Xây dựng phương pháp chuyển nạp gen vào cây dâu tây fragariavesscal nhờ vi khuẩn agrbacterium tumefaciens kết hợp xử lý sóng siêu âm

BÁO CÁO NGHIỆM THU Tên đề tài: Xây dựng phương pháp chuyển nạp gen vào dâu tây (Fragaria vesca L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens kết hợp xử lý sóng siêu âm Chủ nhiệm đề tài: Mai Trường Cơ quan chủ trì: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ Thời gian thực đề tài: 18 tháng Kinh phí duyệt: 50.000.000 đ Kinh phí cấp: 45.000.000đ theo TB số:345 TB-SKHCN ngày 22/12 /05 Thực đề tài có hổ trợ hố chất, vật tư thiết bị Phịng Cơng nghệ gen (Viện Sinh học Nhiệt đới) Phịng Thí nghiệm Trọng điểm phía Nam Cơng nghệ Tế bào thực vật Mục tiêu: Việc xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hiệu thông qua đường phát sinh quan dâu tây điều kiện tiên để ứng dụng thành cơng nghiên cứu chuyển nạp gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Mục tiêu tối ưu hóa hệ thống ni cấy tái sinh chồi, áp dụng để xây dựng phương pháp chuyển gen dâu tây Xác định thông số xử lý sóng siêu âm nhằm nâng cao khả biến nạp gen vào mô, tế bào dâu tây, tạo tiền đề cho nghiên cứu hướng Công nghệ gen nhằm đưa số gen hữu dụng khác vào dâu tây Nội dung: (Theo đề cương duyệt hợp đồng ký) Công việc dự kiến Cơng việc thực - Nghiên cứu q trình phát sinh - Khử trùng vô mẫu dâu tây hình thái chồi bất định từ số - Khảo sát tần số tái sinh dĩa loại mô nuôi cấy môi môi trường MSB (khống đa trường thích hợp lượng, vi lượng Murashige Skoog (1962), vitamin B5 (Gamborg, 1968), bổ sung chất điều hòa sinh trưởng: BAP (5 nghiệm thức), TDZ (5 nghiệm thức), BAP+IBA (5 nghiệm thức) TDZ+2,4-D (5 nghiệm thức) - Đánh giá tác động kháng sinh - Đã đánh giá khả chống chịu kanamycin lên ứch chế sinh kháng sinh kanamycin dĩa dâu trưởng số loại mô (phục tây nồng độ: 10, 20, 30 40 vụ cho công việc chuyển nạp gen mg/l Xây dựng ngưỡng chọn chọn lọc kháng kanamycin) lọc kháng sinh kanamycin triệt để gây chết mơ hồn tồn 20 mg/l, phục vụ cho công tác chuyển nạp gen gen nptII - Khảo sát tần số sóng siêu âm, thời - Khảo sát thời gian xử lý siêu âm 3, gian xứ lý mô, quan để phục vụ 5, giây tần số 25 Khz tác thí nghiệm chuyển nạp gen động lên khả tái sinh dĩa Thông số tối ưu việc xử lý sóng siêm âm tần số 25 khz, thời gian xử lý giây - Tạo chủng vi khuẩn Escherichia - Thực tạo dòng tế bào E coli coli Agrobacterium tumefaciens DH5 khả biến chuyển nạp chứa plasmid pCAMBIA 2301 thành công pCAMBIA 2301vào E mang gen thị gusA gen coli kháng kanamycin (nptII) phục vụ - Đã tạo dòng tế bào vi khuẩn A cho chuyển nạp gen tumefaciens LBA 4404 mang plasmid 2301 - Thực chuyển gen thông qua vi khuẩn - Thực nghiệm chuyển nạp gen Agrobacterium thông A tumefaciens chứa plasmid tumefaciens chứa plasmid pCAMBIA 2301, mang gen gusA pCAMBIA 2301 kết hợp xứ lý gen nptII, kết hợp xử lý sóng siêu sóng siêu âm - SAAT (Sonication- âm giây tần số 25 khz Assisted Agrobacterium Transformation) - Phân tích mơ chuyển gen - Thực phương pháp hóa mơ phương pháp định tính với thuốc thử X-gluc để kiểm tra phương pháp sinh học phân tử diện gen gusA chồi, - Tác chiết ADN