Sản xuất cây giống xáo tam phân paramignya trimera oliv burkill bằng phương pháp vi nhân giống

I MỞ ĐẦU 1.1 Thông tin chung dự án Chủ nhiệm dự án: Phan Thị Hồng Thủy Học vị: Thạc sĩ Chức vụ: Chun viên phịng Ươm tạo Cơng nghệ Địa chỉ: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, Tp.HCM Điện thoại: 01212525584 Email: hongthuyitb@gmail.com Cơ quan chủ trì: Trung tâm Ươm tạo doanh nghiệp Nơng nghiệp Cơng nghệ cao TP.HCM Cán phối hợp chính: Họ tên Chuyên Cơ quan TT (Học vị chức ngành công tác danh KH) Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Ths Nguyễn Cửu Sinh lý thực Nông nghiệp Công nghệ cao Thành Nhân vật TP.HCM Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp CN Nguyễn Văn Sinh học Nông nghiệp Cơng nghệ cao Tồn TP.HCM Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Công nghệ CN Lê Thị Sang Nông nghiệp Cơng nghệ cao sinh học TP.HCM 1.2 Tính cấp thiết dự án Với điều kiện thiên nhiên nhiều ưu đãi, Việt Nam có hệ sinh thái phong phú đa dạng, có tiềm to lớn tài nguyên thuốc Đây điều kiện thuận lợi để phát triển nguồn dược liệu, cung cấp nguyên liệu cho sản xuất thuốc nước Việt Nam có 4.000 loài thuốc, 50 loài tảo biển, 75 lồi khống vật gần 410 lồi động vật làm thuốc, có nhiều loại dược liệu quý giới công nhận hồi, quế, atisô, Sâm Ngọc Linh…[35] Theo định 1976 Quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020 định hướng đến năm 2030 Thủ tướng Chính phủ, Việt Nam có vùng trồng nguyên liệu nước để trồng 54 loài dược liệu, lựa chọn khai thác hợp lý 24 loài dược liệu tự nhiên [http://suckhoedoisong.vn/nganh-duoc-viet-nam-dau-tu-phat-trien-nguonduoc lieu-thien-nhien-n73741.html] Với sự đa da ̣ng về khí hâ ̣u thổ nhưỡng - đấ t đai, từ cuố i những năm của thâ ̣p kỷ 60-80 ở Viê ̣t Nam hình thành những vùng trờ ng, sản xuấ t dươ ̣c liê ̣u có tính chuyên canh Điều cho thấy nguồn dược liệu nước ta phong phú Tuy nhiên bên cạnh tiềm việc phát triển nguồn dược liệu thời gian qua bộc lộ nhiều hạn chế nguồn giống dược liệu chưa đáp ứng đủ nhu cầu kỹ thuật nhân giống, canh tác cịn chưa hồn thiện Trong năm gần nhờ áp dụng thành tựu công nghệ sinh học đặc biệt kỹ thuật công nghệ tế bào thực vật công tác chọn tạo nhân giống dược liệu quý nguy tuyệt chủng đạt nhiều thành tựu to lớn Nhiều giống dược liệu nhân giống in vitro thành công Sâm Ngọc Linh, Đảng sâm, Lan gấm….góp phần cung cấp giống cho sản xuất nguyên liệu đại trà, rút ngắn thời gian nhân giống, đảm bảo cung cấp giống với số lượng lớn, chất lượng đồng Xáo tam phân loại thảo dược quý Các phận Xáo tam phân có tinh dầu, nhiều rễ, có mùi thơm dịu Hiện nay, Xáo tam phân cho thần dược có tác dụng chữa ung thư Việc khai thác mức khơng cho phép quan có thẩm quyền dẫn đến tình trạng thuốc Xáo tam phân ngày cạn kiệt Theo phân tích Viện Dược Liệu, Xáo tam phân có thành phần hóa học chủ yếu coumarin flavonoid, ngồi cịn có saponin, alkaloid, triterpenoid Cây Xáo tam phân có tác dụng bảo vệ gan, ức chế viêm gan cấp Kết thử nghiệm in vitro cho thấy dịch chiết từ Xáo tam phân có tác dụng gây độc dòng tế bào ung thư (tế bào ung thư gan Hep-G2, tế bào ung thư đại tràng HTC116, tế bào ung thư vú MDA MB231, tế bào ung thư buồng trứng OVCAR-8 tế bào ung thư tử cung Hela), mạnh dòng tế bào ung thư gan tế bào ung thư cổ tử cung Trong thử độc cấp tính, dịch chiết Xáo tam phân chứng minh an toàn thử chuột nhắt trắng Hiện chưa có nghiên cứu nhân giống Xáo tam phân nuôi cấy mô công bố Dựa chiến lược phát triển dược liệu đáp ứng nhu cầu sử dụng dược liệu nước, nhu cầu sử dụng vấn đề trì, bảo tồn dược liệu quý tránh nguy dẫn đến tuyệt chủng dược liệu Xáo tam phân, đồng thời sở cơng trình nghiên cứu nhân giống in vitro họ Cam chanh, tiến hành thực dự án “Sản xuất giống Xáo tam phân “Paramignya trimera (Oliv.) Burkill phương pháp vi nhân giống” 1.3 Ý nghĩa tính khoa học thực tiễn Hiện có số cơng trình nghiên cứu vi nhân giống Xáo tam phân [29, 32, 34 ] có số đề tài dự án tiến hành nghiên cứu nhân giống phôi soma Xáo tam phân [http://khcn.vnuhcm.edu.vn/website/projectList.aspx?