Untitled Science & Technology Development, Vol 20, No T2 2017 Trang 48 Nhân giống in vitro Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv ) Guill ) Trần Trung Hiếu Huỳnh Văn Chung Bùi Thị Linh Huệ Lươ[.]
Science & Technology Development, Vol 20, No.T2-2017 Nhân giống in vitro Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guill.) Trần Trung Hiếu Huỳnh Văn Chung Bùi Thị Linh Huệ Lương Thị Mỹ Ngân Bùi Lan Anh Bùi Văn Lệ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM (Bài nhận ngày 22 tháng 08 năm 2016, nhận đăng ngày 03 tháng 05 năm 2017) TÓM TẮT tăng trưởng chậm đạt chiều cao từ 1–3 cm Xáo tam phân (Paramignya trimera) sử sau tháng nuôi cấy Các cụm chồi không dụng dân gian nguồn dược liệu thành lập rễ sau tháng nuôi cấy môi quý cho việc chữa trị nhiều loại bệnh ung thư trường tạo rễ chứa IBA và/hoặc NAA 1–5 mg/L khác Sự truyền miệng dân gian Có 51 % cụm chồi (đã xử lý mơi đặc tính thần kỳ thân rễ làm cho trường tạo rễ) có khả thích nghi tạo thân chúng bị khai thác cạn kiệt Phú Yên, Khánh sau tháng ni trồng vườn Hịa Ninh Thuận Đề tài thực ươm Mơi trường WPM có STS 3, BA IBA nhằm thiết lập quy trình nhân giống in vitro mg/L cho thành lập mô sẹo nhiều từ để bảo tồn loài dược liệu Các cụm chồi bất mẫu trưởng thành sau tháng nuôi cấy Trong định (5–8 chồi/cụm) tái sinh từ đoạn số loại mô sẹo, mô sẹo màu trắng đục thân mang chồi bên (của 1–3 năm tuổi) sau tạo mặt cắt mô sau tháng tháng nuôi cấy môi trường nuôi cấy thân nuôi cấy phát triển thành mô sẹo dạng gỗ WPM (Woody Plant Medium) có chứa STS nốt sau tuần (silver thiosulfate) BA 5–7 mg/L STS sử dụng để ngăn chặn rụng Các cụm chồi Từ khóa: mô sẹo, nhân giống in vitro, Paramignya trimera, tái sinh chồi, xáo tam phân MỞ ĐẦU Chi Paramignya thuộc họ Cam chanh (Rutaceae) gồm khoảng 15 loài thân gỗ nhỏ, dạng dây leo có nguồn gốc từ phía nam đông nam châu Á miền bắc nước Úc [1, 2] Theo P.H Hộ (2000), Việt Nam có lồi, Xáo tam phân (XTP) Paramignya trimera (Oliv.) Guill tìm thấy núi Lấp Vò, Tây Ninh [3] Trước đây, hầu hết loài chi Paramignya xếp vào chi Atalantia nên XTP cịn có đồng danh khác A trimera (Oliv.) [1] Tuy nhiên, theo Burkill (1931), chi Paramignya cho nhỏ chứa đầy chất keo nhầy Trang 48 khơng có túi nhỏ chứa nước (pulp vesicles), A trimera nên gọi P trimera [4] Chi Paramignya gần gũi với chi Luvunga nên Mabberley (1998) xếp P trimera vào chi Luvunga với tên khoa học L monophylla (DC.) Mabb [5] Ngồi ra, P trimera cịn có tên đồng nghĩa khác Triphasia monophylla DC A recurva Benth [4, 5] Nhiều loài chi Paramignya biết đến thuốc, ngồi cịn có khả kháng lại bệnh thối mục loại nấm gây TAÏP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T2- 2017 bệnh thực vật [1] Xáo Griffithii (P