Sản xuất và ứng dụng chế phẩm sinh học từ vi khuẩn pseudomonas sp và azospirillum sp phòng trừ bệnh phấn trắng trên cây dưa lưới cucummis melo l

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO TỔNG KẾT DỰ ÁN ƯƠM TẠO CÔNG NGHỆ: SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ VI KHUẨN PSEUDOMONAS FLOURESCENS VÀ AZOSPIRILLUM SP PHÒNG TRỪ BỆNH PHẤN TRẮNG TRÊN CÂY DƯA LƯỚI (CUCUMMIS MELO L.) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/ 2015 MỤC LỤC PHẦN I: GIỚI THIỆU Thông tin chung dự án Tính cấp thiết dự án Xuất xứ Mục tiêu dự án PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bệnh phấn trắng dưa lưới 1.1 Triệu chứng điều kiện gây hại 1.2 Tác nhân gây bệnh 1.2.1 Phân loại khoa học nấm gây bệnh phấn trắng Erysiphe cichoracearum 1.2.2 Hình thái nấm Erysiphe cichoracearum 1.2.3 Chu kỳ sinh trưởng nấm Erysiphe cichoracearum 1.3 Biện pháp phòng trừ 10 1.3.1 Biện pháp hóa học 10 1.3.2 Biện pháp sinh học 10 Ứng dụng Pseudomonas Azospirillum sản xuất nông nghiệp 11 PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 Đối tượng nghiên cứu 16 Thời gian địa điểm thực 16 Nội dung nghiên cứu 16 3.1 Khảo sát khả đố i kháng nấ m Erysiphe cichoarearum gây bê ̣nh phấ n trắ ng của chủng vi khuẩ n P flourescens phòng thí nghiê ̣m 16 3.2 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học từ vi khuẩn P flourescens và Azospirillum sp 18 3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả phòng trừ bệnh phấn trắng dưa lưới (Cucumis melo L.) trồng nhà màng 20 3.5 Phương pháp xử lý số liệu 22 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả đớ i kháng nấ m gây bê ̣nh phấ n trắ ng của chủng vi khuẩ n P.fluorescens phòng thí nghiê ̣m 23 Thí nghiệm 2: Sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học từ vi khuẩn P.fluorescens và Azospirillium sp 24 2.1 Lên men cấp 24 2.2 Lên men cấp 25 2.3 Phối trộn với chất mang 25 Mỗi quy trình sản xuất chế phẩm APS sản xuất thời điểm với 03 lần lặp Chế phẩm APS đóng gói nhơm với quy cách 1kg/gói 26 2.4 Kiểm tra chất lượng chế phẩm APS 26 2.4.1 Mật số vi khuẩn chế phẩm sản xuất 26 2.4.2 Thời gian bảo quản (hạn sử dụng) 27 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả phòng trừ bệnh phấn trắng dưa lưới (Cucumis melo L.) trồng nhà màng 28 3.1 Chỉ tiêu hiệu lực phòng trừ bệnh phấn trắng 28 3.2 Chỉ tiêu suất chất lượng trái dưa lưới kết thúc trình khảo sát 31 3.2.1 Chiều dài rễ 31 3.2.2 Độ Brix 32 3.2.3 Năng suất dưa lưới 33 3.2.4 Phân loại trái 33 Sản phẩm dự án 34 Đánh giá hiệu dự án 36 5.1 Hiệu Hiệu kinh tế - xã hội 36 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 Kết luận 38 Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 DANH MỤC BẢNG Bảng Bố trí thí nghiệm đối kháng quy mơ phịng thí nghiệm 17 Bảng Cấp độ bệnh phấn trắng thuộc họ bầu bí 17 Bảng Công thức nghiệm thức 20 Bảng Chỉ số DSI phấn trắng mẫu 23 Bảng Kết kiểm tra mật số vi khuẩn lên men cấp 24 Bảng Kết kiểm tra mật số vi khuẩn lên men cấp 25 Bảng Kết kiểm tra mật số vi khuẩn chế phẩm APS sản xuất 26 Bảng Kết kiểm tra mật số vi khuẩn thời gian bảo quản 27 Bảng 10 Hiệu phòng trừ bệnh phấn trắng dưa lưới 28 Bảng 11 Chiều dài rễ độ Brix thịt trái dưa lưới 31 Bảng 12 Trọng lượng suất dưa lưới 33 Bảng 13 Phân loại trái dưa lưới thu hoạch 33 Bảng 14 Giá thành 100kg chế phẩm APS dạng bột tan 36 Bảng 15 Chi phí sử dụng biện pháp kiểm sốt bệnh phấn trắng dưa lưới trồng nhà màng vụ 36 DANH MỤC HÌ NH Hình Các giai đoạn sinh trưởng nấm Erysiphe cichoracearum Hình Chu kỳ sinh trưởng nấm Erysiphe cichoracearum Hình Hình thái vi khuẩn P fluorescens kính hiển vi điện tử (a) khuẩn lạc đĩa petri (b) 11 Hình Rễ khơng có PGPRs (bên trái) Rễ có PGPRs (bên phải) 13 Hình Cơ chế hoạt động PGPRs 13 Hình Tương tác yếu tố: PGPR, thực vật, tác nhân gây bệnh đất 14 Hình Hình thái vi khuẩn Azospirillum sp kính hiển vi điện tử (a) 14 khuẩn lạc đĩa petri (b) 14 Hình Mẫu bệnh phấn trắng thu thập nhà màng số 16 Hình Bố trí thí nghiệm xác định hoạt lực đối kháng quy mơ phịng thí nghiệm 17 Hình 10 Sơ đồ sản xuất chế phẩm APS quy mô pilot 19 Hình 11a Biểu đồ hoạt lực đối kháng khuẩn P.fluorescens mẫu bệnh phấn trắng quy mơ phịng thí nghiệm 23 Hình 11b Đối kháng khuẩn P.fluorescens