Luận án Tiến sĩ Xây dựng chỉ thị phân tử nhận dạng và nghiên cứu nhân giống bảo tồn loài Xáo tam phân (Paramignya trimera)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Phí Thị Cẩm Miện XÂY DỰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ NHẬN DẠNG VÀ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG BẢO TỒN LOÀI XÁO TAM PHÂN (Paramignya trimera) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI, 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Phí Thị Cẩm Miện Xây dựng thị phân tử nhận dạng nghiên cứu nhân giống bảo tồn loài Xáo tam phân (Paramignya trimera) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Chu Hoàng Hà Hà Nội, 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học PGS.TS Chu Hoàng Hà Các kết thu luận án Hoàn toàn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Phí Thị Cẩm Miện ii LỜI CẢM ƠN Để hồn thành Luận án, xin trân trọng cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Chu Hoàng Hà, người thầy trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình suốt trình thực Luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn Các Thầy Cô giáo, anh chị bạn đồng nghiệp Viện Công nghệ sinh học; Học viện Nông nghiệp Việt Nam giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập, sinh hoạt chuyên môn thực Luận án Tôi xin chân thành cảm ơn đến Học Viện Khoa học Công Nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ thời gian thực Luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Chương trình dự án Việt Bỉ (AI Programe-VNUA, 2014-2019) hỗ trợ kinh phí cho đề tài “A study of phylogenetics and biopharmaceutical properties of the Vietnamese traditional medicinal plants belonging to the genus Paramignya for the development of hepatoprotective nutraceuticals” giai đoạn 2018-2019 để giúp tơi có nguồn kinh phí thực nội dung nghiên cứu Luận án Sau cùng, từ tận đáy lịng, tơi xin tỏ lịng biết ơn chân thành đến gia đình bạn bè cổ vũ, động viên tơi hồn thành Luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn ! Phí Thị Cẩm Miện iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ix MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu .2 2.1 Mục tiêu tổng quát 2.2 Mục tiêu cụ thể Ý nghĩa khoa học thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học .2 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Đối tượng phạm vi nghiên cứu đề tài 4.1 Đối tượng nghiên cứu 4.2 Phạm vi nghiên cứu Những đóng góp luận án CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung chi Paramignya .5 1.1.1 Đặc điểm sinh học chi Paramignya 1.1.2 Một số thành phần hóa học hoạtt tính sinh học chi Paramignya 1.2 Cây Xáo tam phân (P trimera), phân loại, đặc điểm sinh học hoạt chất sinh học 11 1.2.1 Nguồn gốc, phân bố, vị trí phân loại Xáo tam phân 11 1.2.2 Đặc điểm thực vật học Xáo tam phân Việt Nam 11 1.2.3 Nghiên cứu hoạt tính sinh dược học Xáo tam phân .16 1.3 Các phương pháp nghiên cứu phân loại thực vật 20 1.3.1 Các thị đặc điểm thực vật 20 iv 1.3.2 DNA barcode ứng dụng DNA barcode để