griffithii) phân bố Nha Trang, Lâm Đồng [3], vỏ thân Xáo Griffithii sử dụng để chữa trị viêm mũi Thái Lan [6] Rễ Xáo hoa (P monophylla) sử dụng loại thuốc bổ, vò dập để đắp bên vết thương rắn cắn cho vật nuôi ăn bị chứng huyết niệu xuất huyết tiêu hóa [7] Xáo cựa gà (P armata Oliv var andamanica King) Đà Nẵng, Nha Trang cho trái dùng trị ho [3] Ở Lâm Đồng, loài Xáo leo (P scandens) báo cáo có hoạt tính kháng viêm, kháng ung thư biểu mơ ung thư gan [8] Theo Viện Dược Liệu Việt Nam, XTP sử dụng thuốc tỉnh Khánh Hịa, có tác dụng ức chế viêm gan cấp chuột trắng có hoạt tính kháng nhiều loại tế bào ung thư ung thư gan, ung thư vú, ung thư đại tràng, ung thư buồng trứng ung thư cổ tử cung [9] Ngoài ra, rễ XTP cịn chứa hoạt chất kháng oxy hóa [10] Trong năm vừa qua, thiếu nhận thức thổi phồng giá trị y học XTP tạo nên sốt giá làm cho loài loài tương tự bị khai thác tận kiệt Phú Yên, Khánh Hòa Ninh A) B) Thuận Việc nhân giống XTP thu nhận sinh khối in vitro chưa quan tâm nghiên cứu nước Các nghiên cứu họ Cam chanh thường tập trung lồi thuộc chi cho lớn có giá trị thương mại, Citrus spp Citropsis spp [11-13] Do đó, đề tài nhân giống vơ tính in vitro Xáo tam phân thực nhằm góp phần vào việc xây dựng quy trình nhân giống giúp bảo tồn nguồn gene nhân sinh khối mô sẹo in vitro giúp cho việc khảo sát hợp chất có giá trị y học VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Chồi Xáo tam phân (XTP) Mẫu cấy đoạn chồi non dài 10–12 cm mang 8–10 chồi bên lá, dài 5–10 cm rộng 0,5–1 cm (Hình 1A) Các đoạn chồi thu nhận từ 1–3 năm tuổi PGS.TS Bùi Văn Lệ (Bộ môn CNSH Thực vật Chuyển hóa Sinh học) sưu tập ni trồng Ngồi ra, chúng tơi thu thập số mẫu chồi từ Trạm thực nghiệm CNSH Hòa Quang, Trung tâm Ứng dụng Chuyển giao Công nghệ, Sở Khoa học Cơng nghệ Tỉnh Phú n C) Hình Mẫu cấy chồi XTP (A) từ 1–3 năm tuổi Mẫu trưởng thành (B) mẫu non in vitro (C) Môi trường điều kiện nuôi cấy Môi trường muối khoáng MS (Murashige Skoog, 1962) môi trường nuôi cấy thân gỗ WPM (Woody Plant Medium) (Lloyd McCown, 1981) sử dụng Tất môi trường bổ sung vitamine Morel mL/L, inositol 100 mg/L, glycine mg/L, malt extract 500 mg/L saccharose 50 g/L pH 5,7 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA (6-benzylaminopurine), IBA (indole-3-butyric acid), NAA (1-naphthaleneacetic acid) 2,4-D Trang 49 Science & Technology Development, Vol 20, No.T2-2017 (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) thêm vào mơi trường tùy theo mục đích thí nghiệm Các mẫu cấy đặt phịng ni với điều kiện chiếu sáng 3.000–5.000 lux 16 sáng tối 25 ± oC Để ức chế rụng chồi in vitro, STS (silver thiosulfate, Ag2O3S2) mg/L bổ sung vào môi trường nuôi cấy Phương pháp khử trùng mẫu cấy chồi lá Các đoạn