với bệnh phấn trắng cấp độ (25-50% 24 Hình 12 Sinh khối cấp (a) P.fluorescens (b) Azospillium sp 24 Hình 13 Sinh khối cấp vi khuẩn P.fluorescens Azospillium sp 25 Hình 14 Chất mang (a) trước phối trộn (b) sau phối trộn 26 Hình 15 Chế phẩm sinh học APS 26 Hình 15a Mật số vi khuẩn P.fluorescens nồng độ pha loãng 27 Hình 15b Mật số vi khuẩn Azospillium sp nồng độ pha loãng 27 Hình 16a Các nghiệm thức trước khảo sát 29 Hình 16b Lá dưa lưới nghiệm thức sau khảo sát 30 Hình 17 Chiều dài rễ dưa lưới a (nghiệm thức 1); b (nghiệm thức 2); c (nghiệm thức 3); d (nghiệm thức 4); e (nghiệm thức 5) 31 Hình 18 Chiều dài rễ dưa lưới a (nghiệm thức 1); b (nghiệm thức 2); 32 c (nghiệm thức 3); d (nghiệm thức 4); e (nghiệm thức 5) 32 Hình 19 Biểu đồ độ Brix thịt trái dưa lưới 32 PHẦN I: GIỚI THIỆU Thông tin chung dự án Chủ nhiệm dự án: Nguyễn Duy Long Học vị: Thạc sĩ Chức vụ: Phó trưởng phịng Ươm tạo cơng nghệ Địa chỉ: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, Tp.HCM Điện thoại: 0909909776 Email: duylong@abi.com.vn Cơ quan chủ trì: Trung tâm Ươm tạo doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao TP.HCM Cán phối hợp chính: TT Họ tên (Học vị chức danh KH) Chuyên ngành KS Nguyễn Tiến Duy Chế biến bảo quản CN Nguyễn Ngọc Duy Trồng Trọt CN Thạch Thị Hồng Loan Công nghệ thực phẩm CN Lâm Ngọc Thảo Công nghệ sinh học KS Huỳnh Xuân Vũ Công nghệ sinh học CN Huỳnh Phương Anh Công nghệ sinh học Cơ quan công tác Trung tâm Ươm tạo doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao TP.HCM Trung tâm Ươm tạo doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao TP.HCM Trung tâm Ươm tạo doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao TP.HCM Trung tâm Ươm tạo doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao TP.HCM Trung tâm Ươm tạo doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao TP.HCM Trung tâm Ươm tạo doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao TP.HCM Tính cấp thiết dự án Phổ biến nhiều đối tượng trồng dễ dàng nhận triệu chứng, phấn trắng bệnh nấm tìm thấy khắp khu vực trồng trọt giới Mỗi lồi nấm bệnh ký sinh cho hai đối tượng trồng hai nấm bệnh có ký chủ Chúng hấp thụ chất dinh dưỡng từ tế bào sống, làm cho mơ bị vàng diện tích quang hợp mô bị giảm, dẫn đến tượng suy yếu q trình sinh trưởng, lão hóa sớm, ảnh hưởng đến chất lượng hương vị nông sản (Yonghao, 2012) Theo kết từ cơng trình nghiên cứu bệnh học trồng, thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae) loại trồng mẫn cảm với bệnh phấn trắng ghi nhận đối tượng trồng chịu thiệt hại nghiêm trọng bột phấn trắng gây (Braun Cook, 2012) Cây thuộc họ bầu bí có nguồn gốc nhiệt đới nên điều kiện khí hậu nước ta chúng sinh trưởng phát triển thuận lợi, trồng nhiều vụ năm Cũng với điều kiện khí hậu tạo thuận lợi cho bệnh phấn trắng phát triển Hai tác nhân gây bệnh phấn trắng họ bầu bí nấm Podosphaera xanthii nấm Erysiphe cichoracearum gây hại nặng tất vùng trồng bầu bí, làm giảm suất, ảnh hưởng đến chất lượng (Margaret, 2011) Ngày nay, bệnh phấn trắng không vấn đề trồng ngồi đồng ruộng mà cịn trở ngại việc sản xuất họ bầu bí nhà màng (Anna, 2012) Sự cách ly nhà màng, nhà lưới ngăn cản lây lan bệnh phấn trắng dẫn đến thiệt hại đồng khu sản xuất nông ngiệp Đi với phát triển giới, Việt Nam ứng dụng rộng rãi mô hình sản xuất rau nhà màng Trong đó, mơ hình trồng dưa lưới (Cucummis melo L.) nhà màng ưu tiên phát triển đẩy mạnh trình chuyển giao kỹ thuật mang lại hiệu thiết thực kinh tế lợi ích xã hội Song song với việc đầu tư tăng nhanh diện tích nhà màng trồng dưa lưới việc trọng quan tâm đến quản lý dịch bệnh phấn trắng cần thiết, đặc biệt bệnh phấn trắng trở thành mối nguy hại lớn, có khả phát tán gây bệnh hàng loạt diện rộng nhà màng khu vực phía nam nước ta Biện pháp sử dụng thuốc hóa học để phịng trừ bệnh phấn trắng hại trồng trở thành lựa chọn hàng đầu hàng thập kỷ qua Tuy nhiên, việc lạm dụng hóa chất để phịng trừ bệnh hại bộc lộ nhiều nhược điểm như: gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu đến hệ sinh thái nông nghiệp để lại dư lượng hóa chất nơng sản thực phẩm Bên cạnh đó, thuốc hóa học sử dụng nhiều ngày làm tăng tính kháng thuốc, giảm hiệu thuốc đối bệnh hại đồng thời