nhiễm sắc thể từ lá, khuếch đại ADN kỹ thuật PCR để kiểm tra diện gen nptII thơng qua kích thước band gel diện di Sản phẩm nghiên cứu STT Tên sản phẩm Qui trình tạo chồi bất định, - Đã xây dựng quy trình tái sinh chồi in vitro Sản phẩm thực từ dĩa dâu tây, mơi trường khống đa lượng, vi lượng MS (Murashige Skoog, 1962), vitamin B5 (Gamborg, 1968), bổ sung TDZ (Thidiazuron) 1,5 mg/l, 2,4-D (2,4Dichlorophenoxyacetic acid) 0,2 mg/l cho tỉ lệ tái sinh cao 63.20A3.30% mơi trường thí nghiệm Phương pháp xác định - Xây dựng ngưỡng chọn lọc ngưỡng chọn lọc chuẩn đối kháng sinh kanamycin triệt để gây kháng sinh kanamycin (nptII) chết mơ hồn tồn 20 mg/l, phục vụ cho công tác chuyển nạp gen gen nptII Phương pháp xác định thông - Thông số thời gian xử lý giây số xử lý sóng siêu âm tần số 25 khz thích hợp việc xử lý mẫu trước chuyển gen Qui trình chuyển gen vi - Đã xây dựng quy trình chuyển gen khuẩn Agrobacterium vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens kết hợp xứ lý tumefaciens kết hợp xử lý sóng siêu sóng siêu âm mô lá, âm mô lá, kết qủa tạo thành cuống dâu tây cơng dịng dâu tây chuyển gen mang gen thị gusA gen kháng kanamycin (nptII) Kỹ thuật PCR phân tích gen - Đã phát có mặt gen kháng kanamycin gusA lá, chồi chuyển gen phương pháp hóa mơ GUS - Kết điện di sản phẩm ADN từ kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) mô dâu tây, cho thấy diện gen kháng kanamycine (nptII) với kích thước 285 bp Một báo đăng Tạp chí Đã gửi đăng báo Hội nghị nước Hội nghị Nghiên cứu khoa học khoa học công nghệ sinh học sống ngày 10/8/2007(đang in toàn quốc xuất vào tháng 12/2007) MỤC LỤC Trang PHẦN MỞ ĐẦU Tên đề tài 1-4 Chủ nhiệm đề tài: Cơ quan chủ trì: Thời gian thực hiện: Kinh phí duyệt: Kinh phí cấp: theo TB số: TB-SKHCN ngày / Mục tiêu Nội dung Sản phẩm đề tài Mục lục 5-8 Danh sách chữ viết tắt 9-10 Danh sách bảng 10-11 Danh sách hình 11-12 Bảng tốn 13 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 14-16 CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 16 Nghiên cứu trình phát sinh hình thái chồi bất định từ 16 số lọai mô nuôi cấy mơi trường thích hợp 1.1 Phương pháp nghiên cứu 16-17 1.1.1 Khử trùng mô mẫu 17 1.1.2 Khảo sát ảnh hưởng BAP (6-Benzylaminopurine) 17 lên tái sinh chồi dĩa dây tây 1.1.3 Khảo sát ảnh hưởng TDZ (Thidiazuron) đến phát 17 sinh chồi đĩa dâu tây 1.1.4 Khảo sát ảnh hưởng tổ hợp chất điều hòa sinh 17 trưởng BAP (6-Benzylaminopurine) IBA (Indol-3butyric Acid) đến tái sinh chồi đĩa dâu tây 1.1.5 Khảo sát ảnh hưởng tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng TDZ (Thidiazuron) 2,4-D 18 (2,4- Dichlorophenoxyacetic acid) lên tái sinh chồi đĩa dâu tây 1.1.6 Tạo dâu tây hoàn chỉnh in vitro 18 Xây dựng phương pháp chuyển nạp gen vi khuẩn 18 Agrobacterium tumefaciens kết hợp xử lý sóng siêu âm 2.1 Đánh giá tác động kháng sinh kanamycin lên ức 18 chế sinh trưởng đĩa dâu tây, phục vụ cho công việc chuyển nạp gen 2.2 Khảo sát tần số, thời gian xử lý đĩa với sóng siêu âm 18-19 để phục vụ thí nghiệm chuyển nạp gen 2.3 Tạo dòng vi khuẩn E coli Agrobacterium 19 tumefaciens chứa plasmid pCAMBIA 2301 mang gen thị