_pageId= 4&_projectId=2535] thực Tuy nhiên chưa có cơng bố thức quy trình hồn thiện cho vi nhân giống Xáo tam phân thực thành cơng Do dự án thực dựa nghiên cứu thực họ Cam chanh, xây dựng quy trình vi nhân giống Xáo tam phân từ giai đoạn đầu đến giai đoạn cuối cho in vitro hoàn chỉnh Cách tiếp cận đề tài tình hình nghiên cứu nhân giống, ni trồng, khai thác sản xuất dược liệu nước, nhu cầu thị trường Xáo tam phân Từ nghiên cứu họ Cam chanh giúp cho đề tài nắm thơng tin hữu ích, nhanh chóng tiếp cận vấn đề để xây dựng quy trình vi nhân giống Xáo tam phân Kết đề tài tiền đề đưa quy trình sản xuất giống đại trà, cung cấp nguồn nguyên liệu thô cho sản xuất dược phẩm góp phần bảo tồn lồi thuốc bị khai thác mức 1.4 Xuất xứ dự án Đề tài dựa nghiên cứu vi nhân giống thuộc họ Cam chanh công bố sách “Micropropagation of woody trees and fruits” tác giả Mohan Jain S thuộc Cơ quan Năng lượng Nguyên tử Quốc tế, FAO/IAEA Joint Division, Vienna, Austria Katsuaki Ishii thuộc Viện Nghiên cứu Lâm nghiệp lâm sản, Tsukuba, Japan Sách xuất nhà xuất Kluwer Academic năm 2003 [12] Xây dựng quy trình vi nhân giống Xáo tam phân thực dựa nghiên cứu vi nhân giống họ Cam chanh Shawkat ali Bushra Mirza (2006) tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng loại mẫu cấy nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến trình vi nhân giống Citrus jambhiri Lush Tác giả tiến hành gieo hạt in vitro sau sử dụng mẫu lá, thân, rễ từ gieo hạt làm vật liệu nghiên cứu cảm ứng tạo mô sẹo Kết nghiên cứu cho thấy hiệu cảm ứng tạo mô sẹo tốt từ đoạn thân mơi trường MS có bổ sung 1,5 mg/l 2,4 – D Quá trình tái sinh từ mô sẹo đạt hiệu cao (70%) môi trường MS bổ sung mg/l BA, môi trường tốt tái sinh chồi trực tiếp từ đoạn thân Cây tái sinh kích thích rễ nuôi cấy môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l NAA Tuy nhiên, theo công bố Maria Luiza cộng (2010) tái sinh chồi trực tiếp từ đốt thân Citrus limonia Citrus sinensis tốt môi trường MS bổ sung 0,5 – mg/l BA 0,25 – 0,5 mg/l NAA Tapati cộng sự, 1995 nghiên cứu vi nhân giống C Sinensis đưa công thức môi trường nhân chồi tốt MS bổ sung 0,5 mg/l BA 0,1 mg/l NAA với nguồn mẫu đốt thân, môi trường tạo rễ tốt ½ MS bổ sung 0,6 mg/l NAA 0,5 mg/l IBA Nghiên cứu Moore (1985) Beloualy (1991) cho thấy việc bổ sung malt extract (0,5 – 1,5 mg/l) có hiệu rõ rệt sinh trưởng thuộc họ Cam chanh in vitro Malt extract cung cấp nguồn carbohydrate khởi nguồn phát sinh phôi từ nuôi cấy phôi tâm, tăng cường tái sinh từ phôi soma Lượng malt extract khuyến cáo sử dụng từ 0,5 – g/l Dựa nghiên cứu trên, chúng tơi tiến hành xây dựng quy trình vi nhân giống Xáo tam phân với môi trường MS, bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA, IBA, thành phần khác thiamin malt extract Nồng độ sử dụng tham khảo dựa công thức môi trường tốt cho vi nhân giống họ Cam chanh 1.5 Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình vi nhân giống Xáo tam phân Chuyển giao công nghệ cho Doanh nghiệp có nhu cầu 1.6 Đối tượng, phạm vi, giới hạn nghiên cứu a Đối tượng nghiên cứu: Cây Xáo tam phân b Phạm vi nội dung nghiên cứu dự án: nhân giống Xáo tam phân phương pháp nuôi cấy mô giâm hom - Phạm vi không gian thời gian dự án: Dự án thực từ tháng 08/2014 – 12/2015 Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao – HCM c Giới hạn nghiên cứu: Việc ứng dụng cơng nghệ tế bào cho mục đích vi nhân giống thân gỗ tiểu mộc gặp nhiều khó khăn khả tái sinh phân hóa tế bào thân gỗ yếu so với thân thảo, đồng thời thời gian cho tái sinh biệt hóa tế bào thân gỗ lâu nhiều so với thân thảo Xáo tam phân tiểu mộc, chưa có cơng trình vi nhân giống thức công bố Trên họ Cam chanh, nghiên cứu nhân giống họ nhiều, chủ yếu dừng lại mục đích tạo bệnh, chuyển gen tăng xuất chất lượng Với mục tiêu sản xuất giống đại trà thường gặp nhiều khó khăn thời gian cho vi nhân giống dài, mô phát triển chậm so với giống lai tạo phương pháp truyền thống khác II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu Xáo tam phân Xáo tam phân thuốc nam, thường gọi với số tên khác Đơn Diệp Đằng Thích, rễ mọi, rễ lạ, thần dược, thần xạ… Ở Việt Nam, Xáo tam phân Phạm Hồng Hộ mơ tả sách “Cây cỏ Việt Nam” năm 2003 cho thấy, Xáo tam phân có tên khoa học Paramignya trimera (Oliv.) Guill, đồng danh Atalantia trimera Oliv., thuộc họ Cam chanh, lồi thuộc chi Paramignya có mặt Việt Nam Xáo tam phân tiểu mộc leo, gai dài, cong xuống Cành khơng có lơng, có phiến tròn dài hẹp, bền ngang – 1,5 cm, lúc khơ hai mặt nâu, bìa uốn xuống, gân phụ – 10 cặp, cuống ngắn – mm [28, 35] Loại dược thảo thuộc loài gỗ nhỏ, dạng dây trườn, vỏ màu nâu vàng, thân dài 4m, đường kính khoảng 10cm Thân cành có nhiều gai nhọn Lá đơn, mọc cách chụm ba, phiến dày, mép cong xuống dưới, có hình thn hẹp Phiến có mặt xanh đậm, mặt nhạt, bên có nhiều điểm dầu Gỗ cứng, màu vàng, phần rễ màu đậm Các phận có tinh dầu, nhiều rễ, mùi thơm dịu Hình 1.1 Cây rễ Xáo tam phân (http://thaoduocducthinh.com/xao-tamphan-1886002.html) Trong dân gian, người dân thường sử dụng rễ Xáo tam phân để làm thuốc trị bệnh Rễ có màu vàng sậm, vị đắng, nhẹ, the, thơm thoảng mùi giống rễ cam, rễ Xáo tam phân chưa cắt lát hình ống trịn , dài, ngồi có bám nhiều đất đỏ Đây đặc điểm để phân biệt với Xáo tam phân giả Các thuốc dân gian thường lấy rễ Xáo tam phân ngâm rượu, sắc lấy nước uống 2.