tiêu diệt sinh vật có lợi tự nhiên (Anand, 2009) Những năm gần đây, biện pháp sinh học quản lý dịch hại ngày áp dụng rộng rãi Biện pháp quản lý dịch hại đại phụ thuộc nhiều vào biện pháp sinh học biện pháp bền vững an tồn (Phạm Thanh Hà, 2003) Đồng thời, định hướng sản xuất nơng nghiệp theo hướng hữu cơ, địi hỏi nhà khoa học phải nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học để khắc phục hạn chế mà thuốc hoá học gây Một số chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh phấn trắng chế phẩm dựa chế đối kháng nấm phấn trắng chủng vi sinh vật Hiện nay, giới có nhiều lồi vi sinh vật có khả kiểm sốt bệnh phấn trắng nấm Ampelomyces quisqualis, nấm men Sporothrix flocculosa, vi khuẩn Bacillus subtilis vi khuẩn Pseudomonas fluorescens coi tác nhân sinh học tiềm phịng trừ nhiều lồi vi nấm gây bệnh trồng (Alstrưm, 1991) Ngồi ra, nghiên cứu giới thập niên qua, ghi nhận có nhiều chủng vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật (thuộc chi Azotobacter sp., Burkhoderia sp., Azospirillum sp., Bacillus sp.) ứng dụng lớn cho canh tác nông nghiệp bền vững (Siddiqui, 2006) Tuy nhiên, thực tế, chưa có sản phẩm kiểm sốt sinh học nước ta để phịng trừ phấn trắng họ bầu bí, hầu hết áp dụng biện pháp phòng trừ loại thuốc diệt nấm có nguồn gốc hóa học hồn tồn khơng phù hợp với mục tiêu phát triển nông nghiệp công nghệ cao tạo sản phẩm nơng nghiệp đạt tiêu an tồn vệ sinh thực phẩm Do vậy, dự án “Sản xuất và ứng du ̣ng chế phẩm sinh ho ̣c từ vi khuẩn Pseudomonas flourescens và Azospirillum sp phòng trừ bệnh phấ n trắ ng dưa lê (Cucummis melo L.)” thực nhằm góp phần giải vấn đề nêu Xuất xứ - Dự án tiến hành sở của các công trin ̀ h nghiên cứu: + Kiể m soát bê ̣nh phấ n trắ ng dưa leo: “Management of Cucumber (Cucumis sativus L.) Mildews through Azoxystrobin-Tolerant Pseudomonas fluorescens.” T Anand, A Chandrasekaran, S Kuttalam, T Raguchander, R Samiyappan (2009) Tạp chí Khoa ho ̣c và Kỷ thuâ ̣t nông nghiê ̣p Tập 11 Trang 211-226 Kết nghiên cứu khẳng định kết hợp chế phẩm từ vi khuẩn P fluorescens (25kg/ha) với hoạt chất diệt nấm azoxystrobin (250ml/ha) có khả kiểm sốt bệnh phấn trắng dưa leo với số bệnh (PDI- percent Disease Index) mức 1% + Tối ưu điều kiện nuôi cấy Azospirillum brasilense với vi khuẩn khác gia tăng hàm lượng hoạt chất tăng trưởng thực vật PGP hạt giống dưa leo, rau diếp cà chua: “Optimal plant growth-promoting concentration of Azospirillum brasilense inoculated to cucumber, lettuce and tomato seeds varies between bacterial strains.” Jonathan S Mangmanga, Rosalind Deakera, Gordon Rogersa (2015) Tạp chí Khoa học thực vật Israel Tập 62 Phần Trang 145-152 Tác giả tiến hành khảo nghiệm 03 chủng Azospirillum brasilense (Sp7, Sp7-S Sp245) hạt giống dưa leo, cà chua rau diếp Kết quả, tất hạt giống dưa leo, cà chua rau diếp xử lý với 03 chủng A.brasilense đẩy nhanh q trình sinh trưởng Trong đó, chủng A.brasilense Sp7 cho thấy hiệu thúc đẩy giai đoạn sớm thông qua tiêu sinh trưởng như: tốc độ (thời gian) nảy mầm, chiều dài rễ, số cao Mục tiêu dự án - Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm APS từ chủng vi khuẩn P flourescens và Azospirillum sp trừ bệnh phấn trắng dưa lưới (Cucummis melo L.) trồng nhà màng - Hồn thiện cơng nghệ phục vụ mục tiêu ươm tạo doanh nghiệp đơn vị PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bệnh phấn trắng dưa lưới 1.1 Triệu chứng điều kiện gây hại Dưa lưới (Cucummis melo L.) rau ăn thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae) mẫn cảm với bệnh phấn trắng (Braun Cook, 2012) Triệu chứng bệnh phấn trắng xuất nhanh thường từ 3-7 ngày lượng lớn bào tử hình thành thời gian ngắn Điều kiện thuận lợi nấm phát triển tầng thực vật dày cường độ ánh sáng thấp (Thomas, 2011) Bệnh hại chủ yếu lá, xuất cuống thân Bệnh gây hại mặt lá, thường phát sinh gây hại mạnh mặt Biểu bệnh phấn trắng từ mặt có lớp bột màu trắng xám phủ đầy; sau đó, có hạt nhỏ màu đen xuất hiện, thể dạng bao nang có miệng (perithecia) Cây bị bệnh sinh trưởng yếu, phẩm chất kém, suất thấp (Nguồn: Chi cục BVTV An Giang) Trong thời kỳ sinh trưởng, bệnh lây lan nhanh bào tử nhờ khơng khí gió Bào tử phân sinh nảy mầm thuận lợi nhiệt độ 20-24°C độ ẩm khơng khí