thân mang 3–4 chồi bên cắt bỏ Các đoạn thân mẫu ngâm nước xà bơng lỗng rửa vịi nước chảy Trong tủ cấy vơ trùng, đoạn thân lắc phút cồn 70 % khử trùng lần thứ với dung dịch hypochloride calcium (Ca(OCl)2) 10 % khoảng thời gian khác (15, 20 25 phút) Sau rửa lần nước cất vô trùng, đoạn chồi cắt thành đoạn thân mang chồi bên, mẫu cắt ngang thành đoạn 1cm (Hình 1B) Sau đó, mẫu cấy khử trùng lần nồng độ 2,5 % 20, 25 30 phút (Bảng 1) Khảo sát môi trường nuôi cấy thích hợp cho tăng trưởng chồi thành lập cụm chồi từ chồi bên Nhằm khảo sát môi trường khống thích hợp cho tăng trưởng chồi, đoạn thân mang chồi bên nuôi cấy môi trường MS WPM bổ sung BA mg/L Sự thành lập cụm chồi từ chồi bên khảo sát mơi trường khống thích hợp với nồng độ BA khác 1–7 mg/L Khảo sát thành lập mô sẹo từ lá Sau khử trùng cắt bỏ phần mô chết, mẫu cấy từ chồi trưởng thành (Hình 1B) cắt ngang thành đoạn dài 2–3 mm Các non (dài 20–30 mm) chồi in vitro thu nhận cắt ngang thành đoạn dài 2–3 mm (Hình 1C) Sự tái sinh mơ sẹo từ mẫu trưởng thành non in vitro khảo Trang 50 sát đĩa mơi trường WPM có BA, IBA 2,4-D 0–5 mg/L Khảo sát tăng trưởng tạo rễ của cụm chồi in vitro ex vitro Sự tăng trưởng tạo rễ cụm chồi in vitro khảo sát mơi trường ni cấy thích hợp bổ sung IBA NAA 0–5 mg/L nuôi trồng vườn ươm, chậu đất gồm đất sơ dừa : tro trấu : cát với tỉ lệ 1:1:1 với điều kiện phun sương tự động phút phun cách khoảng giờ/lần từ 6:00 đến 21:00 để theo dõi tăng trưởng cụm chồi thành lập rễ ex vitro KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khử trùng mẫu cấy chồi lá Đối với mẫu chồi bên, kết Bảng cho thấy với nồng độ khử trùng lần (10 % 15 phút) lần (5 % 20 phút), 62 % mẫu chồi vô trùng khỏe mạnh ghi nhận Trong đó, nồng độ khử trùng với thời gian khử trùng dài (20–30 phút), kết thu 39–45 % mẫu chồi vô trùng khỏe mạnh, số chồi cịn lại khơng có khả tăng trưởng chết tác động Ca(OCl)2 sau tuần nuôi cấy Tuy nhiên, với nồng độ khử trùng thấp (5 % lần 2,5 % lần 2) hầu hết chồi bị nhiễm vi khuẩn nấm mốc, số chồi vô trùng khỏe mạnh đạt từ 11– 41 % tùy theo thời gian khử trùng Đối với mẫu lá, với nồng độ khử trùng lần (5 % 25 phút) lần (2,5 % 30 phút) cho 76 % mẫu sống sót vơ trùng, mẫu lại bị nhiễm vi khuẩn sau 1–4 tuần nuôi cấy Tuy nhiên, nồng độ khử trùng với thời gian khử trùng ngắn (15–25 phút), hầu hết mẫu bị nhiễm, số mẫu sống sót vơ trùng đạt 34–52 % Ở nồng độ khử trùng cao (10 % lần % lần 2) số mẫu sống vô trùng đạt 8–17 %, đa số mẫu chết tác động chất khử trùng (Bảng 1) TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SOÁ T2- 2017 Bảng Phần trăm mẫu chồi vơ trùng có khả tăng trưởng sau tuần môi trường MS Thời gian khử trùng (phút): (lần 1)/(lần 2) (15)/(20) (20)/(25) (25)/(30) *SE: Phần trăm mẫu cấy vô trùng (% ± SE*) Mẫu chồi bên Mẫu [5]/[2,5]** [10]/[5] [5]/[2,5] [10]/[5] 10,7 ± 1,47 62,2 ± 8,73 34,4 ± 3,29 8,1 ± 1,01 33,0 ± 4,90 38,5 ± 4,50 52,3 ± 2,75 11,0 ± 1,82 40,7 ± 5,59 44,5 ± 5,17 76,0 ± 3,97 16,6 ± 2,00 Sai số chuẩn (Standard Error) ** Nồng độ dung dịch khử trùng [% Ca(OCl)2]: [lần 1]/[lần 2] Môi trường ni cấy thích hợp cho tăng trưởng chồi mạnh môi trường MS Chồi đạt chiều cao từ 10–13 mm môi trường WPM 5–8 mm môi trường MS sau 12 tuần nuôi cấy (Hình 2) Do đó, mơi trường WPM sử dụng cho nghiên cứu Các chồi bên có khả tăng trưởng tốt mơi trường MS WPM Tuy nhiên, môi trường WPM, chồi tăng trưởng A) B) Hình Chồi tăng trưởng môi trường MS (A) môi trường WPM (B) sau 12 tuần nuôi cấy Sự thành lập cụm chồi từ chồi bên Kết Bảng cho thấy, mơi trường có BA 0–3 mg/L, có 1–3 chồi thành lập sau 12 tuần ni cấy (Hình 3A 3B) Trên mơi trường có BA mg/L, có 5–8 chồi thành lập (Hình 3C) Sự gia tăng nồng độ BA giúp ức chế ưu kích thích tái sinh chồi dẫn đến hình thành cụm chồi từ chồi bên Tuy nhiên, thành lập cụm chồi nên chiều cao chồi trung bình đạt 3–4 mm môi trường BA 5–7 mg/L so với chồi (cao 9– 13 mm) mơi trường có BA 1–3 mg/L sau 12 tuần nuôi cấy Bảng Sự thành lập cụm chồi từ chồi bên tăng trưởng chồi môi trường WPM sau 12 tuần cấy 1–2 Số chồi trung bình ± SE 1,2 ± 0,11 Chiều cao chồi trung bình ± SE (mm) 13,2 ± 0,48 25 2–3 2,4 ± 0,10 8,6 ± 0,30 21 5–7 5,5 ± 0,16 4,1 ± 0,26 19 5–8 5,8 ± 0,27 3,4 ± 0,18 BA (mg/L) Số mẫu cấy Số chồi/mẫu cấy 17 Trang 51 Science & Technology Development, Vol 20, No.T2-2017 A) B) C) Hình Sự tái sinh tăng trưởng cụm chồi từ chồi bên sau 12 tuần nuôi cấy môi trường WPM có BA (A); BA (B); BA mg/L (C) Sau 8–12 tuần nuôi cấy, cụm chồi thường bị rụng cấy chuyền sang môi trường Sự rụng chồi nuôi cấy in vitro tượng thường gặp nhiều loài thân gỗ, làm chậm tăng trưởng khả thành lập rễ chồi dẫn đến hoại tử chết chồi bị tách khỏi cụm chồi [14-17] Hiện tượng rụng nuôi cấy in vitro báo cáo sản xuất ethylene chồi mô cấy [18, 19] Nhiều nghiên cứu cho thấy việc thêm AgNO3 STS vào mơi trường ức chế hoạt động ethylene chồi mô nuôi cấy giúp gia tăng chiều cao chồi thúc đẩy sinh tạo hình thái A) B) mô [15, 16, 20-22] Theo Lemos Blake (1996), việc thêm STS 0,5 mg/L vào môi trường WPM giúp kiểm soát rụng chồi na (Annona squamosa) [15] Trong nghiên cứu trước chúng tôi, AgNO3 mg/L làm giảm rụng chồi na [17] Trong đó, theo Shukor cộng (2008), cần AgNO3 10 mg/L để vượt qua rụng sầu đâu cao (Azadirachta excelsa) [16] Trong nghiên cứu này, với STS mg/L giúp khắc phục tượng rụng chồi XTP tăng trưởng kích thích tăng trưởng cụm chồi sau 12–16 tuần ni cấy (Hình 4) C) D) Hình Các cụm chồi bị rụng phục hồi môi trường WPM bổ sung