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu họ Cam chanh 2.2.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước Xáo tam phân tên khoa học Paramignya trimera (Oliv.) Burkill thuộc chi Paramignya Chi Paramignya chi nhỏ thuộc họ Cam chanh, có 15 lồi thuộc chi công bố mô tả Chi tập trung chủ yếu vùng Nam Đông Nam Á [8], Swingle phân loại từ năm 1967 [21] Chi Paramignya nghiên cứu chứng minh có khả kháng khuẩn sử dụng làm dược liệu từ sớm [2, 6, 9, 16, 17, 20] Họ cam chanh có nhiều tác dụng thực tiễn nhân giống rộng rãi giới Các phương pháp nhân giống truyền thống phương pháp gieo hạt, ghép cành, chiết cành, giâm cành nghiên cứu áp dụng rộng rãi đối tượng thuộc họ Cam chanh Phương pháp gieo hạt, hình thức sinh sản hữu tính, có nhiều ưu điểm có khả chọn lọc tạo nhiều giống mang đặc tính quý bố mẹ, với số đặc tính vượt trội khác Phương pháp nhân giống vơ tính giâm cành, chiết cành hay ghép cành có ưu điểm giữ đặc tính tốt bố mẹ Tuy nhiên, hai phương pháp nhân giống mắc phải rào cản thời gian nhân giống kéo dài, nhanh bị thối hóa cành chiết hay giâm có tuổi sinh lý già, chất lượng giống không đồng đều, quy mơ áp dụng khơng lớn, tốn diện tích phụ thuộc hoàn toàn vào điều kiện tự nhiên Sự đời kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật giúp giải hạn chế phương pháp nhân giống truyền thống Các thuộc họ Cam chanh có giá trị mặt kinh tế dinh dưỡng nhân giống áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mang lại hiệu kinh tế cao Nhân giống kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật thuộc họ Cam chanh thực qua hai đường: phát sinh phôi soma phát sinh quan Nhân giống thông qua đường phát sinh phôi soma công bố lần vào năm 1958 Maheshwari Rangaswamy Trong nghiên cứu này, tác giả tiến hành tạo phôi soma thông qua nuôi cấy phôi tâm [10] Các nghiên cứu công bố sau chứng minh hiệu tạo phôi soma cao nuôi cấy môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) bổ sung 50 g/l đường succrose, 0,5 g/l malt extract chất điều hòa sinh trưởng BA với nồng độ cao 13 µM [5] Ngồi ra, số tác giả khác đưa kết nghiên cứu tạo phôi soma môi trường MT (Murashige and Tucker, 1969) bổ sung 0,5 g/l malt extract, đường sử dụng nghiên cứu succrose galactose 0,1 M bổ sung thêm sorbitol 0,1 M vào môi trường phát sinh phôi soma [3] Nhân giống thông qua phát sinh phô soma cho hệ số nhân giống cao Tuy nhiên, tỷ lệ bị biến dị hình thành từ phơi soma cao khả chống chịu tạo từ phôi soma Trong nhân giống thông qua đường phát sinh quan, phát sinh hình thái nuôi cấy in vitro Cam chanh chịu ảnh hưởng kiểu gen, loại mẫu ban đầu môi trường nuôi cấy Mẫu ban đầu sử dụng chồi đỉnh, chồi bên, rễ, lá, hay phần trụ mầm Việc cảm ứng tạo chồi hình thành trực tiếp từ mẫu cấy gián tiếp thông qua callus Những nghiên cứu tái sinh thuộc họ Cam chanh thông qua phát sinh quan tổng hợp bảng 2.1: Bảng 2.1: Tình hình nghiên cứu giới họ cam chanh Giống Tên chung Mẫu cấy C reticulata Mandarin Đốt thân C sinensis Sweet orange Đốt thân C sinensis Sweet orange Trụ trụ mầm P trifoliata Trifoliate orange Trụ mầm P trifoliata Trifoliate orange tTCL từ lóng thân C grandis Pummelo Phần trụ Mơi trường Môi trường tạo chồi tạo rễ MS + 33,3 1/2MS + 2,7 µM BA + µM NAA 5,4 µM NAA Tác giả Perez Molphe Balch & Ochoa – Alejo 1997 MS + 2,2 1/2MS + 2,7 Tapati µM BA + µM NAA + cộng sự, 0,5 µM 2,5 µM IBA 1995 NAA MS + 8,89 Không công Maggon µM BA + bố Singh, 0,76 µM 1995 ABA MS + 44,4 ẵ MS + 0,5 Harada v àM BA – 5,0 µM Murai, IBA 1996 MS + 10 MS + µM Van Le µM BA + NAA cộng sự, µM TDZ 1999 MS + 2,2 MS + 2,5 Goh C grandis Pummelo C grandis Pummelo C halimii C indica C limon Lemon µM BA µM IBA cộng sự, mầm 1995 Đoạn rễ MS + 0,089 MS + 2,5 Goh µM BA µM IBA cộng sự, 1995 Chồi đỉnh MS + 1,8 1/2MS + 5,4 Paudyal µM BA µM NAA Haq, 2000 Phần trụ MS +4,4 MS +2,7 Normah µM BA µM NAA cộng sự, mầm 1997 Chồi đỉnh MS + 2,2 Soilrtie Baruah µM BA cộng sự, 