Microsoft Word Bia doc B K H & C N V C N T P B K H & C N V C N T P Bé Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖn C«ng nghiÖp Thùc phÈm 301 NguyÔn Tr i, Thanh Xu©n, Hµ Néi B¸o c¸o tæng kÕt khoa häc vµ kü thuËt §Ò tµi[.]
B.KH & CN VCNTP B.KH & CN VCNTP Bé Khoa học Công nghệ Viện Công nghiệp Thực phẩm 301 Nguyễn TrÃi, Thanh Xuân, Hà Nội Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật Đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ vi sinh để sản xuất mét sè chÕ phÈm sinh häc dïng c«ng nghiƯp chế biến thực phẩm TS Nguyễn Thị Hoài Trâm 5748 05/4/2006 Hà Nội, 1/2006 Bản quyền 2006 thuộc Viện Công nghiệp Thực phẩm Đơn xin chép toàn phần tài liệu phải gửi đến Viện trởng Viện Công nghiệp Thực phẩm, trừ trờng hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu Danh sách ngời tham gia thực đề tàI TT Họ tên Cơ quan công tác Chủ nhiệm đề tài TS Nguyễn Thị Hoài Trâm Chủ nhiệm đề tài nhánh Viện Công nghiệp thực phẩm Viện CNTP TS Trịnh Thị Kim Vân ThS Lê Thị Mai Hơng Viện CNTP ThS Đỗ Thị Thuỷ Lê Viện CNTP ThS Đỗ Thị Thanh Huyền Viện CNTP KS Phạm Đức Toàn Viện CNTP Cử nhân Nguyễn Thanh Hà Viện CNTP KS Chu Th¾ng ViƯn CNTP KS Bïi Thị Hồng Phơng Viện CNTP 10 ThS Phạm Thị Thu Viện CNTP 11 ThS Trần Minh Hà Viện CNTP 12 ThS Đào Thị Nguyên Viện CNTP 13 ThS Trơng Hơng Lan Viện CNTP 14 Cử nhân Đỗ Thị Lan Hơng Viện CNTP 15 Cử nhân Lê Văn Trọng Viện CNTP Chủ nhiệm đề tài nhánh 16 TS Nguyễn La Anh Viện CNTP 17 KS Đặng Thu Hơng Viện CNTP 18 KS Lê Văn Thắng Viện CNTP 19 ThS Nguyễn Thị Lộc Viện CNTP 20 ThS Ngô Mạnh Tiến Viện CNTP 21 Chủ nhiệm đề tài nhánh Viện Công nghệ Sinh học Công PGS TS Phạm Thu Thuỷ nghệ thực phẩm, Trờng Đại học Bách khoa Hà Nội 22 TS Quản Lê Hà Viện CNSH & CNTP, ĐHBKHN 23 ThS Vơng Nguyệt Minh Viện CNSH & CNTP, ĐHBKHN 24 Cử nhân Là Thị Quỳnh Nh Viện CNSH & CNTP, ĐHBKHN 25 ThS Lê Lan Chi Viện CNSH & CNTP, ĐHBKHN 26 ThS Phùng Thị Thủy Viện CNSH & CNTP, ĐHBKHN 27 KS Trần Xuân Diệu Viện CNSH & CNTP, ĐHBKHN 28 Cử nhân Phạm Thị Quỳnh Viện CNSH & CNTP, ĐHBKHN Chủ nhiệm đề tài nhánh Viện Công nghệ sinh học, 29 TS Phạm Thuý Hồng 30 PGS.TS Trơng Nam Hải Viện CNSH, VKH &CNVN 31 CN Trần Thị Hờng ViƯn CNSH, VKH &CNVN 32 CN Ngun Thanh Thủ ViƯn CNSH, VKH &CNVN 33 ThS Đỗ Thị Huyền Viện CNSH, VKH &CNVN 34 ThS Ngun ThÞ Trung ViƯn CNSH, VKH &CNVN 35 ThS Trần Ngọc Tân Viện CNSH, VKH &CNVN 36 CN Đặng Trần Hoàng Viện CNSH, VKH &CNVN 37 CN Ngun Hång Thanh ViƯn CNSH, VKH &CNVN 38 KS Nguyễn Thị Kim Hoa Công ty Cổ phần Bánh kẹo Hải Hà 39 ThS Trịnh Sỹ 40 KS Đỗ Huy Toàn Viện Khoa học Công nghệ VN Công ty Cổ phần Tràng An Công ty Cổ phần Bánh kẹo Hữu Nghị BàI tóm tắt Vấn đề đảm bảo chất lợng vệ sinh an toàn sản phẩm thực phẩm đợc Nhà nớc Việt Nam đặc biệt quan tâm Xu hớng sử dụng thực phẩm có nguồn gốc thiên nhiên, an toàn, không độc hại, có lợi cho sức khoẻ giá trị dinh dỡng chức phòng chống bệnh tật đợc giới quan tâm Đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nớc KC - 04 - 27 đà thực nghiên cứu, sản xuất thực nghiệm ứng dơng mét sè s¶n phÈm tõ vi sinh vËt nh− chất màu -caroten, chất nhũ tơng hoạt động bề mỈt glycolipit Mannosylerythritol lipids (MELs), dÉn xt cđa axÝt amin S-adenosyl L-methionine (SAM) chÕ biÕn mét sè s¶n phÈm thực phẩm Trong trình thực hiện, đề tài đà sử dụng phơng pháp nghiên cứu thông dụng lĩnh vực công nghệ vi sinh, lên men, chế biến thực phẩm Các phơng pháp phân tích vi sinh vật, hoá lý, sắc ký đà đợc thực thiết bị thông