nhận dạng phân biệt loài 25 1.3.3 Ứng dụng thị phân tử xác định quan hệ tiến hóa 31 1.3.4 Đánh giá đa dạng di truyền quần thể thực vật 34 1.3.5 Các nghiên cứu hệ thống học, DNA barcodes loài thuộc chi Paramignya loài P trimera 36 1.4 Nhân giống loài Xáo tam phân 37 1.4.2 Nhân giống Xáo tam phân tự nhiên 49 CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 52 2.1 Vật liệu nghiên cứu 52 2.1.1 Vật liệu cho nghiên cứu vị trí phân loại quan hệ phát sinh mẫu thu thập 52 2.1.2 Vật liệu cho nghiên cứu nhân nhanh in vitro mẫu Xáo tam phân 52 2.1.3 Các thị phân tử DNA 53 2.2 Nội dung nghiên cứu 57 2.3 Phương pháp nghiên cứu 57 2.3.1 Phương pháp điều tra, thu thập mẫu xây dựng đồ phân bố 57 2.3.2 Phương pháp mơ tả hình thái 58 2.3.3 Tách chiết tinh DNA tổng số 58 2.3.4 PCR nhân vùng microsatellite thị SSR .58 2.3.5 PCR nhân vùng thị phân tử 59 2.3.6 Giải trình tự đăng ký trình tự 59 2.3.7 Phương pháp phân tích liệu trình tự 60 2.4 Phương pháp nhân giống in vitro Xáo tam phân .66 2.4.1 Phương pháp tạo vật liệu khởi đầu nhân giống in vitro Xáo tam phân 66 2.4.2 Ảnh hưởng môi trường tới khả sinh trưởng Xáo tam phân điều kiện in vitro 67 2.4.3 Nghiên cứu khả tạo mô sẹo Xáo tam phân 67 2.4.4 Ảnh hưởng nhóm cytokinins auxin tới khả nhân nhanh Xáo tam phân 68 2.4.5 Ảnh hưởng nhóm auxin tới khả hình thành rễ Xáo tam phân 68 2.4.6 Phương pháp bố trí xử lý thí nghiệm 69 v CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 70 3.1 Khảo sát phân bố đặc điểm hình thái mẫu thuộc chi Paramignya Khánh Hòa Lâm Đồng 70 3.1.1 Khảo sát thành phần loài phân bố mẫu nghiên cứu 70 3.1.2 Đặc điểm hình thái mẫu thuộc chi Paramignya 75 3.2 Tách chiết DNA tổng số, nhận dạng lồi thơng qua thị barcode .81 3.3 Xác định đa dạng di truyền mẫu Xáo tam phân dựa vào thị SSR .81 3.4 Nghiên cứu thị DNA nhận dạng loài 86 3.4.1 PCR xác định trình tự vùng thị DNA .86 3.4.2 Nhận dạng loài dựa vào công cụ MEGABLAST 88 3.5 Xây dựng thị DNA để nhận dạng Xáo tam phân P trimera 95 3.5.1 Khảo sát liệu DNA mã vạch loài thuộc chi Paramignya .95 3.5.2 Xây dựng sở liệu trình tự thuộc chi Paramignya 95 3.5.3 So sánh trình tự để nhận dạng phân biệt Xáo tam phân .97 3.5.4 Xây dựng tiến hóa lồi 97 3.5.5 Xây dựng thị phân tử để nhận dạng Xáo tam phân 103 3.5.6 Đánh giá thị phân tử dựa vào phân tích khoảng cách mã vạch 108 3.6 Nhân giống in vitro Xáo tam phân .112 3.6.1 Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu nhân giống in vitro Xáo tam phân 112 3.6.2 Nghiên cứu xác định môi trường phù hợp với nhân nhanh in vitro Xáo tam phân .115 3.6.3 Nghiên cứu khả tạo mô sẹo Xáo tam phân 116 3.6.4 Nghiên cứu ảnh hưởng nhóm cytokinins tới khả nhân nhanh Xáo tam phân .119 KẾT LUẬN .129 KIẾN NGHỊ 131 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ .132 TÀI LIỆU THAM KHẢO .133 PHỤ LỤC 141 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABDG : Automatic Barcode Gap Discovery AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism BAP : 6-benzylaminopurine benzyladenine BI : Bayesia