gusA gen kháng kanamycin (nptII) 2.3.1 Plasmid thang chuẩn 19-20 2.3.2 Phương pháp tạo dòng tế bào vi khuẩn E coli có khả 21 biến nạp 2.3.3 Phương pháp biến nạp plasmidCAMBIA 2301 vào vi 21 khuẩn E coli 2.3.4 Phương pháp tạo dòng tế bào vi khuẩn Agrobacterium 22 tumefaciens khả biến 2.3.5 Phương pháp chuyển plasmid vào tế bào vi khuẩn 22-24 Agrobacterium tumefaciens khả biến kiểm tra plasmid vi khuẩn 2.4 Phương pháp nuôi cấy chung đĩa dâu tây với vi khuẩn 24-25 Agrobacterium tumefaciens kết hợp xử lý sóng siêu âm Phân tích gen gusA gen kháng kanamycin (nptII) 25 phương pháp hóa mô kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 3.1 Phương pháp hóa mơ GUS 25 3.2 Phân tích gen kháng kanamycin (nptII) phương 25 pháp PCR 3.2.1 Tách chiết ADN nhiễm sắc thể thực vật theo phương 25-26 pháp Dellaporta (1983) 3.2.2 Kiểm tra diện gen nptII phân tích PCR 26-27 CHƯƠNG III: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 27 Sự phát sinh hình thái chồi bất định từ số loại mô 27 nuôi cấy môi trường khác 1.1 Tạo nguồn mẫu dâu tây in vitro 1.2 Ảnh hưởng BAP (6-Benzylaminopurine) lên tái 27 27-28 sinh chồi dĩa dây tây 1.3 Ảnh hưởng TDZ (Thidiazuron) đến phát sinh 28-29 chồi đĩa dâu tây 1.4 Tác động tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP (6- 29 Benzylaminopurine) IBA (Indol-3-butyric Acid) đến tái sinh chồi đĩa dâu tây 1.5 Tác động tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng TDZ 30 (Thidiazuron) 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) lên tái sinh chồi đĩa dâu tây 1.6 Cây dâu tây hoàn chỉnh in vitro 31 Chuyển nạp gen vi khuẩn Agrobacterium 31 tumefaciens kết hợp xử lý sóng siêu âm 2.1 Tác động kháng sinh kanamycin lên ức chế sinh 31-32 trưởng đĩa dâu tây, phục vụ cho công việc chuyển nạp gen 2.2 Tần số, thời gian xử lý đĩa với sóng siêu âm phục vụ 32 thí nghiệm chuyển nạp gen 2.3 Tạo dòng vi khuẩn E coli Agrobacterium 32 tumefaciens chứa plasmid pCAMBIA 2301 mang gen thị gusA gen kháng kanamycin (nptII) 2.3.1 Kết tạo dòng tế bào vi khuẩn E coli khả biến 32-33 chuyển nạp plasmid pCAMBIA 2301 vào tế bào 2.3.2 Biến nạp plasmid vào Agrobacterium tumefaciens 33-34 chuẩn bị cho thao tác chuyển nạp gen vào thực vật kiểm tra diện plasmid enzym giới hạn 2.4 Phương pháp chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium 34-35 tumefaciens kết hợp xử lý sóng siêu âm Phân tích gen gusA gen kháng kanamycin (nptII) 35 phương pháp hóa mơ kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 3.1 Hóa mơ GUS 35-36 Kết phân tích gen kháng kanamycin (nptII) 3.2 36 phương pháp PCR điện di gel agarose CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 Hệ thống tái sinh in vitro từ dĩa dâu tây 36-37 Phương pháp chuyển nạp gen vi khuẩn 37-38 Agrobacterium tumefaciens kết hợp xử lý sóng siêu âm Đề nghị 38 PHỤ LỤC 39-52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53-54 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT ATP : Adenosine 5’- triphosphate Bp : Base pair, cặp base Bt : Bacillus thuringiensis CAMBIA : Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture CAMV : Cauliflower Mosaic Virus CG : Chuyển gen Cry : Crystal (gen) dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate DNA : Deoxyribonucleic acid ĐC : Đối chứng EDTA : Ethylenediamine tetraacetic acid EtBr : Ethidium bromide gusA : Gen tạo enzyme -D-glucuronidase GUS : -D-glucuronidase (enzyme) hph : Hygromycin phosphotransferase (gen) HPH : Hygromycin phosphotransferase (enzyme) IPTG : Isopropyl thio--D-galactoside Kb : Kilobase KDa : Kilodalton LB : Luria-Bertani nptII : Neomycin phosphotransferase (gen) NPT II : Neomycin phosphotransferase (enzyme) RE : Restriction enzyme RNA : Ribonucleic acid Rnase : Enzyme SDS : Sodium dodecyl sulphate PCR : Polymerase chain reaction Taq : Thermus aquaticus T-DNA : Transferred - DNA Ubi : Ubiquitin (gen) X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside X-gluc : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronide MSB : Murashige Skoog (1962), Gamborg (1968) DT1,5 : Môi trường khoáng đa lượng, vi lượng thủy giải RNA (Murashige Skoog, 1962), vitamin B5 (Gamborg, 1968), bổ sung TDZ 1,5 mg/l, 2,4-D 0,2 mg/l) DANH SÁCH BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG Bảng Ảnh hưởng BAP lên hình thành chồi 27-28 mẫu cấy sau 45 ngày Bảng Ảnh hưởng TDZ lên hình thành chồi 28 mẫu cấy sau 45 ngày Bảng Ảnh hưởng BAP IBA lên hình thành 29 chồi mẫu cấy sau 45 ngày Bảng Ảnh hưởng TDZ 2,4-D lên hình thành 30 chồi mẫu cấy sau 45 ngày Bảng Tác động ứch chế gây chết mô của kháng sinh kanamycin đĩa 30 45 ngày 10 31-32 - NaH2PO4 Dung dịch muối khoáng 20X (g/l): - NH4Cl 20 - MgSO4 - KCl - CaCl2.2H2O - FeSO4.7H2O 0,005 Chuẩn bị 100 ml môi trường AB: - ml dung dịch muối khoáng AB - ml dung dịch đệm AB - 0,5 g glucose - thêm nước cất đủ 100 ml *MÔI TRƯỜNG LB (Luria Bertoni) - Cao nấm men 5g/l - Bactotryptone 10g/l Chỉnh pH 7,5 Dung dịch đệm TAE (50 X stock) - Tris base 242 g/l - Glacial acetic acid 57,1 ml - EDTA 0,5 M pH 100 ml - Nước lên thể tích lít Hấp vơ trùng Hóa chất dùng phản ứng định tính gen lacZ  X-gal 20 mg/ml tan DMSO pha nước cất Lọc vô trùng  IPTG 25 mg/ml pha nước cất Lọc vơ trùng Hóa chất dùng thí nghiệm chuyển gen  Kanamycin 10 mg/ml Pha nước Lọc vô trùng  Acetosyringone mg/ml tan cồn Pha nước Lọc vô trùng  Cefotaxime 200 mg/ml pha nước cất Lọc vô trùng 40 THỐNG KÊ *Title: Bảng Tạo chồi BAP Function: ANOVA-1 Data case no to 18 One way ANOVA grouped over variable (NghiemthucDau2) with values from to Variable (Tao choi2TDZ) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Square Squares F-value Prob Between Within 1435.027 287.005 78.144 0.0000 12 44.073 3.673 Total 17 1479.100 Coefficient of Variation = 13.59% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 0.000 0.000 0.00 1.11 3.00 30.100 10.033 3.35 1.11 3.00 30.000 10.000 0.00 1.11 3.00 86.600 28.867 1.96 1.11 3.00 53.400 17.800 1.91 1.11 3.00 53.700 17.900 1.82 1.11 -Total 18.00 Within 253.800 14.100 1.92 Bartlett's test 41 9.33 2.20 Chi-square = 48.855 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.000 WARNING: One or more factor levels have a variance of zero This will cause a large Chi-Square value Data File : Phan Hang Bảng Tạo chồi BAP