dụng đại nh sắc ký lỏng cao áp, sắc ký cột tinh protein, quang phổ hấp thụ nguyên tử để đảm bảo số liệu nghiên cứu xác đáng tin cậy Phơng pháp xử lý giống vi sinh vật hoá chất đột biến đà đợc thử nghiệm để nâng cao khả tổng hợp -caroten chủng nấm sợi Blakeslea trispora Các thiết bị nuôi cấy vi sinh vật theo phơng pháp chìm, hiếu khí đà đợc sử dụng có hiệu quy mô phòng thí nghiệm nh loại máy lắc, bình lên men 14 lít quy mô xởng thực nghiệm nh hệ thống thùng lên men 80, 500 1500 lít Đề tài đà khảo sát, lựa chọn, sử dụng biện pháp công nghệ, thiết bị chế độ lên men phù hợp để nâng cao hoạt tính chủng nấm sợi Blakeslea trispora tổng hợp -caroten đạt từ 2580-4930 mg/L, chủng nấm men Pseudozyma antarctica P aphidis sinh chuyển hoá tổng hợp MELs đạt 80-130 g/L chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae S carlbergensis tổng hợp SAM đạt 10-18,5% so với sinh khối khô Các kết đà vợt số liệu nghiên cứu đà đợc công bố giới điều kiện nghiên cứu sản xuất tơng tự Các phơng pháp tách chiết, tinh sạch, phân tích đà đợc nghiên cứu lựa chọn để ứng dụng phòng thí nghiệm xởng thực nghiệm để tạo sản phẩm bán sản phẩm -caroten MELs, SAM đạt tiêu thành phần chất lợng vệ sinh an toàn thực phẩm Lần đầu tiên, đề tài đà nghiên cứu ứng dụng thành công công nghệ vi nang hoá sử dụng phơng pháp nhũ hoá-sấy phun để tạo đợc bột màu β-caroten tan n−íc tõ nguyªn liƯu β-caroten tan dầu sản xuất theo quy trình công nghệ vi sinh Các sản phẩm nghiên cứu, sản xuất thử đề tài đà đợc nghiên cứu ứng dụng sản xuất đại trà 3,5 kẹo, 6,65 bánh quy kẹp kem, xốp kem dùng sản phẩm sản xuất theo công nghệ vi sinh -caroten thay phẩm màu tổng hợp hoá học, MELs thay cho chất nhũ hoá Lecithin, chứa hoạt chất sinh học SAM có lợi cho sức khoẻ ngời tiêu dùng Công ty Cổ phần bánh kẹo Hải Hà, Tràng An, Hữu Nghị, Hơng Sen, Phát Việt Tùng Lâm Ngoài kết đạt đợc nghiên cứu, sản xuất thực nghiệm ứng dụng công nghiệp chế biến bánh kẹo, đề tài đà tham gia đào tạo 13 sinh viên tốt nghiệp đại học, thạc sĩ có cán khoa học quan chủ trì đề tài, góp phần nâng cao trình độ cán khoa học quan hợp tác thực đề tài lĩnh vực vi sinh, lên men, phân tích chế biến thực phẩm Với kết đà đạt đợc, đề tài mong muốn tiếp tục đợc nghiên cứu hoàn thiện công nghệ, dây chuyền thiết bị sản xuất thực thử nghiệm lâm sàng tác dụng chức sản phẩm -caroten, MELs SAM sức khoẻ ngời Để đa sản phẩm -caroten, MELs SAM đợc thị trờng, đề tài mong muốn Bộ Khoa học Công nghệ ủng hộ để thực Dự án sản xuất giai đoạn 2007-2010 Mục lục STT Tiêu đề Mở đầu Trang 1 Chơng Tỉng quan 1.1 Giíi thiƯu vỊ carotenoit vµ -caroten 1.1.1 Khái quát carotenoit -caroten 1.1.2 Tính chất, chức ứng dụng -caroten 1.1.2.1 Tính chất -caroten 1.1.2.2 Chức ứng dụng -caroten 1.1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng -caroten 10 1.1.3.1 Tình hình nghiên cứu ứng dụng -caroten giới 10 1.1.3.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng -caroten ViƯt Nam 11 1.1.4 Giíi thiƯu vỊ nÊm sỵi Blakeslea trispora 11 1.1.4.1 Giíi thiƯu chung vỊ nÊm sỵi Blakeslea trispora 11 1.1.4.2 Đặc điểm hình thái sinh sản loài Blakeslea trispora 15 1.1.4.3 Quá trình tổng hợp -caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora 21 1.1.5 ảnh hởng môi trờng điều kiện nuôi cấy tới trình sinh 21 tỉng hỵp β-caroten cđa Blakeslea trispora 1.1.6 1.1.6.1 1.1.6.2 Vi nang phơng pháp tạo vi nang Giới thiệu công nghệ vi nang hoá vi nang Các phơng pháp tạo vi nang 1.2 giớI thiệu chất