1996a-b Chồi đỉnh DKW + DKW + Kotsia và đốt thân 0,76 µM BA 19,6 µM Roussos, IBA 2001 BA = – benzylaminopurine, DKW = Driver – Kuniyuki medium, IBA = indole – butyric acid; NAA = αnaphthaleneacetic aicd; TDZ – thidiazuron; tTCL = transverse thin cell layer Chồi đỉnh thuộc họ Cam chanh nuôi cấy môi trường tăng sinh chồi sử dụng khống MS bổ sung 30 g/l succrose, 4,5 µM BA, 2,3 µM KIN 2,2 µM NAA Sau tuần ni cấy, chồi tái sinh có chiều cao cm cắt chuyển sang môi trường MS bổ sung 30 g/l succrose, 1,1 µM BA, 2,5 µM IBA 2,7 µM NAA để cảm ứng hình thành rễ Cây hồn chỉnh sau huấn luyện trồng giá thể khử trùng với tỷ lệ phối trộn cát : đất 1:1 [19] Shawkat ali Bushra Mirza (2006) tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng loại mẫu cấy nồng độ chất điều hòa sinh trưởng đến trình vi nhân giống Citrus jambhiri Lush [18] Tác giả tiến hành gieo hạt in vitro sau sử dụng mẫu lá, thân, rễ từ gieo hạt làm vật liệu nghiên cứu cảm ứng tạo mô sẹo Kết nghiên cứu cho thấy hiệu cảm ứng tạo mô sẹo tốt từ đoạn thân mơi trường MS có bổ sung 1,5 mg/l 2,4 – D Quá trình tái sinh từ mô sẹo đạt hiệu cao (70%) môi trường MS bổ sung mg/l BA, môi trường tốt tái sinh chồi trực tiếp từ đoạn thân Cây tái sinh kích thích rễ nuôi cấy môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l NAA Tuy nhiên, theo công bố Maria Luiza cộng (2010) tái sinh chồi trực tiếp từ đốt thân Citrus limonia Citrus sinensis tốt môi trường MS bổ sung 0,5 – mg/l BA 0,25 – 0,5 mg/l NAA [11] Quy trình vi nhân giống thơng qua đường phát sinh quan thuộc họ Cam chanh thể qua hai sơ sồ sau: Sơ đồ 2.1: Mẫu cấy ban đầu  cảm ứng tạo chồi môi trường bổ sung Cytokinin kết hợp với auxin  cảm ứng tạo rễ  trồng nhà kính Sơ đồ 2.2: Mẫu cấy ban đầu Cảm ứng tạo chồi Kéo dài chồi Tạo rễ Đưa vườn ươm Nghiên cứu Moore (1985) [13] Beloualy (1991) [1] cho thấy việc bổ sung malt extract (0,5 – 1,5 mg/l) có hiệu rõ rệt sinh trưởng thuộc họ Cam chanh in vitro Malt extract cung cấp nguồn carbohydrate khởi nguồn phát sinh phôi từ nuôi cấy phôi tâm, tăng cường tái sinh từ phôi soma Lượng malt extract khuyến cáo sử dụng từ 0,5 – g/l Việc bổ sung 150 µM coumarin có hiệu việc cảm ứng tạo chồi tạo rễ mẫu cấy trụ mầm [7] Hiện nay, chưa có nghiên cứu giới cơng bố kết vi nhân giống Xáo tam phân 10 Hình 4.19 Các nghiệm thức giâm hom Xáo tam phân sau 70 ngày (a: Đối chứng, b: nồng độ NAA 200ppm, c: nồng độ NAA 300ppm, d: nồng độ NAA 400ppm) Như qua nội dung thí nghiệm chúng tơi xây dựng qui trình vi nhân giống Xáo tam phân từ giai đoạn vô mẫu đến cảm ứng tạo cụm chồi nhân cụm chồi Sơ đồ quy trình mơ tả tóm tắt sau: - - Bước 1: Mẫu Xáo tam phân khỏe mạnh, cắt thành đoạn nhỏ dài 4- 5cm, rửa với xà phịng Sau đưa vào tủ cấy, khử trùng với cồn 70o 30 giây, rửa lại với nước tiệt trùng lần Sau lắc với HgCl2 (0,1%) phút, rửa lại với nước tiệt trùng - Bước 2: Cắt đoạn mắt Xáo tam phân, cắm vào môi trường vô mẫu (môi trường cảm ứng tạo chồi) MS bổ sung 0,5mg/l thiamin 0,75 mg/l BA - Bước 3: Cảm ứng tạo cụm chồi: Mẫu chồi sau cảm ứng cấy chuyển qua môi trường cảm ứng tạo cụm chồi MS bổ sung 0,5mg/l thiamin, 600 mg/l malt extract mg/l BA 44 Sơ đồ 3: Quy trình vi nhân giống Xáo tam phân tới giai đoạn nhân chồi mô tả sau: Mẫu cấy ban đầu (cành Xáo tam phân khỏe mạnh) Khử trùng: HgCl2 (0,1%) phút Môi trường cảm ứng tạo chồi: MS + 0,5 mg/l Thiamin + 0,75 mg/l BA Môi trường cảm ứng tạo cụm chồi: MS + 0,5 mg/l Thiamin + 600 mg/l Malt extract + mg/l BA Qua trình thí nghiệm ảnh hưởng NAA đến hình thành chồi rễ hom Xáo tam phân, xây dựng quy trình giâm hom Xáo tam phân sử dụng NAA làm chất cảm ứng tạo rễ sau: Sơ đồ 4: Sơ đồ nhân giống Xáo tam phân phương pháp giâm hom: Ngâm với dung dịch NAA (400ppm) phút Giá thể : Xơ dừa, tro trấu phân bò qua xử lý trộn theo tỷ lệ (7:3:1) Cây hom Xáo tam phân hình thành sau tháng - Bước 1: Chọn hom giống có độ tuổi khơng q non q già (cành bánh tẻ) bệnh khỏe mạnh 45 - Bước 2: Cắt hom thành đoạn dài từ 20 – 25 cm - Bước 3: Ngâm hom dung dịch NAA 400 ppm phút - Bước 4: Trồng hom Xáo tam phân xử lý với NAA giá thể xử lý (xơ dừa, tro trấu phân bò trộn theo tỷ lệ 7:3:1) - Bước 5: Đặt hom Xáo tam phân nơi mát, không bị ánh sáng trực tiếp Sau tháng hom hình thành rễ chồi non tạo thành hom giống Xáo tam phân Đánh giá hiệu dự án 5.1 Hiệu xã hội Dự án đưa quy trình vi nhân giống Xáo tam phân giai đoạn đầu từ bước vô mẫu, tạo chồi cụm chồi Các giai đoạn sau quy trình tiếp tục