STS BA (A); BA (B); BA mg/L (C) sau 14 tuần nuôi cấy Cụm chồi tăng trưởng mơi trường WPM có STS BA mg/L (D) sau 16 tuần Sau 16 tuần ni cấy mơi trường WPM có STS BA 5–7 mg/L, cụm chồi (5–8 chồi/cụm) đạt chiều cao từ 1–3 cm (Hình 4D) cấy chuyền sang mơi trường WPM có STS IBA kết hợp với NAA 1–5 mg/L để khảo sát tăng trưởng thành lập rễ Sự thành lập mô sẹo từ mẫu cấy lá Sự tái sinh mô sẹo từ mẫu trưởng thành non in vitro ghi nhận Trang 52 mơi trường WPM có STS BA, IBA 2,4-D 0–5 mg/L (Bảng 3) Các mẫu non in vitro hóa nâu chết sau 4–8 tuần mơi trường có BA, IBA 2,4-D Trong đó, mơi trường chứa BA kết hợp với IBA mg/L môi trường chứa BA 2,5 kết hợp với IBA 2,5 mg/L có 31 16 % mẫu non cịn sống Trên mơi trường chứa BA kết hợp với 2,4-D có 7–9 % mẫu non cịn sống TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T2- 2017 Tuy nhiên, khơng có tái sinh tất mẫu non ghi nhận sau 16 tuần nuôi cấy Đối với mẫu trưởng thành, hóa nâu dần chết sau 8–12 tuần môi trường chứa BA, IBA 2,4-D, BA kết hợp với 2,4-D Trên môi trường chứa BA kết hợp với IBA mg/L môi trường chứa BA 2,5 kết hợp với IBA 2,5 mg/L có 47 12 % mẫu thành lập mô sẹo sau 12 tuần nuôi cấy (Hình 5A) Hầu hết thành lập mơ sẹo trắng xốp mặt cắt hai đầu gân (Hình 5B 5C) Đầu tiên mơ sẹo đươc tái sinh từ bó mạch trung tâm gân (Hình 5B) sau 12 tuần, sau tiếp tục phát sinh lan rộng toàn bề mặt gân (Hình 5C 5D) loại mơ sẹo thành lập bề mặt (Hình 5E) sau 16 tuần ni cấy Một dạng mô sẹo khác thành lập bề mặt biểu bì lá, nốt mơ sẹo nhỏ, màu trắng (Hình 5F) phát triển thành cụm nhỏ 0,5 mm có cấu trúc khối phôi (hoặc chồi) phát sinh từ tế bào biểu bì sau 10–12 tuần cấy (Hình 5G) Ngồi ra, cịn có dạng mơ sẹo bóng, màu trắng đục thành lập mặt cắt phiến (Hình 5H) sau 12 tuần cấy Tuy nhiên, có 21 % mẫu thành lập khối mô sẹo tổng số mẫu có khả thành lập mô sẹo Các khối mô sẹo tiếp tục phát triển thành lập cụm nhỏ (0,3–0,5 mm) có cấu trúc khối phơi (hoặc chồi) bề mặt mơ sẹo (Hình 5I) sau 16 tuần cấy Sự phát sinh hình thái từ khối mơ sẹo tiếp tục theo dõi Bảng Sự thành lập mô sẹo mẫu trưởng thành môi trường WPM Nồng độ (mg/L) BA IBA 2,4-D 0 2,5 0 0 2,5 0 0 2,5 0 % mẫu đáp ứng 0 0 0 Thời gian thành lập mô sẹo (ngày) 0 0 0 2,5 2,5 11,7±2,04 124,6±7,47 5 46,7±4,25 89,6±5,14 2,5 0 2,5 0 0 Ethylene ảnh hưởng tiêu cực lên tăng sinh mơ sẹo, q trình tạo phơi tái sinh chồi [23] Khi có diện AgNO3 STS, mô sẹo phôi soma Leucojum aestivum không sản sinh ethylene [19] Sự kết hợp AgNO3 với BA NAA thúc đẩy thành lập mô sẹo tăng trưởng chồi sầu đâu cao (A excelsa) [16] Trong nghiên cứu này, sử dụng Hình thái mô sẹo - Mô sẹo trắng xốp mặt cắt gân bề mặt - Các nốt mô sẹo trắng bóng bề mặt - Mơ sẹo bóng, màu trắng đục mặt cắt phiến - STS môi