hoạt động bề mặt sinh học 25 25 27 32 glycolipit mannosylerythritol lipit (MELs ) 1.2.1 1.2.1.1 1.2.1.2 1.2.1 1.2.1.4 1.2.1.5 1.2.2 1.2.2.1 1.2.2.1.1 1.2.2.1.2 Phân loại chÊt bỊ mỈt sinh häc cã ngn gèc vi sinh Glycolipit Lipopeptit vµ lipoprotein Axit bÐo, photpholipit vµ lipit trung tÝnh ChÊt bỊ mỈt sinh häc polymer ChÊt bỊ mỈt sinh học dạng hạt Quá trình sinh tổng hợp chuyển hoá tạo glycolipit Các chế vi sinh vật sản xuất glycolipit Phơng pháp tổng hợp sinh học (Biosynthetic) Phơng ph¸p chun ho¸ sinh häc (Biotransformation) 32 33 36 36 36 37 37 37 37 38 1.2.2.2 Mét sè qu¸ trình sản xuất glycolipit 38 1.2.3 1.2.3.1 Những ứng dụng chất sinh học hoạt động bề mặt Khả xử lý dầu tràn biển 40 41 1.2.3.2 Khả cải tạo đất 41 1.2.3.3 1.2.3.4 1.2.3.5 Khả cải tạo đất bị ô nhiễm kim loại Khả làm dầu thiết bị lu trữ Những nghiên cứu ứng dụng công nghiệp thực phẩm dợc phẩm Tình hình nghiên cứu, sản xuất ứng dụng MELs giới Việt Nam 42 42 42 giíi thiƯu vỊ dÉn xt cđa axÝt amin 45 1.2.4 1.3 44 S-adenosyl-L-methionine (SAM) 1.3.1 1.3.1.1 1.3.1.2 1.3.1.2.1 1.3.1.2.2 1.3.2 1.3.2.1 Giíi thiƯu vỊ SAM - Tính chất công dụng Tính chất SAM Những øng dơng chÝnh cđa SAM SAM - chÊt chèng trÇm cảm tự nhiên SAM chất siêu dinh dỡng gan Các phơng pháp tổng hợp SAM Tổng hợp SAM b»ng ®−êng hãa häc 45 47 49 49 52 58 58 1.3.2.2 1.3.2.3 1.3.3 1.3.3.1 Tỉng hỵp SAM b»ng đờng enzyme Tổng hợp SAM vi sinh vật Tổng hợp SAM từ nấm men, yếu tố ảnh hởng Đặc điểm chung nấm men Saccharomyces 58 59 60 60 1.3.3.2 øng dơng cđa nÊm men S cerevisiae 62 1.3.3.3 Sinh tỉng hỵp SAM tõ nÊm men Saccharomyces 63 1.3.4 1.3.5 1.3.5.1 1.3.5.2 Thu hồi tạo sản phẩm SAM từ nấm men Tình hình nghiên cứu sản xuất ứng dụng SAM Tình hình nghiên cứu sản xuất ứng dụng SAM giới Tình hình nghiên cứu sản xuất ứng dụng SAM Việt Nam 66 68 68 69 71 Chơng Nguyên vật liệu phơng pháp nghiên cứu 2.1 Vi sinh vật điều kiện nuôi cấy 71 2.1.1 Vi sinh vật điều kiện nuôi cấy tổng hợp -caroten 71 2.1.2 2.1.3 Vi sinh vật điều kiện nuôi cấy tổng hợp MELs Vi sinh vật điều kiện nuôi cÊy tỉng hỵp SAM 72 73 2.1.4 2.2 2.2.1 Tỉng hợp thông tin chủng giống vi sinh vật nhập ngoại Phơng pháp nghiên cứu Các phơng pháp xử lý dịch lên men, tách chiết sinh khối nấm sợi, 75 76 76 phân tích tạo sản phẩm chất màu -caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora 2.2.2 Các phơng pháp thu nhận, tách chiết, phân tích tạo sản phẩm MELs từ nấm men Pseudozyma 77 2.2.3 Các phơng pháp thu nhận, tách chiết, phân tích tạo s¶n phÈm chøa SAM tõ nÊm men Saccharomyces 77 2.2.3.1 2.2.3.2 2.2.3.3 2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4 Phơng pháp trích ly SAM dung môi Phơng pháp làm SAM Phơng pháp đông khô Phơng pháp phân tích Phơng pháp quang phổ Phơng pháp sắc ký mỏng Phơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Phơng pháp xử lý ®ét biÕn nÊm sỵi Blakeslea trispora tỉng hỵp 77 78 79 80 80 82 83 84 -caroten 2.3.5 Phơng pháp phân tích thành phần vệ sinh an toàn thực phẩm 87 sản phẩm, bán sản phẩm -caroten, MELs SAM 2.4 2.4.1 Các phơng pháp tạo sản phẩm 87 87 2.5 Phơng pháp tạo sản phẩm bột màu -caroten công nghệ vi nang hoá Phơng pháp tạo sản phẩm chứa hoạt chất sinh học SAM Thiết bị sử dụng nghiên cứu, sản xuất thực nghiệm 2.5.1 Các thiết bị trích ly, phân tích, tinh 90 1.5.2 Các thiết bị lên men 90 2.5.3 Các thiết bị thu hồi, tạo sản phẩm 91 Chơng Kết bàn luận 92 3.1 Kết nghiên cứu, sản xuất ứng dụng chất 92 2.4.2 89 90 màu -caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora 3.1.1 Khảo sát, lựa chọn nghiên cứu nâng cao hoạt tính tổng hợp caroten chủng nấm sợi Blakeslea trispora 92 3.1.1.1 Khảo sát khả phát triển sinh tổng hợp -caroten từ chủng nấm sợi B trispora môi trờng nhân giống lên men 92 3.1.1.2 Nghiên cứu ảnh hởng thành phần môi trờng điều kiện 99 nuôi cấy tới trình sinh tổng hợp -caroten chủng B trispora 3.1.2.1.1 ảnh hởng thành phần môi trờng đến tổng hợp -caroten 99 chủng B trispora 3.1.1.2.2 ảnh hởng điều kiện nuôi cấy đến tổng hợp -caroten 104 chủng B trispora Nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp -caroten chủng B trispora 107 3.1.1.3.1 Nghiên cứu bổ sung số chất đặc biệt nh chất hoạt động bề 107 3.1.1.3 mặt, tiền chất có cấu trúc vòng 3.1.1.3.2 Nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp -caroten chủng B 108 trispora WH2 phơng pháp xử lý đột biến 3.1.1.4 3.1.2 Kết nuôi cấy chủng nấm sợi B trispora môi trờng điều kiện nuôi cấy chọn lọc quy mô phòng thí nghiệm Tìm điều kiện công nghệ thích hợp để lên men quy mô phòng thí nghiệm xởng thực nghiệm thu nhận sinh khối nấm 111 113 sợi giàu -caroten 3.1.2.1 3.1.2.2 3.1.3 Kết lên men thiết bị dung tích 14 lít Phòng thí nghiệm Kết lên men thiết bị dung tích 500 1500 lít Xởng thực nghiệm Nghiên cứu điều kiện tách chiết, trích ly, tinh sạch, phân tích 113 114 115 tạo sản phẩm bột màu thực phẩm -caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora quy mô phòng thí nghiệm xởng thực nghiệm 3.1.3.1 Nghiên cứu điều kiện tách chiết -caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora 115 3.1.3.2 Tinh dịch chiết -caroten 117 3.1.3.3 Thu hồi dung dịch đậm đặc tạo sản phẩm -caroten tan dầu Nghiên cứu điều kiện công nghệ để tạo sản phẩm bột màu thực 119 3.1.3.4 phẩm -caroten từ nấm sợi B trispora quy mô phòng thí nghiệm xởng TN 120 3.1.3.4.1 Tạo vi nang phơng pháp bốc dung môi 3.1.3.4.2 Tạo vi nang phơng pháp tách pha đông tụ 3.1.3.4.3 Tạo bột -caroten công nghệ vi nang ho¸ : nhị ho¸ - sÊy phun 3.1.4 Hoàn thiện công nghệ sản xuất chế phẩm bột màu -caroten từ 3.1.5 nấm sợi Blakeslea trispora quy mô xởng thực nghiệm hệ thống thiết bị lên men dung tích 500 1500 lít Kiểm tra, phân tích tiêu, chất lợng vệ sinh an toàn thùc 120 122 127 131 134 phÈm cđa s¶n phÈm -caroten từ nấm sợi Blakeslea trispora 3.1.6 Nghiên cứu ứng dụng chất màu -caroten từ nấm sợi Blakeslea 137 3.1.6.1 3.1.6.2 3.1.7 trispora chÕ biÕn, s¶n xuÊt mét sè loại bánh, bánh kem, kẹo quy mô phòng thí nghiệm quy mô công nghiệp Quy trình sản xuất kẹo mềm Quy trình sản xuất bánh quy kẹp kem Nghiên cứu tính toán giá thành, hiệu kinh tế sản xuất 137 138 140 ứng dụng sản phẩm bột màu -caroten từ vi sinh vật Đăng ký, giới thiệu, chào bán công nghệ sản phẩm 3.2 Kết nghiên cứu, sản xuất ứng dụng chất nhũ tơng hoá hoạt động bề 143 mặt glycolipids mannosylerythritol lipids (MELs) 3.2.1 3.2.1.1 3.2.1.2 3.2.1.3 3.2.2 3.2.2.1 3.2.2.2 3.2.2.3 3.2.3 Khảo sát lựa chọn nghiên cứu nâng cao hoạt tính chủng giống nâm men sinh tổng hỵp chun hãa glycolipids mannosylerythritol lipids (MELs) Chän läc chđng giống nấm men sinh chuyển hóa MELs Xác định đặc tÝnh sinh lý sinh ho¸ cđa chđng nÊm men lùa chọn Nghiên cứu điều kiện nâng cao hoạt tính chđng gièng nÊm men sinh tỉng hỵp glycolipids mannosylerythritol lipids (MELs) Tìm điều kiện công nghệ thích hợp để lên men quy mô phòng thí nghiệm xởng thực nghiệm để sinh chuyển hóa MELs Nghiên cứu điều kiện công nghệ thích hợp lên men sinh chuyển hóa MELs quy mô máy lắc Nghiên cứu điều kiện công nghệ thích hợp lên men tổng hợp MELs quy mô 14 lít Xác định điều kiện công nghệ thích hợp lên men tổng hợp MELs quy mô 500 lít Tìm điều kiện công nghệ, thiết bị thích hợp quy mô phßng thÝ 143 143 146 149 151 151 156 158 159 Nguyễn Thanh Hà Luận văn Thạc sỹ Khoa học (c) (d) (e) (f) Bằng cách cấy lại từ môi tr−êng CM 17-1 cã bỉ sung kh¸ng sinh lovastatin sang môi trờng hoạt hoá giống PDA, bào tử phát triển tốt môi trờng đợc dùng để lên men qui mô máy lắc Kết lên men chủng xử lý đột biến (đợc đặt tên B trispora MTH2) cho thấy hàm lợng sinh khối khô hầu nh thay đổi đáng kể nào, nhiên hàm lợng betacaroten tăng lên cao (4717 mg/l), gấp khoảng 2,02 lần so với đối chứng, với lợng EMS bổ sung lµ 200 ul cho x 107 bµo tư Xư lý giống EMS với liều lợng thấp tác dụng nâng cao khả tổng hợp betacaroten chủng WH2 74 Nguyễn Thanh Hà Luận văn Thạc sỹ Khoa học Bảng 14: Kết qủa lên men chủng xử lý đột biến chủng B trispora WH2 hoá chất đột biến EMS Nồng độ EMS Hàm lợng Hàm lợng (ul/1ml dung dịch giống sinh khối khô beta-caroten huyền phù) (g/l) (mg/l) §èi chøng 24,1 2325 30 22,0 1153 60 23,0 1129 90 23,1 1320 100 23,0 3659 150 22,2 3122 200 24,0 4717 STT Nhóm nghiên cứu đà sử dụng chủng đột biến cho thí nghiệm lên men có bổ sung tiền chất thời điểm 48 sau tiếp giống Kết phân tích cho thấy với việc bổ sung riêng rẽ tiền chất (0,075% Isoniazid 1M; 0,075% beta ionone; 4% kerosen) vào môi trờng lên men đà làm tăng hàm lợng beta-caroten tơng ứng chủng đột biến lên khoảng 1,26 lần so với đối chứng Trái với dự đoán ban đầu, bổ sung phối hợp chất nh kerosen + beta ionone, kerosen + isoniazid, hàm lợng beta-caroten hầu nh không thay ®ỉi so víi ®èi chøng B¶ng cho thÊy kÕt qu¶ nghiên cứu sơ việc bổ sung tiền chất vào môi trờng lên men thời điểm 48 sau tiếp gống 75 Nguyễn Thanh Hà Luận văn Thạc sỹ Khoa học Bảng 15: Kết khảo sát bổ sung tiền chất vào môi trờng lên men chủng B trispora MTH2 STT Tên tiền chất Hàm lợng Hàm lợng sinh khối khô beta-caroten (g/l) (mg/l) §èi chøng 24,0 4717 Isoniazid 23,9 5895 Beta ionone 24,3 5938 Kerosen 23,5 5950 Kerosen + Beta ionone 24,6 4840 Kerosen + isoniazid 23,8 4713 3.2.3 KÕt hỵp xư lý gièng WH2 (-) b»ng EMS chiếu tia tử ngoại Sau giống WH2 đợc xử lý EMS đợc tiếp tục xử lý cách chiếu tia tử ngoại với cờng độ chiếu sáng klux thời gian chiếu khác 30, 60 90 phút Các kết nghiên cứu cho thấy việc chiếu tia tử ngoại vào giống sau đà xử lý hoá chất EMS tác dụng làm nâng cao khả tổng hợp beta-caroten chủng đột biến B trispora MTH2 Bảng 16: Kết hợp xử lý giống hoá chất EMS chiếu tia tử ngoại STT Thời gian xử lý giống Hàm lợng Hàm lợng (phút) sinh khối khô beta-caroten (g/l) (mg/l) 30 24,0 5858 60 23,9 5863 90 24,2 5798 Đối chúng (không chiếu tia) 24,3 4717 76 Nguyễn Thanh Hà Luận văn Thạc sỹ Khoa học Bảng 17 cho thấy khả tổng hợp beta-caroten chủng B trispora WH2 đà xử lý giống phơng pháp khác nh dùng tia tử ngoại, xử lý hoá chất EMS, kết hợp xử lý hoá chất EMS chiếu tia tử ngoại Bảng 17: Tổng hợp phơng pháp xử lý giống B trispora WH2 STT Phơng pháp xử lý giống Hàm lợng Hàm lợng sinh khối khô beta-caroten (g/l) (mg/l) Đối chứng (không xử lý) 24,1 2325 Chiếu tia tử ngoại 23,7 2340 Kết hợp xử lý EMS 24,0 5864 24,0 4717 chiÕu tia tư ngo¹i Xư lý b»ng ho¸ chÊt EMS Nh− vËy, viƯc xư lý b»ng ho¸ chÊt EMS ë chđng B trispora WH2 cã khả nâng cao hiệu suất tổng hợp beta-caroten lên gấp 