interference CSDL : Cơ sở liệu CTAB : Cetyl trimethyl ammonium bromide CV : Coefficient of Variation DNA : Deoxyribonucleic acid IAA : Acid indoleacetic IBA : 3-Indolebutyric acid ITS : Internal transcribed spacer ITS : Internal transcribed spacer KC : Knudson C medium LSD : Least significant differential LSD0.05 : Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 0.05 matK : Maturase K MS : Murashige & Skoog medium MSA : Multiple sequence alignment NCBI : National Center for Biotechnology Information P trimera : Paramignya trimera PCR : Polemerase Chain Reaction RAPD : Random Amplified Polymorphic rbcL : Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism SSR : Simple sequence Repeat STS : Silver thiosulfate TDZ : Thidiazuron WPM : Woody Plant Medium-Lloyd G, Mc Cown B, 1980 α - NAA : Axit α-naphtyl axetic 2.4 D : 2.4-Dichlorophenoxyacetic vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tổng hợp thị phân tử sử dụng genome lục lạp .30 Bảng 2.1 Bảng mẫu sử dụng tách chiết DNA, phân tích quan hệ phát sinh 52 Bảng 2.2 Trình tự mồi SSR sử dụng 53 Bảng 2.3 Trình tự mồi ITS, matK rbcL 56 Bảng 3.1 Tổng hợp vị trí thu thập mẫu Khánh Hòa Lâm Đồng 70 Bảng 3.2 Số allen hệ số PIC 31 cặp mồi SSR 83 Bảng 3.3 Tổng hợp thơng tin DNA barcode lồi thuộc chi Paramignya hệ thống BOLD .95 Bảng 3.4 Tổng hợp liệu trình tự lồi thuộc chi Paramignya .96 Bảng 3.5 Tổng hợp vùng trình tự ITS, matK rbcL trình tự 107 Bảng 3.6 Khoảng cách loài loài liệu trình tự .108 Bảng 3.7 Ảnh hưởng dung dịch nano bạc tới khả tạo mẫu Xáo tam phân 112 Bảng 3.8 Ảnh hưởng dung dịch Johnson tới khả tạo mẫu Xáo tam phân 113 Bảng 3.9 Ảnh hưởng kết hợp dung dịch Johnson nano bạc tới khả khử trùng tạo mẫu Xáo tam phân 114 Bảng 3.10 Ảnh hưởng môi trường tới sinh trưởng, nhân nhanh Xáo tam phân 116 Bảng 3.11 Ảnh hưởng TDZ, IBA 2.4 D tới khả tạo mô sẹo Xáo tam phân 117 Bảng 3.12 Ảnh hưởng phối hợp TDZ, IBA 2.4D tới phát sinh mô sẹo IBA Xáo tam phân 118 Bảng 3.13 Ảnh hưởng BA tới khả phát sinh chồi Xáo tam phân 119 Bảng 3.14 Ảnh hưởng TDZ tới phát sinh chồi Xáo tam phân 120 Bảng 3.15 Ảnh hưởng nhóm kết hợp BA TDZ tới khả phát sinh chồi Xáo tam phân .121 Bảng 3.16 Ảnh hưởng kết hợp BA α-NAA tới phát sinh chồi Xáo tam phân 122 Bảng 3.17 Ảnh hưởng kết hợp BA IBA tới phát sinh chồi Xáo tam phân 123 viii Bảng 3.18 Ảnh hưởng IBA α-NAA tới khả hình thành rễ Xáo tam phân in vitro 124 Bảng 3.19 Ảnh hưởng số loại giá thể tới khả sống in vitro 125 138 65 J.A., B., Extinction, survival and genetic variation” In: Schoenwald- Cox C.M., Chamber S.M., Macbryde B., Thomas L (eds), Genetics and Conservation, 1983: p 125-151 66 Weising K., N.H., Wolff K., Kahl G Cpc Press Taylor & Fancies group., DNA Fingerprinting in Plants Principles, Methods, and applications (second Edition) Cpc Press Taylor & Fancies group., 2005 67 B.H., M., Population Genetics John Wiley & Sons, Ltd., 2009 68 de Vicente M.C., L.C., Fulton T., Genetic Diversity Analysis with Molecular Marker Data: Learning Module y International Plant Genetic Resources Institute (IPGRI) and Cornell Universit, 2003 69 B.M., M.S.A.a.P., Analysis of genetic diversity in crop plants – salient statistical tools and considerations”, Crop Science 2003 43: p 1235–1248 70 Lê Trần Bình, H.H.N., Lê Thị Muội Cơng nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng NXB Nông nghiệp Hà Nội, 1997 71 Nguyễn Quang Thạch, N.T.L.A., Nguyễn Thị Phương Thảo, Giáo trình cơng nghệ sinh học Nông nghiệp NXB Nông Nghiệp Hà Nội, Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội, 2004 72 Nhut, D.T.L., Bui V.; Fukai, Seiichi; Tanaka, Michio and TThanh, Van K.T , Effects of activated charcoal, explant size, explant position and sucrose concentration on plant and shoot regeneration of Lilium longiflorum via young stem culture Plant Growth Regulation, 2001 33(1): p 59-65 73 Murashige T., S.E., 1962., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissues Plant Physiol 15((3): p 473- 497 74 Gamborg O L., M.R.A., Ojima K., , Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells Exp Cell Res., , 1968 50(1): p 151-158 75 George E F., d.K.G.J., The components of plant tissue culture media I: macro- and micro-nutrients In: George EF, Hall AM, de Klerk GJ (eds.) Plant Propagation by Tissue Culture, The Background, Springer, Dordrecht, The Netherlands , 2008 3rd Edition(1): p 65-102 76 Staden, M.J.P.J.v., Effect of activated charcoal, autoclaving and culture media on sucrose hydrolysis Plant Growth Regulation, 1999 29: p 135-141 77 Đào, L.T.K., Nghiên cứu thử nghiệm nhân số giống trồng rừng phương pháp nuôi cấy mô (Bạch đàn, Hông, Trầm hương) Tạp chí Sinh học, 2001: p 46-50 139 78 Debergh P, A.-C.J., Cohen D, Grout B, Von and Z.R Amold S, Ziv M, Reconsideration of the term “vitrification” as used in micropropagation Plant Cell Tissue Organ Cult 1992 30 p 135-140 79 Mabberley, D.J., The species of Citrus (Rutaceae) with pinnate leaves Blumea, 2010 55: p 73-74 80 Phan Hữu Tơn*, T.V.H., Đồn Văn Lư, Phạm Thị Dung, Nguyễn Xn Viết, Nuôi cấy in vitro trụ mầm giống cam (citrus sinensis), quýt (citrus reticulata) Tạp chí Khoa học Phát triển, 2014 12(5): p 641-649 81 Nguyễn Thị Tâm, P.H.V., Dương Hữu Lộc, Nghiên cứu tái sinh in vitro quýt bắc kạn Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 2017 171(11): p 65 - 69 82 Trương Thị Bích Phượng, N.T.H., Nghiên cứu tái sinh chồi in vitro xáo tam phân (Paramignya trimera) Tạp chí Khoa Học, Đại học Huế, 2014 3(1): p 562 576 83 Tran Trung Hieu, H.V.C., Bui Thi Linh Hue, Luong Thi My Ngan, Bui Lan Anh, Bui Văn Le, In vitro propagation of Xao tam phan (Paramignya trimera (Oliv.) Guill.) Science & Technology Development, 2017 20(2) 84 Barkley, N.A., et al., Assessing genetic diversity and population structure in a citrus germplasm collection utilizing simple sequence repeat markers (SSRs) Theor Appl Genet, 2006 112(8): p 1519-31 85 Corazza-Nunes MJ, M.M., Nunes CWM, Cristofani M, Targon MLPN Assessment of genetic variability in grapeiruits (Citrus paradisi Macf) and