thực Kết dự án cho quy trình vi nhân giống Xáo tam phân hồn thiện, sản xuất thời gian ngắn lượng lớn giống Xáo tam phân đạt chuẩn chất lượng, cung cấp cho người dân hay vùng chuyên canh dược liệu Dự án chuyể n giao cho các doanh nghiê ̣p sẽ góp phầ n tăng thu nhâ ̣p cho doanh nghiê ̣p, cũng là tiề n đề góp phầ n xây dựng đấ t nước thông qua thuế thu nhâ ̣p doanh nghiê ̣p Bên ca ̣nh đó dự án cũng góp phầ n ta ̣o công ăn viê ̣c làm cho xã hô ̣i Mặt khác, nhu cầu Xáo tam phân ngồi thị trường lớn, cung khơng đủ cầu dẫn đến việc thương lái trà trộn “Xáo tam phân giả” vào thị trường để bán cho người tiêu dùng Việc giải nguồn cung cấp giống Xáo tam phân giúp ổn định lại thị trường dược liệu nước vùng chuyên canh dược liệu có đủ giống để trồng, người dân có giống đạt tiêu chuẩn, giảm bớt tình trạng Xáo tam phân giả, khơng rõ nguồn gốc 5.2 Hiệu tài Hiện chưa có sản phẩm Xáo tam phân từ nuôi cấy mô thị trường Việt Nam Hiện có Xáo tam phân từ giâm hom gieo hạt với giá thành bán thị trường từ 40.000 – 60.000 VNĐ/cây số lượng khan Chúng tơi xin đưa bảng tính chi phí xản suất Xáo tam phân giống dự kiến sau: 46 Bảng 4.15 Chi phí sản xuất dự kiến cho 1000 Xáo tam phân phương pháp nuôi cấy mô Đơn giá TT Chi tiết Đơn vị Nguyên vật liệu sản xuất 4.000.000 /1000 Công lao động 2.000.000 /1000 Điện, nước, xăng dầu 2.500.000 /1000 Tổng 8.500.000 /1000 Như chi phí dự kiến sản xuất mơ Xáo tam phân 8.500 VNĐ/cây Cây đem trồng vườn hậu cấy mơ khoảng tháng xuất bán cho thị trường Do giá thành dự kiến bán cho giống đủ tiêu chuẩn 25.000 VNĐ/cây So với giống bán thị trường thấp từ 10.000 – 35.000 VNĐ/cây Chi phí sản xuất giống Xáo tam phân phương pháp giâm hom: Bảng 4.16 Chi phí sản xuất dự kiến cho 1000 Xáo tam phân phương pháp giâm hom TT Chi tiết Đơn giá Đơn vị Cành giâm 10.000.000 /1000 Công lao động 3.000.000 /1000 Bầu, đất sạch, chăm sóc 2.000.000 /1000 NAA 400.000 /1000 Tổng 15.400.000 /1000 Chi phí nhân giống cho Xáo tam phân phương pháp giâm hom 15.400 đ/cây Giá bán dự kiến 35.000 đ/cây, so với giá giống thị trường rẻ từ 5.000 – 25.000 đ/cây 5.3 Hiệu môi trường Hiện Xáo tam phân bị người dân khai thác với mục đích thu rễ, thân bán cho người có nhu cầu chữa bệnh Nguồn Xáo tam phân phát Tây Trung Bộ Tây Nam Bộ Việt Nam với số lượng khơng nhiều Do Xáo tam phân bị khai thác kiệt quệ, có nguy bị đe dọa tuyệt chủng Kết dự án giải vấn đề cung cấp nguồn giống 47 Xáo tam phân cho thị trường, giúp phần giảm tình trạng khai thác bừa bãi Xáo tam phân tự nhiên, giúp cân lại hệ sinh thái 48 VI KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 6.1 Kết luận - Xây dựng quy trình vi nhân giống Xáo tam phân từ giai đoạn vô mẫu đến giai đoạn cảm ứng tạo cụm chồi với kết sau: + Sử dụng dung dịch HgCl2 0,1% với thời gian khử trùng phút có hiệu khử trùng tốt Các chồi ngủ Xáo tam phân phát triển tốt, xanh chồi khỏe mạnh +Trong môi trường tạo chồi nhân chồi Xáo tam phân, nồng độ thích hợp thiamin 0,5mg/l malt-extract 600 mg/l + Nồng độ BA thích hợp cho hình thành chồi Xáo tam phân từ chồi ngủ 0,75 mg/l, cho tạo cụm chồi phát triển cụm chồi 1mg/l IBA IAA không cho hiệu tạo rễ, nhiên công thức kết hợp với BA cho ảnh hưởng tốt lên phát triển chồi Xáo tam phân nồng độ thích hợp 1mg/l - Xây dựng quy trình nhân giống Xáo tam phân phương pháp giâm hom sử dụng NAA nồng độ 400 ppm cho tỷ lệ tạo chồi rễ cao (13,2%) 6.2 Kiến nghị - Tiếp tục thực nghiên cứu nội dung kéo dài chồi, tạo rễ, tạo hoàn chỉnh Xáo tam phân: + Khảo sát thêm ảnh hưởng loại môi trường dinh dưỡng khác lên sinh trưởng phát triển Xáo tam phân (Woodplant, M-Knop’s – Môi trường bao gồm macroelements vitamin Knop’s microelements MS, Kitto and Young, 1998, DKW medium - Driver and Kuniyuki medium…) +Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng (ở nồng độ cao hơn) cho mục đích tạo rễ tạo hồn chỉnh - Khảo sát thêm số nhân tố ảnh hưởng đến hình thành rễ chồi hom Xáo tam phân (chiều dài hom, độ tuổi hom, nồng độ NAA, ảnh hưởng IBA, IAA ) nhằm cho hiệu tạo giống cao 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Anh: [1] Beloualy N (1991) Plant regeneration from callus culture of three Citrus rootstocks Plant Cell Tissue Org Cult 24: 29 – 34 [2] Burkill, I.H (1935) A dictionary of the Economic Products of the Malay Peninsula Goverments of the Straits Settlements and Federate Malay States, London [3] Cabasson C, et al (1997) Improvement of Citrus somatic embryo development