cao Tuy bệnh phát triển điều kiện khô hạn Sợi nấm thể bảo tồn tàn dư bệnh (Vũ Triệu Mân, 2007) 1.2 Tác nhân gây bệnh Theo Grath (1997) Sphaerotheca fuliginea Erysiphe cichoracearum hai loài nấm phổ biến ghi nhận gây bệnh phấn trắng bầu bí Nhưng E.cichoracearum coi nguyên nhân xuyên suốt giới từ trước năm 1958 Sau này, nấm E.cichoracearum Braun (1999) đặt với tên khác Golovinomyces cichoracearum 1.2.1 Phân loại khoa học nấm gây bệnh phấn trắng Erysiphe cichoracearum Danh pháp nhân gây bệnh phấn trắng thay đổi nhiều lần năm qua Theo khóa phân loại khoa học Heluta (1988), nấm Erysiphe cichoracearum thuộc: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Leotiomycetes Bộ: Erysiphales Họ: Erysiphaceae Chi: Erysiphe Lồi: Erysiphe cichoracearum 1.2.2 Hình thái nấm Erysiphe cichoracearum Nấm Erysiphe cichoracearum De Candolle nấm chuyên tính ngoại kí sinh, chuyên tính họ bầu bí Sợi nấm bám dày đặc tạo vòi hút đâm sâu vào tế bào để hút dinh dưỡng làm giảm diện tích quang hợp Cành bào tử phân sinh (Hình 1.A) mọc thẳng góc với sợi nấm, khơng phân nhánh, khơng màu Bào tử phân sinh hình trứng hình bầu dục khơng màu, đơn bào, kích thước - x - µm Quả thể (Hình 1.B-C-D) hình thành có hình cầu, có lơng bám đơn giản, nhỏ, màu đen, đường kính 80 – 140 µm, bên chứa túi Erysiphe cichoracearum có khoảng 10-15 túi hình trứng, túi chứa 2-8 bào tử túi (Hình 1.B) hình bầu dục, đơn bào, khơng màu, kích thước 12 - 20 x 20 – 28 µm Hình Các giai đoạn sinh trưởng nấm Erysiphe cichoracearum 1.2.3 Chu kỳ sinh trưởng nấm Erysiphe cichoracearum Vòng đời nấm phấn trắng (Hình 2) ký sinh tế bào thực vật Tất loài nấm phấn trắng địi hỏi mơ thực vật sống để phát triển Bào tử sợi nấm lưu tồn sẵn cỏ dại ký chủ quan trọng tồn số nấm phấn trắng Bào tử giai đoạn tiềm sinh đặc biệt sản xuất, cho phép tồn qua mùa đông lồi gây bệnh họ bầu bí, rau diếp, đậu Hà Lan, số loại trồng khác Gặp điều kiện thuận lợi, bào tử phát tán, tạo thành bột màu trắng mặt thực vật Mặc dù yêu cầu độ ẩm cho bào tử nảy mầm khác nhau, tất lồi nấm phấn trắng nảy mầm lây nhiễm trường hợp nước tự Sau đó, sợi nấm phát triển thành lớp mỏng bề mặt bị xâm nhiễm Các biểu quan sát kính hiển vi soi Bào tử sợi nấm nhạy cảm với nhiệt độ cực cao (trên 32°C) ánh sáng mặt trời trực tiếp Hình Chu kỳ sinh trưởng nấm Erysiphe cichoracearum 3.2.3 Năng suất dưa lưới Kết thúc trình khảo sát, tiến hành cân trọng lượng trái (kg/nghiệm thức) để tính suất dưa lưới (tấn/1000m2) Bảng 12 Trọng lượng suất dưa lưới Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 LSD CV (%) Trọng lượng Năng suất (kg) (tấn/1000m2) 1,800c ± 90 3,25 ± 0,14 1,731c ± 246 3,13 ± 0,42 2,054b ± 218 3,71 ± 0,28 2,034b ± 245 3,67 ± 0,42 2,253a ± 253 4,07 ± 0,42 98,26 10,0 Ghi chú: +NT1: Cây bình thường, phun nước lã + NT2: Cây bị bệnh, phun nước lã + NT3: Cây bị bệnh, phun chế phẩm APS liều + NT2: Cây bị bệnh, phun chế phẩm APS liều + NT2: Cây bình thường, phun chế phẩm APS định kỳ lần/tuần + số liệu cột, có chữ kèm giống thể khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê mức CV% Kết quả, suất dưa lưới cho thấy sử dụng chế phẩm APS bị bệnh (NT3, NT4) không bị bệnh (NT5) cho suất cao nghiệm thức đối chứng (Bảng 12) 3.2.4 Phân loại trái Tỷ lệ phần trăm (%) phân loại trái dưa lưới giai đoạn 65 ngày tuổi khác nghiệm thức (Bảng 13) Phần trăm dưa loại I cao nghiệm thức (88,57%), thấp nghiệm thức (72,86%) Nghiệm thức 2, kết phân loại không đạt tình trạng bị nhiễm bệnh phấn trắng gây ảnh hưởng đến suất kết phân loại trái Kết phù hợp với kết luận từ công trình nghiên cứu Yonghao (2012) bệnh phấn trắng trồng Bảng 13 Phân loại trái dưa lưới thu hoạch Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Phân loại trái (%) Loại I Loại II 82,86 17,14 72,86 27,14 85,71 14,29 84,29 15,71 88,57 11,43 Ghi chú:+NT1: Cây bình thường, phun nước lã + NT2: Cây bị bệnh, phun nước lã + NT3: Cây bị bệnh, phun chế phẩm APS liều + NT2: Cây bị bệnh, phun chế phẩm APS liều + NT2: Cây bình thường, phun chế phẩm APS định kỳ lần/tuần Giữa kết suất (Bảng 12) kết phân loại trái (Bảng 13) có tương quan Sự tương quan thí nghiệm tiến hành nhà màng, 33 áp dụng quy trình kỹ thuật trồng dưa lưới theo hướng ứng dụng công nghệ cao, đồng