Function : RANGE Error Mean Square = 3.673 Error Degrees of Freedom = 12 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 4.780 s_ = 1.106 at alpha = 0.010 x Original Order Mean = 0.0000 Ranked Order D Mean = 28.87 A Mean = 10.03 C Mean = 17.90 B Mean = 10.00 C Mean = 17.80 B Mean = 28.87 A Mean = 10.03 C Mean = 17.80 B Mean = 10.00 C Mean = 17.90 B Mean = 0.0000 D *Title: Bảng Tao choi TDZ2 Function: ANOVA-1 Data case no to 18 One way ANOVA grouped over variable (NghiemthucDau2) with values from to 42 Variable (Tao choi2TDZ) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Freedom Squares Mean Square F-value Prob Between Within 12 3628.598 725.720 81.640 6.803 106.671 0.0000 Total 17 3710.238 Coefficient of Variation = 9.59% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 0.000 0.000 0.00 1.51 3.00 69.900 23.300 3.30 1.51 3.00 89.900 29.967 3.35 1.51 3.00 139.900 46.633 3.35 1.51 3.00 106.500 35.500 1.91 1.51 3.00 83.200 27.733 1.96 1.51 -Total 18.00 489.400 Within 27.189 14.77 3.48 2.61 Bartlett's test Chi-square = 25.883 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.000 WARNING: One or more factor levels have a variance of zero This will cause a large Chi-Square value 43 Data File : Phan Hang Bảng Tao choi MT TDZ Function : RANGE Error Mean Square = 6.803 Error Degrees of Freedom = 12 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 6.505 s_ = 1.506 at alpha = 0.010 x Original Order Ranked Order Mean = 0.0000 D Mean = 46.63 A Mean = 23.30 C Mean = 35.50 B Mean = 29.97 BC Mean = 29.97 BC Mean = 46.63 A Mean = 27.73 C Mean = 35.50 B Mean = 23.30 C Mean = 27.73 C Mean = 0.0000 D *Title: Bang Tao choi BAP +IBA Function: ANOVA-1 Data case no to 18 One way ANOVA grouped over variable ( NghiemthucDau2) with values from to Variable (Tao choi2TDZ) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Square Squares F-value Prob Between Within 12 2827.249 565.450 43.167 3.597 157.191 0.0000 44 Total 17 2870.416 Coefficient of Variation = 10.70% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 0.000 0.000 0.00 1.10 3.00 33.300 11.100 1.91 1.10 3.00 42.900 14.300 2.00 1.10 3.00 123.000 41.000 1.73 1.10 3.00 69.600 23.200 3.30 1.10 3.00 50.300 16.767 0.21 1.10 -Total 18.00 319.100 Within 17.728 12.99 3.06 1.90 Bartlett's test Chi-square = 30.932 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.000 WARNING: One or more factor levels have a variance of zero This will cause a large Chi-Square value Data File : Phan Hang Bang Tao choi BAP +BA Function : RANGE Error Mean Square = 3.597 Error Degrees of Freedom = 12 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 4.730 s_ = 1.095 at alpha = 0.010 45 x Original Order Ranked Order Mean = 0.0000 E Mean = 11.10 Mean = 41.00 A D Mean = 23.20 B Mean = 14.30 CD Mean = 16.77 C Mean = 41.00 A Mean = 14.30 CD Mean = 23.20 B Mean = 11.10 Mean = 16.77 C Mean = 0.0000 D E *Title: Bang Tao choi TDZ 24D Function: ANOVA-1 Data case no to 18 One way ANOVA grouped over variable ( Nghiem thuc Dau 4) with values from to Variable (Tao choi2TDZ) ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Square