by temporary immersion Plant Cell Tissue Org Cult 50: 33 – 37 [4] Chakravarty B and Goswami BC (1999) Plantlet regeneration of Citrus from somatic callus cultures HortScience 9: 118 – 120 [5] D’Onghia AM, et al (2000) Somatic embryogenesis from style culture: a new technique for the sanitation, convervation, and safe exchange of Citrus germplasm Proc Int Soc Citriculture, In press [6] Eltier, G.L and Frederich, W.J (1920) Relative susceptibility to Citrus-canker of different species and hybrids of the genus Citrus, including the wild relatives Journal of Agricultural Research 19, 339–362 [7] George E.F., et al (2008) Plant propagation by Tissue Culture 3rd Edition Springer, pp119 [8] Krueger R.R and Navarro L Citrus genetics, breeding and biotechnology pp48 (2007) [9] Lee, H.A (1918) Further data on the susceptibility of rutaceous plants to Citrus – canker Journal of Agricultural Research 15, pp 661 – 665 [10] Maheshwari P Rangaswamy NS (1958) Polyembryony and in vitro culture of embryos of Citrus and Mangifera Ind J Hort 15: 275 - 282 [11] Maria L.P.O, et al (2010) Growth regulators, culture media and antibiotics in the in vitro shoot regeneration from mature tissue of Citrus cultivars Pesq Agropee Bras, Brasilia, 7: 654 – 660 [12] Mohan Jain S and Katsuaki Ishii (2003) Micropropagation of Woody Trees and Fruits Kluwer Academic Publisers: 599 – 602 [13] Moore GA (1985) Factor affecting in vitro embryogenesis from undeveloped ovules of mature Citrus J Am Soc Hort Sci 110: 66 – 70 50 [14] Parthasarathy VA, et al (1999) An efficient method of acclimatization of micropropagation plantlets of Citrus Tropical Agriculture 76: 147 – 149 [15] Paudyal KP and Haq N (2000) In vitro propagation of pummel (Citrus grandis L Osbeck) In vitro Cell Bev Biol Plant 36: 263 – 267 [16] Peltier, G.L and Frederich, W.J (1924) Further studies on the relative susceptibility to Citrus canker of different species and hybrids of the genus Citrus, including the wild relatives Journal of Agricultural Research 28, 227–239 [17] Peltier, G.L (1918) Susceptibility and resistance to Citrus-canker of the wild relatives, Citrus fruits, and hybrids of the genus Citrus Journal of Agricultural Research 14, 337–357 [18] Shawkat Ali and Brushra Mirza (2006) Micropropagation of rough lemon (Citrus jambhiri Lush.): Effect of explant type and hormone concentration Acta Bot Croat 65 (2): 137 – 146 [19] Singh S, et al (1994) In vitro propagation of Citrus reticulate Blanco and Citrus limon Burm HortScience 29: 214 – 216 [20] Winston, J.R., Bowman, J.J and Bach, W.J (1927) Citrus melanose and its Control United States Department of Agriculture, Bulletin No 1474, Washington DC [21] Swingle, W.T (1967) The botany of Citrus and its wild relatives In: Reuther, W., Batchelor, L.D and Webber, H.J (eds) The Citrus industry University of Califonia Press, California, pp 190 – 430 [22] Nguyen Huu Toan Phan et al (2014) Two tirucallane dericatives from Paramignya Scandens and their cytotoxic activity Phytochemistry Letter (2014) 78 – 81 [23] Ebert A and Taylor H F., 1990 Assessment of the changes of 2,4dichlorophenoxyacetic acid concentrations in plant tissue culture media in the presence of activated charcoal Plant Cell Tiss Org Cult., 20: 165-172 [24] Fridborg G., Pederson M., Landstrom L E and Eriksson T., 1978 The effect of activated charcoal on tissue cultures: adsorption of metabolites inhibiting morphogenesis Physiol Plant, 43: 194-106 51 [25] Wann S R., Veazey R L and Kaphammer J., 1997 Activated charcoal does not catalyze sucrose hydrolysis in tissue culture media during autoclaving Plant Cell Tiss Org Cult., 50: 221-224 Tiếng Việt: [26] Hà Thị Thúy, 2005 Nghiên cứu đặc tính khơng hạt phương pháp tạo dịng đa bội ăn có múi Luận văn Tiến sỹ Sinh học, trường đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội [27] Nguyễn Minh Khởi cộng (2013) Nghiên cứu độc tính cấp, tác dụng bảo vệ gan tác dụng gây độc tế bào ung thư Xáo tam phân Tạp chí dược liệu, tập 18, số 1/2013 [28] Phạm Hoàng Hộ (2003) Cây cỏ Việt Nam Nhà xuất trẻ, trang 439 [29] Phạm Huy Bách cộng (2013) Phân lập định lượng ostruthin dược liệu Xáo tam phân thu hái Việt Nam Tạp chí Dược liệu, tập 18, số 3/2013 [30] Phan Hữu Tôn cs, 2014 Nuôi cấy in vitro trụ mầm giống Cam (Citrus sinensis), Quýt (Citrus reticulata) Tạp chí Khoa học Phát triển, 12(5): 641-649 [31] Phạm Thị Bích Thủy, Nguyễn