thời kết hợp sử dụng chế phẩm sinh học APS phịng trừ bệnh phấn trắng suốt q trình sinh trưởng đến thu hoạch giúp sinh trưởng tốt Sản phẩm dự án 4.1 Quy trình sản xuất Chế phẩm sinh học APS: Kết dự án xây quy trình sản xuất chế phẩm sinh học APS phòng trừ bệnh phấn trắng dưa lưới, sẵn sàng hỗ trợ chuyển giao công nghệ cho doanh nghiệp tham gia ươm tạo Quy trình sản xuất đạt quy mơ pilot với cơng suất ước tính 300kg/ngày Chủng vi khuẩn 48h, 28-30oC 150 v/ph Lên men cấp 48h, 30oC 150 v/ph Lên men cấp Tỉ lệ phối trộn 0,2:1 Bổ sung phụ gia Chất mang 30 - 40 oC Sản phẩm Kiểm tra chất lượng sản phẩm Thuyết minh quy trình: - Chủng vi sinh vật Lựa chọn chủng vi sinh vật vi khuẩn P.fluorescens Azospillium sp đáp ứng tiêu chuẩn sau: - An tồn cho q trình nghiên cứu ứng dụng sản xuất thành chế phẩm - Hoạt tính sinh học (đối kháng với bệnh phấn trắng họ bầu bí) phù hợp với mục đích sản xuất chế phẩm - Điều kiện sinh trưởng chủng vi sinh vật phù hợp với điều kiện môi trường sinh thái Việt Nam - Lên men cấp 34 Nhân sinh khối cấp vi khuẩn: P.fluorescens môi trường PDB (Potato Dextrose Broth) erlen 250ml, điều kiện pH 7, thời gian nuôi cấy 48h nhiệt độ 28-30oC Nhân sinh khối cấp vi khuẩn: Azospillium sp môi trường NF (nitrogenfree Hino and Wilson medium) erlen 250ml, điều kiện pH 7.7, thời gian nuôi cấy 48h nhiệt độ 28-30oC Các bình erlen sinh khối cấp ni lắc tủ lắc ổn nhiệt với tốc độ quay 150v/ph Tiến hành thu mẫu kiểm tra mật số vi sinh vật theo TCVN 8741:2011 Kết kiểm tra mật số vi sinh vật đạt 107cfu/ml, tiến hành cấy chuyển cấp để tiến hành giai đoạn lên men cấp - Lên men cấp Nhân sinh khối 02 chủng vi khuẩn: P.fluorescens Azospillium sp môi trường bổ sung rỉ đường (20g/l) tinh bột (20%) hệ thống lên men tự động, điều kiện pH 7-7.5, thời gian nuôi cấy 48h, nhiệt độ 30oC sử dụng hệ thống sục khí nhằm cung cấp oxy cho trình lên men Tiến hành kiểm tra mật số vi sinh vật theo TCVN 8741:2011 Kết kiểm tra mật số vi sinh vật đạt 106cfu/ml, tiến hành cấy chuyển cấp để tiến hành giai đoạn phối trộn với chất mang - Phố i trô ̣n với chất mang Hỗn hợp dịch lên men cấp đem phối trộn với chất mang, để khô tự nhiên tránh ánh nắng mặt trời trực tiếp Trong điều kiện thời tiết bất lợi, mưa nhiều, độ ẩm cao gây kéo dài trình khơ tự nhiên chế phẩm, đem hỗn hợp đem sấy nhiệt độ 40oC Chất mang lựa chọn sản xuất chế phẩm dạng bột hòa tan nên chế phẩm sinh học từ khuẩn P.fluorescens Azospillium sp (viết tắt APS) sản phẩm dạng bột tan, dùng để phun đối tượng trồng Mật độ vi sinh vật phải đạt 10 cfu/g Ngoài chất mang, chế phẩm cần bổ sung thêm chất bám dính số chất vi dinh dưỡng cần thiết cho hoạt động vi sinh vật nhằm tăng hiệu lực kéo dài thời gian sử dụng chế phẩm - Kiểm tra chất lượng sản phẩm + Kiểm tra mật số vi sinh vật Chế phẩm sinh học APS sản xuất thu mẫu kiểm tra mật số vi sinh vật theo TCVN 8741:2011 + Bảo quản Sau đóng gói chế phẩm APS vào túi nhôm (1kg), chế phẩm bảo quản nhiệt độ phòng 35 Đánh giá hiệu dự án 5.1 Hiệu Hiệu kinh tế - xã hội Hiện chưa có sản phẩm kiểm soát sinh học đăng ký để kiểm sốt phấn trắng họ bầu bí Qua q trình thực dự án, giá thành để sản xuất 1kg chế phẩm APS dạng bột tan 75.000 đồng/kg (Bảng 14) giá bán dự kiến chế phẩm APS đưa thị trường là: 120.000 đồng/kg Bảng 14 Giá thành 100kg chế phẩm APS dạng bột tan TT Chi tiết Đơn giá Đơn vị Nguyên vật liệu sản xuất 6.500.000 /100kg Công lao động 500.000 /100kg Điện, nước, xăng dầu 300.000 /100kg Vận chuyển 100.000 /100kg Marketing, bán hàng 100.000 /100kg 7.500.000 /100kg Tổng Ghi chú: Giá thành 1kg chế phẩm APS: 75.000 đồng/kg So sánh chi phí sử dụng chế phẩm sinh học APS với chi phí sử dụng thuốc hóa học phịng trừ nấm phấn trắng dưa lưới trồng nhà màng vụ (Bảng 15), kết cho thấy chi phí sử dụng thuốc hóa học cao gấp lần so với sử dụng chế phẩm sinh học APS Bảng 15 Chi phí sử dụng biện pháp kiểm soát bệnh phấn trắng dưa lưới trồng nhà màng vụ Biện pháp kiểm sốt bệnh phấn trắng Chế phẩm APS Thuốc hóa học: Aliette Kumulus Topsin M Daconil Score Quy cách ĐVT gói/kg gram Đơn giá (VNĐ) 120 gói/100g gói/kg gói/100g gói/100g chai/500ml gram gram gram gram ml 420 70 270 370 110 Số lượng 1500 300 360 300 300 150 Thành tiền (VNĐ) 180.000 359.700 126.000 