Squares F-value Prob Between Within 12 6710.732 1342.146 108.793 9.066 148.040 0.0000 Total 17 6819.525 Coefficient of Variation = 9.05% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 0.000 0.000 0.00 3.00 79.900 26.633 3.35 1.74 3.00 99.600 33.200 3.30 1.74 46 1.74 3.00 189.600 63.200 3.30 1.74 3.00 140.000 46.667 3.51 1.74 3.00 90.000 30.000 3.00 1.74 -Total 18.00 599.100 Within 33.283 20.03 4.72 3.01 Bartlett's test Chi-square = 25.341 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.000 WARNING: One or more factor levels have a variance of zero This will cause a large Chi-Square value Data File : Phan Hang Bang Tao choi TDZ 2,4-D Function : RANGE Error Mean Square = 9.066 Error Degrees of Freedom = 12 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 7.509 s_ = 1.738 at alpha = 0.010 x Original Order Mean = 0.0000 Ranked Order D Mean = 63.20 A Mean = 26.60 C Mean = 46.67 B Mean = 33.20 C Mean = 33.20 C Mean = 63.20 A Mean = 30.00 C Mean = 46.67 B Mean = 26.60 C Mean = 30.00 C Mean = 0.0000 47 D Sơ đồ Qui trình tạo chồi bất định từ dĩa dây tây in vitro Cây dâu tây vườn ươm - Cắt bỏ lá, rễ - Ngâm xà phòng1 phút, rửa nước máy - Ngâm cồn 700/1phút, rửa nước cất Khử trùng nước Javel 60%/20 phút Nhân giống môi trường MSB +BAP 0,2 mg/l (5 tuần) *Điều kiện nuôi cấy: - Nhiệt độ: 25+2 0C - Thời gian chiếu sang 12h/ngày - Cường độ ánh sáng 3.000 lux Cắt dĩa (1x1) cm Nuôi cấy tái sinh môi trường DT1,5 (6-8 tuần) *Điều kiện nuôi cấy: - Nhiệt độ: 25+2 0C - Thời gian chiếu sang 12h/ngày - Cường độ ánh sáng 3.000 lux - Cấy chuyển tuần/lần Chồi 1-2 cm (hình thành từ rìa vết cắt, vị trí tiếp giáp cuống mô sẹo) *Điều kiện nuôi cấy: - Nhiệt độ: 25+2 0C - Thời gian chiếu sang 12h/ngày - Cường độ ánh sáng 3.000 lux Ra rễ tạo hồn chỉnh mơi trường MSB (8 tuần) 48 Sơ đồ Qui trình chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens kết hợp xử lý sóng siêu âm Tạo dĩa (1x1) cm (từ nhân giống in vitro) Ủ môi trường DT1,5 (2 ngày) - Điều kiện tối - Nhiệt độ: 25+2 0C Xử lý sóng siêu âm - Ngâm 50ml môi trường DT1,5 lỏng - Xử lý siêu âm tần số 25 khz giây (thiết bị Transsonic (Elma) Ngâm dịch khuẩn A tumefaciens chứa plasmidCAMBIA2301(vi khuẩn nuôi lắc trước qua đêm môi trường AB+kanamycin 50mg/l) -Thấm khô giấy lọc vô trùng Nuôi chung với vi khuẩn ngày môi trường đặc DT1,5 - Điều kiện tối - Nhiệt độ: 25+2 0C Rửa mẫu nuôi chung nhiều lần nước vô trùng Môi trường đặc DT1,5(kanamycin 20 mg/l, cefotaxime 500mg/l) (12 tuần) *Điều kiện nuôi cấy: - Nhiệt độ: 25+2 0C, chiếu sáng 12h/ngày - Cường độ ánh sáng 3.000 lux, cấy truyền tuần/lần Chồi chuyển gen tái sinh (1cm) Chồi rễ môi trường MSB (Kanamycin 20 mg/l, cefotaxime 500mg/l) (4 tuần) *Điều kiện nuôi cấy: - Nhiệt độ: 25+2 0C, chiếu sáng 12h/ngày - Cường độ ánh sáng 3.000 lux, cấy truyền tuần/lần 49 Hình Khử trùng tạo nguồn mẫu dâu tây mơi trường MSB + BAP 0,2 mg/l Hình Chồi tái sinh từ dĩa Hình Sư tái sinh chồi từ dĩa môi trường T1,5 vị trí tiếp giáp cuống mơi A Ở vị trí rìa trường B2 sau 45 ngày B Ở vị trí tiếp giáp cuống Hình Chồi tái sinh từ dĩa Hình Sư tái sinh chồi từ dĩa môi