2,02 lần so với đối chứng Kết hợp biện pháp xử lý EMS chiếu tia làm tăng hàm lợng beta-caroten thu nhận sau lên men gấp 2,52 lần so với đối chúng Biện pháp xử lý giống chiếu tia tử ngoại với cờng độ chiếu sáng klux thời gian chiếu sáng 30, 60, 90 phút tác dụng nâng cao hàm lợng beta-caroten 77 Nguyễn Thanh Hà Luận văn Thạc sỹ Khoa học Hình 27: So sánh hàm lợng beta-caroten (mg/l) thu nhËn tõ sinh khèi Hàm lượng beta-caroten (mg/l) chủng B trispora WH2 với phơng pháp xử lý gièng 6000 5000 4000 3000 2000 1000 Đối chứng 3.3 EMS EMS+UV UV Kết nghiên cứu khả tổng hợp beta-caroten môi trờng lên men sử dụng chủng giống có giới tính đối lập B trispora WH1, NBRC 5989, WH2 chủng đột biến TMH2 Để kiểm tra chủng giống có giới tính đối lập có khả giao phối với hay không, nhóm nghiên cứu đà tiến hành cấy hai chủng có giới tính đối lập mô trờng minimal agar 78 Nguyễn Thanh Hà Luận văn Thạc sỹ Khoa học Hình 28: KiĨm tra sù phèi gièng cđa hai chđngcã giíi tính đối lập B trispora WH1 WH2 môi trờng Minimal agar Các thí nghiệm khảo sát kkhả tổng hợp beta-caroten nuôi cấy phối hợp hai chủng giống có giới tính đối lập với tỷ lệ phối hình thức tiếp giống đà đợc thực hiện, dới điều kiện xác định (nguồn dinh dỡng glucose/cao ngô 50/50 g/l, không bổ sung tiền chất, 1% Span 20 víi cỈp WH1- WH2, WH1- MTH2, 0,6% Span 20 cặp phối NBRC 5989 WH2, pH môi trờng ban đầu 11, nhiệt độ lên men kiểm soát 280C, lắc 250 vòng/phút máy lắc tròn, bình tam giác 500 ml với thể tích dịch lên men 75 ml) Nghiên cứu đợc thực với tỷ lệ giống phối hai chủng đực (+) (-) -1; 1-2; 1-5, 10 Giống đợc tiếp dới dạng bào tử huyền phï (WH1, WH2 vµ MTH2) hay gièng cÊp (NBRC 5989) Kết nghiên cứu sơ cho thấy hàm l−ỵng sinh khèi phèi hai gièng cã giíi tÝnh đối lập tăng cao gấp khoảng 1,2 1,5 lần so với nuôi cấy riêng rẽ chủng Đồng thời hàm lợng beta-caroten tăng lên cao phối hai gièng cã giíi tÝnh ®èi lËp víi tû lƯ tiÕp giống 1-2 cho WH1 - WH2, đạt 4026 mg/l môi trờng, tỷ lệ 1-5 áp dụng cho cặp MMTH2 - WH1, đạt 5095 mg/lít môi trờng Đối với cặp NBRC 5989 WH2 cho hàm lợng sinh khối khô cao (trung bình 42,6 g/l) nhng hiệu tổng hợp beta-caroten không cao Bảng cho thấy tỷ lệ phối giống có ảnh hởng nh đến hàm lợng beta-caroten 79 Nguyễn Thanh Hà Luận văn Thạc sỹ Khoa häc B¶ng 18: ¶nh h−ëng cđa tû lƯ phèi gièng đến khả tổng hợp beta-caroten phối giống cã giíi tÝnh ®èi lËp B trispora WH1, WH2, MTH2 NBRC 5989 STT Cặp giống phối Tỷ lệ Hàm lợng Hàm lợng tiếp giống sinh khối khô beta-caroten (v/v) (g/l) (mg/l) 1–1 32,9 2338 1–2 33,0 4026 1–5 34,8 3987 1–1 36,3 1187 1-2 36,0 1259 1-5 37,0 1263 -1 33,4 4250 1-2 33,0 4986 1-5 35,1 5095 WH1 - WH2 NBRRC 5989 – WH2 WH1 TMH2 Hình 29: Kết kiểm tra beta-caroten HPLC chuẩn tách chiết từ cà rốt (a) vµ cđa mÉu phèi hai chđng B trispora WH1 – WH2 (b) 15 10 1: 455 nm, nm betacaten02 bata.28.3002 1: 455 nm, nm betacaten05 bata.28.3005 Retention Time Name Retention Time Name 10 B e ta cro te n e 0 6 9 B e ta cro te n e mAU mAU 5 10 12 14 Minutes Minutes (a) (b) 80 10 12 14 NguyÔn Thanh Hà Luận văn Thạc sỹ Khoa học Đặc biệt, tiến hành lên men bình 2000 ml phối hai chđng WH1 vµ WH2 víi tû lƯ tiÕp gièng 2, với chế độ lắc 150 vòng/phút kèm theo có sục khí vô trùng, thời gian lên men 70 với cho hàm lợng beta-caroten tăng cao 4876 mg/l Tiếp nối nghiên cứu trên, thí nghiệm lên men đợc thực qui mô thiết bị lên men Draft tube 14 lít với dung tích làm việc 10 lít sử dụng cho cặp giống WH1 MTH2 Các