trường thành lập mô sẹo từ XTP Trên mơi trường khơng có STS, mẫu hóa nâu chết Trong đó, mơi trường có kết hợp STS với BA IBA, mơ sẹo hình thành Tuy nhiên, khơng có mẫu đáp ứng cho thành lập mơ sẹo có kết hợp STS với BA 2,4-D Sự thành lập mô sẹo từ khác tùy theo loài Theo Sree Trang 53 Science & Technology Development, Vol 20, No.T2-2017 cộng (2016), khối mô sẹo trắng thành lập từ mẫu trưởng thành A monophylla (một loài gần với XTP) mơi trường có 2,4-D 0,5–5,0 mg/L, khơng có thành lập mơ sẹo ghi nhận có kết hợp BA với 2,4-D BA với IAA [24] Các mô sẹo thành lập từ gân bề mặt lá, chưa có tái sinh chồi báo cáo [24] A) B) C) D) E) F) G) H) I) Hình Sự thành lập mô sẹo từ trưởng thành (A, mũi tên mô sẹo) Sự tái sinh mô sẹo trắng xốp từ bó mạch gân (B) hai đầu gân (C), mô sẹo tăng sinh mặt cắt gân (D) bề mặt (E) Sự thành lập nốt mô sẹo nhỏ, màu trắng bề mặt biểu bì (F, mũi tên) phát triển thành cụm mô sẹo nhỏ có cấu trúc giống khối phơi (G, mũi tên) Sự thành lập mơ sẹo bóng, màu trắng đục mặt cắt phiến (H) phát triển thành cụm mơ sẹo nhỏ có cấu trúc khối phôi bề mặt mô sẹo (I, mũi tên) Sự tăng trưởng chồi tạo rễ của cụm chồi nuôi cấy in vitro ex vitro Sự tăng trưởng thành lập rễ cụm chồi mơi trường WPM có STS kết hợp với IBA và/hoặc NAA 1–5 mg/L ghi nhận Bảng Các cụm chồi (cao 1–3 cm) tăng trưởng chậm không thành lập rễ sau tuần ni cấy Do đó, cụm chồi chuyển vườn ươm Sau tuần nuôi trồng với 45 cụm chồi khảo sát, có 23 cụm (chiếm 51 %) có khả sống sót tăng trưởng (Bảng Trang 54 4, Hình 6A) Kết cho thấy cụm chồi nuôi cấy môi trường có IBA, NAA, IBA kết hợp với NAA 3–5 mg/L cho cụm chồi có khả tăng trưởng thành lập rễ sau tuần vườn ươm Mặc dù tỉ lệ cụm chồi sống sót thành lập rễ điều kiện ex vitro thấp, bước đầu cho thấy có khả nhân giống XTP điều kiện in vitro ex vitro Sau tháng nuôi trồng cụm chồi đạt chiều cao từ 8–15 cm với 5–12 (dài 3–5 cm) thành lập (Hình 6B) TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T2- 2017 Bảng Sự thành lập rễ cụm chồi môi trường WPM nuôi cấy in vitro ex vitro Auxin (mg/L) IBA NAA 0 0 0,5 0,5 1,5 1,5 2,5 2,5 Tổng số: A) Số cụm chồi khảo sát 6 5 45 Số cụm chồi tạo rễ in vitro 0 0 0 0 0 Số cụm chồi tạo rễ ex vitro 0 4 23 (51 %) Chiều cao chồi (mm) 90 100 120 100 80 150 B) Hình Cụm chồi (4 tháng tuổi) (A) tháng tuổi (B) tăng trưởng điều kiện ex vitro KẾT LUẬN Quy trình nhân giống in vitro Xáo tam phân (P trimera) thiết lập từ đoạn thân mang chồi bên 1–3 năm tuổi ngồi vườn ươm Mơi trường WPM bổ sung STS BA mg/L thích hợp cho tăng trưởng hạn chế rụng cụm chồi Các cụm chồi (5–8 chồi/cụm, cao 1–3 cm) tái sinh từ chồi bên sau tháng nuôi cấy Sau tháng nuôi cấy môi trường WPM chứa STS IBA, NAA IBA kết hợp với NAA 3–5 mg/L, cụm