25.200 81.000 111.000 16.500 Sử dụng chế phẩm APS tác nhân sinh học kiểm soát bệnh phấn trắng dưa lưới góp phần giảm chi phí sản xuất Do đó, chế phẩm APS tăng hiệu kinh tế sử dụng, đặc biệt xu hướng phát triển nông nghiệp bền vững theo hướng ứng dụng công nghệ cao cách sử dụng chế phẩm sinh học tăng thêm tính khả thi cho sản phẩm APS tiến hành thương mại thị trường Dự án thúc đẩy tạo tiền đề cho doanh nghiệp tham gia ươm tạo phát triển sản phẩm mang tính chiến lược thu hồi vốn nhanh giảm rủi ro trình sản xuất kinh doanh Kết dự án góp phần khai thác hiệu sở hạ tầng, trang thiết bị đầu tư từ dự án xây dựng Khu Nông nghiệp Công nghệ cao TP.HCM 36 5.2 Hiệu tác động đến môi trường Những năm qua, việc sử dụng chế phẩm sinh học trồng trọt xem ứng dụng khoa học - kỹ thuật có ý nghĩa thiết thực, góp phần bảo vệ mơi trường sinh thái Kết nghiên cứu từ dự án giải thực trạng lĩnh vực sản xuất dưa lưới nhà màng như: sử dụng chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh phấn trắng, việc thay khơng sử dụng thuốc hóa học chế phẩm sinh học khơng mang lại lợi ích mặt kinh tế mà cịn góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng môi trường sinh thái Dự án góp phầ n thúc đẩy doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học thay hoạt chất hóa học gây hại đến môi trường Sản phẩm dự án phù hợp với xu hướng sản xuất nông nghiệp công nghệ cao, canh tác không xử dụng đất canh tác nông nghiệp hữu Sản phẩm nông nghiệp tạo đạt tiêu chuẩn xuất khẩu, có khả cạnh tranh với sản phẩm thị trường phù hợp với nhu cầu an toàn thực phẩm 37 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Dự án xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm sinh học APS từ chủng vi khuẩn Pseudomonas flourescens Azospirillium sp Chế phẩm có hiệu lực phịng bệnh phấn trắng dưa lưới 88,02% Khi bị bệnh, hiệu làm giảm bệnh phấn trắng dưa lưới 78,44% - Chế phẩm sinh học APS có khả tăng chiều dài rễ dưa lưới từ 8cm so với không xử dụng chế phẩm.Về suất đạt 4,07tấn/1000m2 Năng suất nghiệm thức sử dụng chế phẩm sinh học tăng 452,83kg so với không xử dụng chế phẩm Kiến nghị - Mở rộng quy mơ nghiên cứu ngồi đồng ruộng - Chủ n giao công nghê ̣ sản cho các doanh nghiê ̣p, cá nhân mở rô ̣ng quy mô sản xuấ t chế phẩm APS - Đăng ký công bố xây dựng tiêu chuẩn chất lượng sản phẩ m - Thúc đẩy giới thiệu quảng bá công nghệ sản phẩm tới doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học 38 TÀ I LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Ngô Thanh Phong, Cao Ngọc Điệp, Trần Thị Xuân Mai 2011 Phân lập, nhận diện tuyển chọn vi khuẩn cố định đạm bón cho lúa cao sản Đề tài cấp Bộ 2009-2010, Bộ Giáo Dục Đào Tạo, B2009-16-119 Nguyễn Hữu Hiệp, Trần Văn Chiêu, Đào Thanh Hoàng Nguyễn Khắc Minh Loan 2005 Azospirillum: Vi sinh vật cố định đạm với khơng thuộc họ đậu Tạp chí khoa học Cần Thơ Trang 4-6 Phạm Thanh Hà, Nguyễn Thị Phương Chi, Hồ Kim Anh Nguyễn Quỳnh Mai 2003 Chế phẩm vi sinh vật hữu ích để sản xuất thực phẩm bảo vệ môi trường đất trồng, Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc Hà Nội 2003: trang 23 Phạm Thị Ngọc Lan Lý Kim Bảng 2004 Tìm hiểu vi khuẩn cố định nitơ sống tự phân lập từ đất trồng lúa Tạp chí sinh học 26 (1): 63-66 Trần Thị Giang, Nguyễn Thị Quyên, Cao Ngọc Điệp 2014 Phân lập nhận diện vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng (PGPR) từ số loại rau ăn trồng Thành phố Cần Thơ Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 35: 65-73 Vũ Triệu Mân 2004 Điểm qua vài bệnh hại có nguồn gốc từ đất Việt Nam Hội thảo Quốc Gia Bệnh Sinh học phân tử "Bệnh hại có nguồn gốc từ đất", lần Nhà xuất Nông Nghiệp, pp: 5-9 Tiếng Anh Anna-Carin Almqvist 2012 Biological control of powdery mildew in greenhouse produced cucumber Swedish University of Agricultural Sciences 60 pages Asya Stepansky, Irina Kovalski and Rafael Perl-Treves 1999 Intraspecific classification of melons (Cucumis melo L.) in view of their phenotypic and molecular variation Plant Systematics & Evolution Vol 217: 313-333 Alström, S 1991 Induction of disease resistance in common bean susceptible to halo blight bacterial pathogen after seed bacterization with rhizosphere pseudomonads J Gen Appl Microbiol 