pummelos (C maxima (Burm.) Merr.) using RAPD and SSR markers Euphytica, 2002 126: p 169-176 86 Froelicher Y, D.D., Badssene JB, Costantino G, Lotiy S, Didout C, Beaumont V, Brottier P, Risterucci AM, Luro F, Ollitrauh P, Characterization of microsatellite markers in mandarin orange (Citrus reticulate Blanco) Mol Ecol Res 2008 8: p 119-122 87 Sun, Y., et al., Phylogenetic analysis of Sorghum and related taxa using internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA Theor Appl Genet, 1994 89(1): p 26-32 88 Kyndt, T., et al., Molecular phylogeny and evolution of Caricaceae based on rDNA internal transcribed spacers and chloroplast sequence data Mol Phylogenet Evol, 2005 37(2): p 442-59 89 Group, C.P.W., A DNA barcode for land plants Proc Natl Acad Sci U S A, 2009 106(31): p 12794-7 90 Klein R.M., K.D.T., Research methods in Plant science Garden City, Newyork Natural History Press, 1970 140 91 Thìn, N.N., Các phương pháp nghiên cứu thực vật Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội, 2007 92 Doyle JJ, D.J., Isolation of plant DNA from fresh tissue Focus, 1990 12: p 13-15 93 Hall, T.A., BioEdit: A User-Friendly Biological Sequence Alignment Editor and Analysis Program for Windows 95/98/NT Nucleic Acids Symposium Series,, 1999(41): p 95-98 94 R.K., N.M.a.C., Estimation of fixation indices and gene diversitie Ann Hum Genet., 1983 47: p 253-259 95 Yang, F., et al., DNA Barcoding for the Identification and Authentication of Animal Species in Traditional Medicine Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2018 2018: p 1-18 96 McCown, B.H.a.L., G., Woody Plant Medium (WPM)—A Mineral Nutrient Formulation for Microculture of Woody Plant Species HortScience, 1981 16: p 453-453 97 L Knudson, L.K., L A KNUDSON, C Knudson, A new nutrient solution for the germination of orchid seeds American Orquid Society Bulletim, 1946 13(5): p 222222 98 Bayer RJ, M.D., MortonC, A molecular phylogeny of the orange subfamily(Rutaceae: Aurantioideae) using nine cpDNA sequences American Journal of Botany, 2009 96(3): p 668–685 99 Shin HS., Y.H., Kim SB., Lee MS , Mechanism of growth of colloidal silver nanoparticles stabilized by polyvinyl pyrrolidone in gamma – irradiated silver nitrate solution J Colloid interface Sci., 2004 274(1): p 89-94 100 Wang G., S.C., Zhao N., Du X , Synthesis and characterization of Ag nanoparticles assembled in ordered array pores of porous anodic alumina by chemical deposition Materials Letters, 2007 61(18): p 3795-3797 101 Reza A.G., U.R.S., Maheran A.A., Rosfarizan M., Influence of cytokinins in combination with GA3 on shoot multiplication and elongation of tea clone Iran 100 (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) ScientificWorld Journal , 2014: p 943054 102 Mehdi M., V.