thông số lên men nh nhiệt độ trì 270, pH, tốc độ khuấy đợc trì ổn định nhờ đầu dò có gắn với hệ thống máy tính Nguồn dinh dỡng glucose, bột nấm men, pepton, bột cao ngô công nghiệp Quá trình lên men khổng bổ sung Span 20, với nồng độ dầu hớng dơng 2,7% Thời gian lên men 64 Kết thu đợc lợng sinh khối khô đạt 84 g/lít môi trờng hàm lợng beta-caroten đạt 4117 mg/lít môi trờng Hình 30: ảnh chụp lên men thiết bị lên men Draft Tube (a) thu håi sinh khèi (b) cña chñng phèi B trispora WH1 – MTH2 (a) (b) 81 Ngun Thanh Hµ Ln văn Thạc sỹ Khoa học 3.4 Nghiên cứu phơng pháp tách chiết beta-caroten từ sinh khối nấm sợi thu nhận sau lên men a Tách chiết beta-caroten qui mô phòng thí nghiệm Sinh khối thu nhận sau lên men qui mô máy lắc đợc lọc kỹ rửa nớc cất ba lần, sau sấy khô 400C 24 giê cã thĨ dïng ®Ĩ chiÕt b»ng dung môi thích hợp cho phân tích hàm lợng beta-caroten Hình 31: Thu hồi sinh khối sau lên men (a) tách chiết betacaroten (b) chủng B trispora WH2 qui mô phòng thí nghiệm (a) (b) Kết nghiên cứu cho thấy, tách chiết dung môi n hexan cho hiệu chiết rút cao từ 1,28 đến 1,52 lần so với tách chiết hỗn hợp n hexan/aceton với tỷ lệ 6/4, lợng beta-caroten thu nhận đợc thấp khoảng 35 % so víi chiÕt b»ng n-hexan B¶ng 19 cho ta thấy khả chiết beta-caroten với dung môi khác 82 Nguyễn Thanh Hà Luận văn Thạc sỹ Khoa học Bảng 19: Khả tách chiết beta-caroten từ sinh khối nấm sợi B trispora dung môi khác N - hexan Tên mẫu N - hexan/aceton V chiÕt Beta-caroten V chiÕt (ml/1 Beta- (ml/1g sinh (mg/L) gam sinh caroten khèi) (mg/L) khèi) WH1 35 825,6 23 542,5 WH2 35 2325 28 1527,8 NBRC 5989 35 796,7 23 523,5 MTH2 38 4717 30 3723 b T¸ch chiÕt beta-caroten qui mô xởng thực nghiệm Sinh khối sau lên men qui mô lớn đợc tách chiết theo phơng pháp có cải tiến Qui trình tách chiết đợc thể sơ đồ Kiểm tra ®éc tè nÊm mèc aflatoxin cã sinh khèi thu nhận từ trình lên men 83 Nguyễn Thanh Hà Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sơ đồ 1: Qui trình công nghệ tách chiết beta-caroten từ sinh khối thu nhận từ trình lên men chìm qui mô bình lên men 14 lít Sinh khối nấm sợi B.trispora sau lªn men HÊp ë 1210C 15 NghiỊn học Bổ sung ethanol tỷ lệ 1/50 Trộn 300C, Dịch beta-caroten 84 Nguyễn Thanh Hà Luận văn Thạc sỹ Khoa học Chơng 4: Kết luận đề nghị 4.1 Kết luận Sau thời gian nghiên cứu, nhóm nghiên cứu đà nhận đợc kết nh sau: Đà tiến hành khảo sát lên men tách chiết beta-caroten thu nhận từ sinh khối nấm sợi chủng B trispora WH1, WH2, NBRC 5989 qui mô máy lắc sử dụng nguồn dinh dỡng thích hợp cho trình lên men Nguồn cacbon thích hợp đợc sử dụng glucose (50 g/l), nguồn nitơ thích hợp cao ngô (50g/l) pepton (10g/l), lên men nhiệt độ 27-280C bình tam giác 500 ml với thể tích dịch lên men 75 ml, chế độ lắc 250 vòng/phút máy lắc tròn, pH ban đầu môi trờng 11 áp dụng cho chủng WH1, WH2 10 cho chủng NBRC 5989 Hàm lợng beta-caroten cho hàm lợng cao nuôi cấy riêng rẽ chủng B trispora WH2 (1150 mg/l), tiếp WH1 (740,3 mg/l) cuối NBRC 5989 (177,9 mg/l) Đặc biệt lên men máy lắc công nghiệp với thành phần dinh dỡng đợc trì nh bình tam giác lít thể tích dịch lên men 300 ml, chế độ lắc 150 vòng/phút cho hàm lợng sinh khối khô tăng chủng WH1 (44,5 g/l) WH2 (45 g/l) hàm lợng beta-caroten tơng ứng đạt 987,8 1659 mg/lít môi trờng; Việc bổ sung chất hoạt động bề mặt Span với nồng độ 1% áp dơng cho chđng WH1, WH2 vµ 0,6% víi chđng NBRC 5989 có ảnh hởng tích cực đến hình thái sinh khối, từ dạng vón cục sang