37:495-501 Baehler, E., Bottiglieri, M., Pechy-Tarr, M., Maurhofer, M., and Keel, C 2005 Use of green fluorescent protein-based reporters to monitor balanced production of antifungal compounds in the biocontrol agent Pseudomonas fluorescens CHA0.J Appl Microbiol 99:24-38 Bashan, Y., REAM, Y., Levanony, H., and Sade, A 1989b Nonspecific responses in plant growth, yield, and root colonization of noncereal crop plants to inoculation with Azospirillum brasilense Cd Can J Bot 67: 1317-1324 Bashan, Y., and de-Bashan, L.E., 2005 Bacteria/plant growth-promotion In: Hillel (ed.) Encyclopedia of soils in the environment Elsevier, Oxford pp 103-115 Cakmakci, R., Erdogan, U., Kotan, R., Oral, B., and Donmez, M.F., 2008 Cultivable heterotrophic N2-fixing bacterial diversity in wild red raspberries soils in the coruh valley In: Proceedings if IV, National Plant Nutrition and Fertilizer Congress, pp 706-717 (in Turkey) De Souza L M., Sadowsky M J., Wackett L P 1996 Atrazine chlorohydrolase from Pseudomonas sp strain ADP: gene sequence, enzyme purification, and protein characterization J Bacteriol 178:4894–4900 Jonathan S Mangmanga, Rosalind Deakera, Gordon Rogersa 2015 Optimal plant growth-promoting concentration of Azospirillum brasilense inoculated to 39 cucumber, lettuce and tomato seeds varies between bacterial strains Israel Journal of Plant Sciences Volume 62, Issue 3, 2015, pp 145-152 Kapulnik, Y., Sarig, S., Nur, I., Okon, Y., Kigel, J., and Henis, Y 1981c Yield increases in summer cereal crops of Israeli fields inoculated with Azospirillum Exp Agric 17: 179-187 Kloepper, J.W., and Schroth, M.N., 1978 Plant growth-promoting rhizobacteria on radies, In: Proceedings of the fourth international conference on plant pathogenic bacteria Vol 2:879-892 M.T Hossain, S.M.M Hossain,M.A Bakr, A.K.M Matiar Rahman, S.N Uddin 2010 Survey on major diseases of vegetable and fruit crops in Chittagon region Bangladesh J Agril Res 35(3) : 423-429 Margaret Tuttle McGrath, M.T., 2011 Powdery Mildew of Cucurbits Phytopathology 81: 84-88 Nakkeeran, S., W G D Fernando, and Z.A Siddiqui 2006 Plant growth promoting rhizobacteria formulations and its scope in commercialization for the management of pests and diseases In Z A Siddiqui (ed.), PGPR: Biocontrol and Biofertilization., Springer, pp: 257–296 Noori MSS, Saud HM (2012) Potential Plant Growth-Promoting Activity of Pseudomonas sp Isolated from Paddy Soil in Malaysia as Biocontrol Agent J Plant Pathol Microb 3:120 doi: 10.4172/2157-7471.1000120 Ooi, K.H., 2002 Chemical characterization and control of Fusarium oxysporum, causes vascular wilt disease in rosel Ph.D Thesis, University Sains Malaysia, Malaysia Reynders, L , and Vlassak, K 1982 Use of Azospirillum brasilense as biofertilizer in intensive wheat cropping Plant Soil, 66: 217-223 Ruckdäschel, E., Lewis-Kittell, B., Helinski, D R., and Klingmüller, W (1988) Aromatic amino acid aminotransferase of Azospirillum lipoferum and their possible involvement in IAA biosynthesis In W Klingmüller (Ed.), Azospirillum IV, genetics, physiology, ecology (pp 49-53) Berlin Heidelberg: Springer-Verlag Saleena L M., S.Rangarajan and S Naiz 2002 Diversity of Azospirillum strains isolated from rice plants growth in saline and nonsaline soils of coastal agricultural ecosystem Minabid Ecology 44: 271 - 277 Singh UP, Prithiviraj B, Singh KP, Sarma BK 2000 Control of powdery mildew (Erysiphe pisi) of pea (Pisum sativum) by combined application of plant growth promoting rhizobacteria and Neemazal TM Zeitschrift Pflanzenkrankheiten Pflan-zenschutz 107:59-66 T Anand, A Chandrasekaran, S Kuttalam, T Raguchander, R Samiyappan 2009 Management of Cucumber (Cucumis sativus L.) Mildews through AzoxystrobinTolerant Pseudomonas fluorescens J Agric Sci Technol Vol 11: 211-226 Teng, P.S and W.C James, 2001 Disease and Yield Loss Assessment In: Plant Pathologist's Pocketbook, Waller, J.M., J.M Lenne and S.J Waller (Eds.) CABI Pub Co Inc., Boston, Massachussetts, pp: 25-38 Umesha S, Dharmesh SM, Shetty SA, Krishnappa M, Shetty HS 1998 Biocontrol of downy mildew disease of pearl millet using Pseudomonas fluorescens Crop Protect 17:387 – 392 Yonghao Li 2012 