trường DT1,5 vị trí tiếp giáp cuống mơi A Ở vị trí tiếp giáp cuống trường BI2 sau 45 ngày B Ở vị trí rìa Hình 5.1 Sư tái sinh chồi từ dĩa môi trường DT1,5 C Ở mơ sẹo rìa vết cắt 50 D Ở mơ thịt Hình Cây hồn chỉnh mơi trường MSB Hình Tác động gây chết mơ Hình Tác động sóng siêu âm mô dĩa A Dĩa kháng sinh kanamycin sau xử lý sóng siêu âm, B Tái sinh chồi vị trí rìa mơi trường DT1,5 sau 45 ngày đĩa 30 ngày Hình 8.1 Tác động sóng Hình Khuẩn lạc vi khuẩn E siêu âm mô dĩa C Tái coli có hiện sinh chồi vị trí tiếp giáp cuống plasmid pCAMBIA 2301 mơi trường DT1,5 Hình 10 Kết PCR ADN plasmid 2301 tách từ A tumefaciens TC: thang Thang -Hind III 1: pCAMBIA 2301 Hình 11 Chồi chuyển gen giả định tái sinh môi trường DT1,5 + Kanamycin 20 mg/l A Mẫu đối chứng không xử lý chuyển gen B Mẫu xử lý chuyển gen hình thành chồi vị trí tiếp xúc cuống sau 60 ngày C Chồi phát triển sau 90 ngày 51 Hình 11.1 Chồi chuyển gen hình thành rễ mơi trường MSB+Kanamycin 20 mg/l Hình 12 Biểu tạm thời gen gusA chồi chuyển gen Hình 13 Kết PCR gen kháng kanamycin (npt II) TC: thang chuẩn ADN (1kb), 0: plasmid CAMBIA 2301, 1: Mẫu không chuyển gen, 2: Mẫu chuyển gen, 3: Mẫu chuyển gen 52 Tài liệu tham khảo Jame, D J et al (1990) Agrobacterium-mediated transformation of the cultivated strawberry (Fragaria x ananassa Duch.) using disarmed binary vector Plant Science 69: 79-94 Nehra, M S et al (1990a) Agrobacterium-mediated transformation of strawberry calli and recovery of transgenic plants Plant Cell Report 9:1013 Nehra, M S et al (1990b) Genetic transformation of strawberry by Agrobacterium tumefaciens using leaf disk regeneration system Plant Cell Report 9:293-298 Graham, J et al (1995) Agrobacterium-mediated transformation of soft fruit Rubus, Ribes and Fragaria Methods in Molecular Biology Book, Humana Press, Totowa, N.J Vol 44: 129-133 Nguyễn Văn Uyển (1996) Những phương pháp Công nghệ Sinh học Thực vật NXB Nông Nghiệp, tập 1, Trick HN, JJ Finer (1997) SAAT: Sonication Assisted Agrobacteriummediated Transformation Transgenic Research 6:329-336 Liu, Z R and Sanford, J C (1998) Plant regeneration by organogenesis from strawberry leaf and runner tissue HortScience 23:1057-1059 Haymes, K M and Davis, T M (1998) Agrobacterium-mediated transformation of “Alpine” Fragaria vesca, and transmission of transgenes to R1 progeny Plant Cell Report 17: 279-283 Barcelo, M et al (1998) Regeneration and transformation via Agrobacterium tumefaciens of the strawberry cultivar Chandler Plant Cell, Tissue and Organ Culture 54: 29-36, 1998 10 Kristi Lee Whitley (2004) Factors influencing regeneration of plantlets from leaf strips of strawberry (Fragaria x ananassa Duch.) Master thesis of Graduate Faculty of the Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College, USA 53 11.Nhut, D T et al (2005) Callus formation, shoot proliferation and rooting by liquid culture: A novel efficient method for rapid propagation of strawberry (Fragaria vesca L.) Proceedings of Vietnam-Korea International symposium 2005 on Biotechnology and Biosystem engineering, page: 96-100, HCMC Uni of Agriculture and Forestry 54