dang phân tán, đặc biệt hàm lợng beta-caroten tăng đáng kể nuôi cấy riêng rẽ chủng WH1, WH2, NBRC 5989 tơng øng lµ 891,9; 1424; vµ 235,8 85 Ngun Thanh Hµ Luận văn Thạc sỹ Khoa học mg/l môi trờng, trung bình tăng từ 1,2 đến 1,3 lần so với đối chứng (không bổ sung Span 20); Bổ sung chất kích thích vào môi trờng lên men thời ®iĨm 48 giê sau tiÕp gièng cã ¶nh h−ëng lớn đển khả tổng hợp betacaroten ba chủng nấm sợi với Isonia id nồng độ 0,0075%, beta ionone nồng độ 0,0075% kerosen 4% hay bổ sung hỗn hợp chất (4%kerosen+0,0075% ; 4% kerosen +0,0075% ) có tác dụng làm tăng hàm lợng beta-caroten Bổ sung hỗn hợp 4% kerosen 0,0075% Isonia id cho hàm lợng beta-caroten chủng B trispora WH1 1031 mg/l (tăng 1,4 lần so với đối chúng) Với chủng WH2, với nồng độ beta ionone đợc bổ sung 0,0075% cho hàm lợng betacaroten 2325 mg/l (tăng lần so với đối chứng) Riêng với NBRC 5989 bổ sung kerosen 4% vào môi trờng lên men cho hàm lợng beta-caroten tăng lên 4,48 lần so với đối chứng (796,7 mg/l); Đà tiến hành lên men thiết bị lên men Draft tube chủng B trispora WH2 sử dụng hỗn hợp nguồn dinh dỡng cacbon nitơ công nghiệp, với chế độ khí, gió, chế độ khuâý trì ổn định, cho hàm lợng sinh khối khô hàm lợng beta-caroten tăng cao, 69,9 g/l 1979 mg/l môi trờng; Việc xử lý giống hoá chất đột biến EMS, kết hợp xử lý hoá chất chiếu tia tử ngoại có tác dụng làm nâng cao khả tổng hỵp beta-caroten ë chđng B trispora WH2 (4717, 5864 mg/lÝt môi trờng) Bổ sung riêng rẽ tiền chất môi trờng lên men chủng đột biến B trispora MTH2 có tác dụng làm tăng cao hàm lợng betacaroten Chiếu tia tử ngoại với cờng độ chiếu sáng klux tác dụng làm tăng hàm lợng beta-caroten chủng WH2; Đà tiến hành thực phối chủng giống có giới tính đối lập xác định tỷ lệ phối 1/2 với cặp WH1/WH2và 1/5 cho cặp WH1/MTH2 cho 86 Nguyễn Thanh Hà Luận văn Thạc sỹ Khoa học hàm lợng sinh khối khô tăng cao gấp từ 1,4 đến 1,6 lần so với nuôi cấy riêng rẽ chủng, hàm lợng beta-caroten tơng ứng 4026 5075 mg/l môi trờng Tiến hành lên men thiết bị lên men Draft tube cặp giống phốilà WH1/MTH2 thu đợc hàm lợng sinh khối khô hàm lợng beta-caroten tơng ứng là84 g/l 4117 mg/lít mơi trờng; Đà thực nghiên cøu vỊ t¸ch chiÕt beta-caroten tõ sinh khèi thu nhËn sau lên men qui mô máy lắc thiết bị lên men Tách chiết dung dịch n-hexan có bỉ sung chÊt chèng oxy ho¸ cho hiƯu st t¸ch chiết cao so với việc tách chiết hỗn hợp n-hexan/aceton tỷ lệ 6/4 từ 1,28 đến 1,52 lần; Đà tiến hành kiểm tra độc tố nấm mốc aflatoxin B1, B2, G1, G2 phơng pháp sức ký lỏng cao áp (HPLC) Sắc ký đồ cho thấy với khối lợng mẫu phân tích gam, giới hạn cho phép có mặt aflatoxin đợc xác định đợc chấp nhận 87 Nguyễn Thanh Hà Luận văn Thạc sỹ Khoa học 4.2 Đề xuất Tiếp tục nghiên cøu c¸c thÝ nghiƯm bỉ sung c¸c tiỊn chÊt cã tác dụng kích thích sinh tổng hợp bet caroten chủng nấm sợi B trispora WH1, WH2, NBRC 5989 chủng đột biến MTH2 nuôi cấy riêng rẽ phối hợp chủng có giới tính đối lập Kiểm tra gen mà hoá sinh tổng hợp beta-caroten chủng nghiên cứu chủng đột biến kü tht lai ph©n tư Southern hybridisation TiÕp tơc xử lý đột biến chủng MTH2 hoá chất đột biến NNTG Nghiên cứu thí nghiệm lên men qui mô xởng thực nghiệm nh 500 lít 1500 lít sử dụng sản phẩm phụ công nghiƯp chÕ biÕn thùc phÈm lµm ngn cung cÊp dinh dỡng cho trình lên men Tiếp tục xây dựng qui trình công nghệ tách chiết beta-caroten từ sinh khối nấm sợi thu nhận từ trình lên men chìm có sực khí vô trùng qui mô xởng thực nghiÖm 88