Bảo Tồn, 2008 Sự tạo phơi soma quýt đường (Citrus reticulata Blanco) từ nuôi cấy phôi tâm Tạp chí cơng nghệ sinh học, 6(2): 241-248 [32] Trần Thị Thúy Quỳnh cộng (2014) Phân lập vài hợp chất acridon alkaloid tròn rễ Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Burkill) Tạp chí Dược học, số 458, 6/2014 [33] Nguyễn Thị Diệu Thuần, 2015 Nghiên cứu thành phần hóa học khảo sát hoạt tính loài Xáo leo (Paramignya scandens (GRIFF.) CRAIB) Lâm Đồng Luận văn Tiến sỹ, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, p 11-15 [34] Nguyễn Thị Huệ, 2014 – Bước đầu nghiên cứu nhân giống invitro Xáo tam phân Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh học, trường Đại học Khoa học – Đại học Huế [35] Võ Văn Chi, 2012 Từ điển thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học 52 PHỤ LỤC Phân tích MTATC thí nghiệm khử trùng mẫu A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 94.889 47.444 142.333 0.0000 Within 2.000 0.333 Total 96.889 Coefficient of Variation = 14.04% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 4.000 1.333 0.58 0.33 3.00 26.000 8.667 0.58 0.33 3.00 7.000 2.333 0.58 0.33 -Total 9.00 37.000 4.111 3.48 1.16 Within 0.58 RANGE Error Mean Square = 0.3330 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 1.153 s_ = 0.3332 at alpha = 0.050 x Original Order Ranked Order Mean = 1.330 B Mean = 8.670 A Mean = 8.670 A Mean = 2.330 B Mean = 2.330 B Mean = 1.330 B Phân tích MTATC thí nghiệm ảnh hưởng thiamin A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 92.933 23.233 87.125 0.0000 Within 10 2.667 0.267 Total 14 95.600 Coefficient of Variation = 11.23% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 4.000 1.333 0.58 0.30 3.00 13.000 4.333 0.58 0.30 3.00 26.000 8.667 0.58 0.30 3.00 17.000 5.667 0.58 0.30 3.00 9.000 3.000 0.00 0.30 -Total 15.00 69.000 4.600 2.61 0.67 Within 0.52 RANGE Error Mean Square = 0.2670 Error Degrees of Freedom = 10 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 0.9401 at alpha = 0.050 53 Mean Mean Mean Mean Mean Original = = = = = Order 1.330 4.330 8.670 5.670 3.000 E C A B D Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order = 8.670 = 5.670 = 4.330 = 3.000 = 1.330 A B C D E Phân tích MTATC thí nghiệm ảnh hưởng BA đến tạo chồi ANALYSIS OF VARIANCE TABLE Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 153.733 38.433 144.125 0.0000 Within 10 2.667 0.267 Total 14 156.400 Coefficient of Variation = 10.76% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 0.000 0.000 0.00 0.30 3.00 8.000 2.667 0.58 0.30 3.00 17.000 5.667 0.58 0.30 3.00 28.000 9.333 0.58 0.30 3.00 19.000 6.333 0.58 0.30 -Total 15.00 72.000 4.800 3.34 0.86 Within 0.52 RANGE Error Mean Square = 0.2670 Error Degrees of Freedom = 10 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 0.9401 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 0.0000 D Mean = 9.330 A Mean = 2.670 C Mean = 6.330 B Mean = 5.670 B Mean = 5.670 B Mean = 9.330 A Mean = 2.670 C Mean = 6.330 B Mean = 0.0000 D Phân tích MTATC thí nghiệm ảnh hưởng malt extract đến tạo chồi A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 121.600 30.400 57.000 0.0000 Within 10 5.333 0.533 Total 14 126.933 Coefficient of Variation = 14.41% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 2.000 0.667 0.58 0.42 3.00 10.000 3.333 0.58 0.42 3.00 16.000 5.333 0.58 0.42 3.00 26.000 8.667 0.58 0.42 3.00 22.000 7.333 1.15 0.42 -Total 15.00 76.000 5.067 3.01 0.78 Within 0.73 54 RANGE Error Mean Square = 0.5330 Error Degrees of Freedom = 10 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 1.328 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 2.000 E Mean = 26.00 Mean = 10.00 D Mean = 22.00 Mean = 16.00 C Mean = 16.00 Mean = 26.00 A Mean = 10.00 Mean = 22.00 B Mean = 2.000 A B C D E Phân tích MTATC thí nghiệm ảnh hưởng BA NAA đến tạo cụm chồi A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 14 317.410 22.672 5.864 0.0000 Within 30 115.988 3.866 Total 44 433.398 Coefficient of Variation = 23.11% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 10.100 3.367 1.48 1.14 3.00 33.900 11.300 1.65 1.14 3.00 23.400 7.800 2.48 1.14 3.00 28.400 9.467 1.39 1.14 3.00 23.600 7.867 1.81 1.14 3.00 12.000 4.000 0.87 1.14 3.00 37.700 12.567 1.93 1.14 3.00 30.800 10.267 1.96 1.14 3.00 26.400 8.800 2.19 1.14 10 3.00 28.200 9.400 0.96 1.14 11 3.00 13.300 4.433 1.46 1.14 12 3.00 35.900 11.967 