-O.G.O., Sepide T , The effect of different concentrations of TDZ and BA on in vitro regeneration of Iranian cannabis (Cannabis sativa) using cotyledon and epicotyl explants Journal of Plant Molecular Breeding, 2015 3(2): p 20-27 141 PHỤ LỤC Bảng Tổng hợp mẫu thu thập phân loại dựa vào hình thái Các mẫu thu thập 260/280 Nồng độ gốc Độ pha lỗng Độ pha lỗng cho * (ng/µl) cho mồi ITS mồi MatK rbcL P.trimera X1 PT.X1.1 1,82 256 200 100 PT.X1.2 1,85 350 250 150 PT.X1.3 1,91 365 250 150 PT.X1.4 1,84 270 200 100 PT.X1.5 1,96 324 250 150 PT.X1.6 1,90 456 300 150 PT.X1.7 1,87 273 200 100 PT.X2.1 1,96 368 250 150 PT.X2.2 1,75 412 300 150 PT.X2.3 1,82 281 250 150 PT.X2.4 1,94 365 250 150 PT.X2.5 1,83 273 200 100 PT.X3.1 1,92 257 200 100 PT.X3.2 1,94 354 250 150 PT.X3.3 1,87 349 250 150 PT.X3.4 1,80 475 300 150 PT.X3.5 1,86 289 250 150 PT.X3.6 1,93 376 250 150 PT.X4.1 2,01 314 250 150 PT.X4.2 1,84 318 250 150 PT.X4.3 1,89 326 250 150 PT.X4.4 1,93 319 250 150 PT.X4.5 1,98 412 300 150 P.trimera X2 P.trimera X3 P.trimera X4 142 P.trimera X5 PT.X5.1 1,97 367 250 150 PT.X5.2 1,93 340 250 150 PT.X5.3 1,89 413 300 150 PT.X5.4 1,80 368 250 150 PT.X5.5 1,82 342 250 150 PT.X5.6 2,03 279 200 100 PA.1 1,78 341 250 150 PA.2 2,01 324 250 150 PA.3 1,97 367 250 150 PA.4 1,82 415 300 150 PA.5 1,89 279 200 100 PM.1 1,79 367 250 150 PM.2 1,84 356 250 150 PM.3 1,98 309 250 150 PM.4 2.02 275 200 100 PM.5 1,97 298 200 100 PM.6 1,81 300 200 100 PS.1 1,82 305 250 150 PS.2 1,77 379 250 150 PS.3 1,95 287 200 100 PS.4 1,80 370 250 150 PS.5 1,75 325 200 100 PR.1 2,03 289 200 100 PR.2 1,90 315 250 150 PR.3 1,89 320 250 150 PR.4 1,74 356 250 150 PR.5 1,98 267 250 150 P armata P monophylla P scandens P rectispinosa (*) Số liệu làm tròn đến phần đơn vị (nano gram/microlit) 143 Bảng Các trình tự thị ITS, MatK rbcL đăng ký GenBank Tên mẫu ký hiệu Vị trí mẫu trình tự đăng ký địa lý NCBI P armata PA.VN matK rbcL Kinh độ/Vĩ độ 109°22’52”E MT193832 MT215519 MT215530 11°40’24”N, P monophylla PR.DL Di Linh Wight Lâm Đồng PR.CT ITS Ninh Hải Khánh MT193825 MT215526 MT215536 12°52’42”N, Hòa P scandens Số truy cập GenBank/NCBI 108°30’12”E Cát Tiên, Lâm MT193830 MT215518 MT215535 11°41’15”N, Đồng 108°33’39”E P.trimera PT1.NV Ninh Van, MT193826 MT215522 MT215529 12°38’80”N, (Oliv.) Burkill PT2.NV Khanh Hoa MT193827 MT215524 MT215528 109°27’72”E 12°26’06”N, 109°12’40”E Hòa, MT193831 MT215523 MT215533 12°25’25”N, PT1.NH Ninh PT2.NH Khánh Hòa MT193833 MT215525 MT215532 109°04’55”E 12°25’09”N, 109°08’18”E PT2.DK Diên Khánh, MT193834 MT215521 MT215534 12°13’14”N, Khánh Hòa P rectispinosa PC.DD 109°01’05”E Cát Tiên, Lâm MT193828 MT215517 MT215527 11°44’12”N, Đồng 107°20’32”E 144 145 Hình Kết nhiều trình tự ITS mẫu nghiên cứu chương trình Clustal Omega Ghi chú: Vùng trình tự ITS lồi thuộc chi Paramignya 146 147 148 Hình Kết nhiều trình tự matK mẫu nghiên cứu chương trình Clustal Omega Ghi chú: Vùng trình tự matK loài thuộc chi Paramignya 149 150 151 152 Hình Kết nhiều trình tự rbcL mẫu nghiên cứu chương trình Clustal Omega Ghi chú: Vùng trình tự rbcL lồi thuộc chi Paramignya Hình Ma trận phần trăm giống cặp trình tự nhóm trình tự ITS, matK, rbcL Ghi chú: Các trình tự ITS (trên), trình tự matK (giữa) trình tự rbcL (dưới)