Department of Plant Pathogen and Ecology The connecticut Agricltural experiment station pages 40 Yusuf Yanar, Durdane Yanar, Naif Gebologlu 2011 Control of powdery mildew (Leveillula taurica) on tomato by foliar sprays of liquid potassium silicate African Journal of Biotechnology Vol 10(16), pp 3121-3123 Website http://baovethucvatcongdong.info/sites/default/files/khaonghiem/64%20Bau%20biphan%20trang%20TC%2016.10%20post_doc.pdf http://oisat.org/pests/diseases/fungal/powdery_mildew.html http://www.ipm.ucdavis.edu/PMG/PESTNOTES/pn7406.html http://www.fao.org/docrep/006/y4011e/y4011e0l.htm https://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=8&cad=rja&u act=8&ved=0ahUKEwj59JrXiNjJAhWECI4KHTRID9sQFghEMAc&url=http %3A%2F%2Ftieuchuan.mard.gov.vn%2FDocuments%2FUploads%2FQCVN %252001-113-2012BNNPTNT.doc&usg=AFQjCNEX5shqM_W1dWZAeevJ2826kWdQXA&sig2 =zL06r3caoi-OYgmaJ7InwQ 41 PHỤ LỤC I PHỤ LỤC HÌNH Hoạt lực đối kháng khuẩn P.fluorescens mẫu bệnh phấn trắng quy mơ phịng thí nghiệm Mật số vi khuẩn chế phẩm APS thời gian bảo quản 42 Khảo sát khả phòng trừ bệnh phấn trắng dưa lưới (Cucumis melo L.) trồng nhà màng 3.1 Hiệu phòng trừ bệnh phấn trắng 3.2 Chiều dài rễ 43 3.3 Trọng lượng trái dưa lưới 3.4 Độ Brix thịt trái II PHỤ LỤC THỐNG KÊ Khảo sát khả phòng trừ bệnh phấn trắng dưa lưới (Cucumis melo L.) trồng nhà màng 1.1 Hiệu phòng trừ bệnh phấn trắng Descriptive Statistics Dependent Variable: PDI nt Mean Std Deviation N NT1 42,2530 ,74661 10 NT2 44,7310 1,23487 10 NT3 9,5120 ,37762 10 NT4 9,2420 ,21322 10 NT5 5,2270 ,47905 10 Total 22,1930 17,66466 50 PDI 44 Subset nt Duncana,b N NT5 10 NT4 10 9,2420 NT3 10 9,5120 NT1 10 NT2 10 5,2270 42,2530 44,7310 Sig 1,000 ,398 1,000 1,000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed Based on observed means The error term is Mean Square(Error) = ,500 a Uses Harmonic Mean Sample Size = 10,000 b Alpha = ,05 1.2 Chiều dài rễ 1.2.1 Chiều dài rễ Descriptive Statistics Dependent Variable: Chieudaibore nt Mean Std Deviation N NT1 16,2300 1,55638 10 NT2 13,2800 ,79694 10 NT3 21,3500 ,91439 10 NT4 21,2100 ,95505 10 NT5 24,0500 ,57009 10 Total 19,2240 4,05742 50 Chieudaibore Subset nt Duncana,b N NT2 10 NT1 10 NT4 10 21,2100 NT3 10 21,3500 NT5 10 Sig 13,2800 16,2300 24,0500 1,000 1,000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed Based on observed means The error term is Mean Square(Error) = 1,026 a Uses Harmonic Mean Sample Size = 10,000 b Alpha = ,05 3.2.2 Chiều dài rễ 45 ,759 1,000 Descriptive Statistics Dependent Variable: Chieudairechinh nt Mean Std Deviation N NT1 11,7300 ,74543 10 NT2 9,0800 ,65286 10 NT3 15,3500 ,91439 10 NT4 15,4100 ,95505 10 NT5 18,0500 ,57009 10 Total 13,9240 3,26681 50 Chieudairechinh Subset nt Duncana,b N NT2 10 9,0800 NT1 10 NT3 10 15,3500 NT4 10 15,4100 NT5 10 11,7300 18,0500 Sig 1,000 1,000 ,864 1,000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed Based on observed means The error term is Mean Square(Error) = ,611 a Uses Harmonic Mean Sample Size = 10,000 b Alpha = ,05 1.3 Trọng lượng trái dưa lưới Descriptive Statistics Dependent Variable: trongluongtrai nt Mean Std Deviation N NT1 1800,0520 90,72101 10 NT2 1731,2560 246,99949 10 NT3 2054,3870 218,06638 10 NT4 2034,3870 245,95223 10 NT5 2253,3870 253,23105 10 Total 1974,6938 283,78467 50 trongluongtrai Subset nt Duncana,b N NT2 10 1731,2560 NT1 10 1800,0520 NT4 10 2034,3870 NT3 10 2054,3870 NT5 10 2253,3870 Sig ,487 46 ,840 1,000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed Based on observed means The error term is Mean Square(Error) = 48282,092 a Uses Harmonic Mean Sample Size = 10,000 b Alpha = ,05 1.4 Độ Brix thịt trái Descriptive Statistics Dependent Variable: DoBrix nt Mean Std Deviation N NT1 10,8000 ,71492 10 NT2 9,0500 ,43780 10 NT3 11,4800 ,69410 10 NT4 11,1800 ,86384 10 NT5 11,7800 1,00863 10 Total 10,8580 1,21774 50 DoBrix Subset nt Duncana,b N NT2 10 9,0500 NT1 10 10,8000 NT4 10 11,1800 11,1800 NT3 10 11,4800 11,4800 NT5 10 11,7800 Sig 1,000 Means for groups in homogeneous subsets are dislayed Based on observed means The error term is Mean Square(Error) = ,590 a Uses Harmonic Mean Sample Size = 10,000 b Alpha = ,05 47 ,067 ,105