2.16 1.14 13 3.00 26.750 8.917 2.86 1.14 14 3.00 27.000 9.000 1.47 1.14 15 3.00 25.500 8.500 3.24 1.14 -Total 45.00 382.950 8.510 3.14 0.47 Within 1.97 RANGE Error Mean Square = 3.866 Error Degrees of Freedom = 30 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 3.279 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 3.370 E Mean = 12.57 A Mean = 11.30 ABC Mean 12 = 11.97 AB Mean = 7.800 D Mean = 11.30 ABC Mean = 9.470 ABCD Mean = 10.27 ABCD Mean = 7.870 D Mean = 9.470 ABCD Mean = 4.000 E Mean 10 = 9.400 ABCD Mean = 12.57 A Mean 14 = 9.000 BCD Mean = 10.27 ABCD Mean 13 = 8.920 BCD Mean = 8.800 BCD Mean = 8.800 BCD Mean 10 = 9.400 ABCD Mean 15 = 8.500 CD Mean 11 = 4.400 E Mean = 7.870 D Mean 12 = 11.97 AB Mean = 7.800 D 55 Mean Mean Mean 13 = 14 = 15 = 8.920 9.000 8.500 BCD BCD CD Mean Mean Mean 11 = = = 4.400 4.000 3.370 E E E Phân tích MTATC thí nghiệm ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả tạo chồi A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 118.222 59.111 76.000 0.0001 Within 4.667 0.778 Total 122.889 Coefficient of Variation = 30.53% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 0.000 0.000 0.00 0.51 3.00 2.000 0.667 1.15 0.51 3.00 24.000 8.000 1.00 0.51 -Total 9.00 26.000 2.889 3.92 1.31 Within 0.88 RANGE Error Mean Square = 0.7780 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 1.762 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 0.0000 B Mean = 8.000 A Mean = 0.6700 B Mean = 0.6700 B Mean = 8.000 A Mean = 0.0000 B Phân tích MTATC thí nghiệm ảnh hưởng BA môi trường MS1 đến khả tạo chồi A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 113.733 28.433 47.389 0.0000 Within 10 6.000 0.600 Total 14 119.733 Coefficient of Variation = 18.74% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 0.000 0.000 0.00 0.45 3.00 22.000 7.333 1.15 0.45 3.00 21.000 7.000 1.00 0.45 3.00 11.000 3.667 0.58 0.45 3.00 8.000 2.667 0.58 0.45 -Total 15.00 62.000 4.133 2.92 0.76 Within 0.77 RANGE Error Mean Square = 0.6000 Error Degrees of Freedom = 10 No of observations to calculate a mean = 56 Least Significant Difference Test LSD value = 1.409 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 0.0000 C Mean = 7.330 Mean = 7.330 A Mean = 7.000 Mean = 7.000 A Mean = 3.670 Mean = 3.670 B Mean = 2.670 Mean = 2.670 B Mean = 0.0000 A A B B C Phân tích MTATC thí nghiệm ảnh hưởng BA IBA môi trường MS2 đến khả tạo chồi A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 11 344.889 31.354 59.407 0.0000 Within 24 12.667 0.528 Total 35 357.556 Coefficient of Variation = 17.67% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 0.000 0.000 0.00 0.42 3.00 6.000 2.000 1.00 0.42 3.00 22.000 7.333 1.15 0.42 3.00 10.000 3.333 0.58 0.42 3.00 0.000 0.000 0.00 0.42 3.00 19.000 6.333 0.58 0.42 3.00 27.000 9.000 0.00 0.42 3.00 18.000 6.000 1.00 0.42 3.00 0.000 0.000 0.00 0.42 10 3.00 9.000 3.000 1.00 0.42 11 3.00 24.000 8.000 1.00 0.42 12 3.00 13.000 4.333 0.58 0.42 -Total 36.00 148.000 4.111 3.20 0.53 Within 0.73 RANGE Error Mean Square = 0.5280 Error Degrees of Freedom = 24 No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 1.225 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 0.0000 H Mean = 9.000 A Mean = 2.000 G Mean 11 = 8.000 AB Mean = 7.330 BC Mean = 7.330 BC Mean = 3.330 EF Mean = 6.330 CD Mean = 0.0000 H Mean = 6.000 D Mean = 6.330 CD Mean 12 = 4.330 E Mean = 9.000 A Mean = 3.330 EF Mean = 6.000 D Mean 10 = 3.000 FG Mean = 0.0000 H Mean = 2.000 G Mean 10 = 3.000 FG Mean = 0.0000 H Mean 11 = 8.000 AB Mean = 0.0000 H Mean 12 = 4.330 E Mean = 0.0000 H Phân tích MTATC thí nghiệm ảnh hưởng NAA đến phát triển hom A N A L Y S I S O F Degrees of V A R I A N C E T A B L E Sum of Mean 57 Prob Freedom Squares Square F-value Between 1839.000 613.000 175.143 0.0000 Within 28.000 3.500 Total 11 1867.000 Coefficient of Variation = 9.13% Var V A R I A B L E No Number Sum Average SD SE -1 3.00 0.000 0.000 0.00 1.08 3.00 69.000 23.000 2.00 1.08 3.00 78.000 26.000 1.73 1.08 3.00 99.000 33.000 2.65 1.08 -Total 12.00 246.000 20.500 13.03 3.76 Within 1.87 RANGE Error Mean Square = 3.500 Error Degrees of Freedom = No of observations to calculate a mean = Least Significant Difference Test LSD value = 3.522 at alpha = 0.050 Original Order Ranked Order Mean = 0.0000 C Mean = 33.00 A Mean = 23.00 B Mean = 26.00 B Mean = 26.00 B Mean = 23.00 B Mean = 33.00 A Mean = 0.0000 C 58