008, 319-325 [12] Eman Ashour, Sadik M.W., Abdel-Megeed Ahmed, Areej Suliman Al-Meshal, Sholkamy Essam N., Biodegradation of Glyphosate by Fungal Strains isolated from 88 Luận văn thạc sĩ Kết bàn luận herbicides polluted-soils in Riyadh Area, British Journal of Environmental Sciences, Vol.1, No.1, December 2013, 8-30 [13] Evangelos Karanasios, Nikolaos G Tsiropoulos, Dimitrios G Karpouzas, On-farm biopurification systems for the depuration of pesticide wastewaters: recent biotechnological advances and future perspectives, Biodegradation, 23, 2012, 787–802 [14] George F Antonious, On-farm bioremediation dimethazone and trifluralin residues in runoff water from an agriculture field, Journal of Environmental Science and Health, PartB, 47, 2012,608–621 [15] Henderson, A., Gervais, J., Luukinen, B., Buhl, K., & Stone, D., Glyphosate Technical Fact Sheet, National Pesticide Information Center, Oregon State University Extension Services, 2010 [16]  Henderson, A., Gervais, J., Luukinen, B., Buhl, K., & Stone, D., Glyphosate Technical Fact Sheet, National Pesticide Information Center, Oregon State University Extension Services, date reviewed September 2010, revised: June 2015 [17] Inna T Ermakova, Nina I Kiseleva, Tatyana Shushkova, Mikhail Zharikov, Gennady A Zharikov, Alexey A Leontievsky, Bioremediation of glyphosatecontaminated soils, Appl Microbiol Biotechnol 88, 2010, 585 – 594 [18]  International Agency for Research on Cancer (IARC), World Health Organization, IARC monographs volume 112: evaluation of five organophosphate insecticides and herbicides, Lyon, France, 20 March 2015 [19] International Agency for Research on Cancer (IARC), World Health Organization (2015), Carcinogenicity of tetrachlorvinphos, parathion, malathion, diazinon, and glyphosate, International Agency for Research on Cancer (IARC), World Health Organization, Published online 20 March 2015 [20]  International Programme on Chemical Safety, Environmental health criteria monograph No 159: glyphosate, Published under the joint sponsorship of the United Nations Environment Programme, the International Labor Organization, and the World Health Organization, Geneva, 1994 [21] Jaqueline da Silva Coelho-Moreira, Giselle Maria Maciel, Rafael Castoldi, Simone da Silva Mariano, Fabíola Dorneles Inácio,Adelar Bracht and Rosane Marina Peralta, Involvement of Lignin-Modifying Enzymes in the Degradation of Herbicides, Herbicides – Advances in Research, Chapter 8, 2013, 165 - 188 [21]  Jimenez-Tobon, G., Kurzatkowski, W., Rozbicka, B., Solecka, J., Pócsi, I., & Penninckx, M J., In situ localization of manganese peroxidase production in mycelial pellets of Phanerochaete chrysosporium, Microbiology, 149(11), 2003, 3121-3127 89 Luận văn thạc sĩ Kết bàn luận [23] Kjær, J., Olsen, P., Ullum, M., & Grant, R., Leaching of glyphosate and aminomethylphosphonic acid from Danish agricultural field sites, Journal of Environmental Quality, 34(2), 2005, 608-620 [24] Krüger, M., Schledorn, P., Schrödl, W., Hoppe, H.-W., Lutz, W., & Shehata, A A., Detection of glyphosate residues in animals and humans, Journal of Environmental & Analytical Toxicology, 4, 2014 [25] Laitinen, P., Rämö, S., & Siimes, K., Glyphosate translocation from plants to soil– does this constitute a significant proportion of residues in soil, Plant and soil, 300(1-2), 2007, 51-60 [26] Leticia Pizzul, María del Pilar Castillo, John Stenström, Degradation of glyphosate and other pesticides by ligninolytic enzymes, Biodegradation 20, 2009, 751–759 [27] Liu, C.-M., McLean, P., Sookdeo, C., & Cannon, F., Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae, Applied and Environmental Microbiology, 57(6), 1991, 1799-1804 [28] Magalhães, Denise Bello, et al., Colorimetric assay for lignin peroxidase activity determination using methylene blue as substrate", Biotechnology techniques 10 (4), 1996, 273-276 [29]More, S S., PS, R., & Malini, S.- Isolation, Purification, and Characterization of Fungal Laccase from Pleurotus sp., Enzyme research 2011 [30] Oliveira, Patrícia Lopes de, et al.- Purification and Partial characterization of manganese peroxidase from Bacillus pumilus AND Paenibacillus sp., Brazilian Journal of Microbiology 40 (4), 2009, 818-826 [31] Paoletti, M G., The role of earthworms for assessment of sustainability and as bioindicators, Agriculture, Ecosystems & Environment, 74(1), 1999, 137-155 [32] QIAN, Y , Effect of nitrogen concentration in culture mediums on growth and enzyme production of Phanerochaete chrysosporium", Journal of Environmental Sciences, 17(2), 2005, 190-193 [33] Silvia Isabel de Sousa Fragoeiro, Use of Fungi in Bioremediation of Pesticides, PhD Thesis, Applied Mycology Group Institute of Bioscience and Technology, Cranfield University, 2005 [34] Sutherland G.R.J., Aust S.D (1996), The Effects of Calcium on the Thermal Stability and Activity of Manganese Peroxidase, Archives of Biochemistry and Biophysics,Vol.332 (1), 1996, 128-134 [35] Thongprakaisang, S., Thiantanawat, A., Rangkadilok, N., Suriyo, T., & Satayavivad, J., Glyphosate induces human breast cancer cells growth via estrogen receptors, Food and Chemical Toxicology, 59, 2013, 129-136 90 Luận văn thạc sĩ Kết bàn luận [36] Učrek R.O., Pazarliogtlu N.K., Purification and partial characterization of manganese peroxidase from immobilized Phanerochaete chrysosporium, Process Biochemistry, Vol.39 (12), 2004, 2061-2068 [37] Urek R.O., Pazarlioglu N.K., Enhanced production of manganese peroxidase by Phanerochaete chrysosporium, Brazilian Archives of Biology and Technology, Vol.50 (6), 2007, ISSN 1678-4324 [38] Vera, M S., Lagomarsino, L., Sylvester, M., Pérez, G L., Rodríguez, P., Mugni, H., Sinistro, R., Ferraro, M., Bonetto, C., Zagarese, H., Pizarro, H., New evidences of Roundup® (glyphosate formulation) impact on the periphyton community and the water quality of freshwater ecosystems, Ecotoxicology, 19(4), 2010, 710-721 [39] XIONG, X., Xianghua, W E N., Yanan, B A I., & Yi, Q I A N., Effects of culture conditions on ligninolytic enzymes and protease production by Phanerochaete chrysosporium in air, Journal of Environmental Sciences, 20(1), 2008, 94-100   91