chồi có khả thành lập rễ vườn ươm sau tháng trồng đất Ba hình thái phát sinh mô sẹo từ ghi nhận môi trường WPM có STS BA kết hợp với IBA 2,5–5,0 mg/L sau 12–16 tuần nuôi cấy Các nốt mơ sẹo trắng bóng bề mặt mơ sẹo bóng, màu trắng đục mặt cắt phiến có tiềm tái sinh chồi Lời cảm ơn: Nghiên cứu tài trợ Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh (ĐHQGHCM) khn khổ Đề tài mã số C2015-1824 Trang 55 Science & Technology Development, Vol 20, No.T2-2017 In vitro propagation of Xao tam phan (Paramignya trimera (Oliv.) Guill.) Tran Trung Hieu Huynh Van Chung Bui Thi Linh Hue Luong Thi My Ngan Bui Lan Anh Bui Văn Le University of Science, VNU-HCM ABSTRACT prevent the leaf abscission These shoot clusters Paramignya trimera (Oliv.) Guill., a woody grew slowly and reached 1–3 cm in heights after climber commonly known as "Xao tam phan", months of the cultures These shoot clusters did has been used in Vietnamese folk for the not form any roots after months of culture on treatment of numerous cancers Due to word of the rooting media with IBA and/or NAA 1–5 mouth about the anticancer properties of this mg/L However, there was 51 % of the treated plant, its stems and roots have been shoot clusters acclimatized and produced new overexploited leading to the serious decline of stem and leaves after months growing in this species in Phu Yen, Khanh Hoa and Ninh greenhouse WPM supplemented with STS 3, BA Thuan provinces The aim of the study was to and IBA mg/L showed the best response for establish an in vitro propagation protocol for the callus induction in leaf explants after months of conservation of P trimera In this research shoot cultures Among the callus types, the milky white clusters (5–8 shoots/cluster) were regenerated compact calli were induced at the cut surface of from axillary bud explants of 1–3 year-old trees leaf explants after months of the cultures and after months of cultures on the WPM (woody became the compact and nodulated calli within plant medium) supplemented with STS and BA weeks later 5–7 mg/L STS (silver thiosulfate) was used to Key words: callus, in vitro propagation, Paramignya trimera, shoot regeneration, Xao Tam Phan TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] R.R Krueger, L Navarro, Citrus germplasm resources (Chap 4), In Citrus Genertics, Breeding and Biotechnology, ed by I.A Khan, CAB International, 45–140 (2007) [2] D Zhang, T.G Hartley, Paramignya Wight, Ill Ind Bot 1: 108 1838., Fl China, 11, 88 (2008) [3] P.H Hộ, Cây cỏ Việt Nam, Vol 2, Nxb Trẻ TP HCM (2000) [4] I.H Burkill, An enumeration of the species of Paramignya, Atalantia and Citrus found in Malaya, Gard Bull Straits Settlem 5, 212– 223 (1931) Trang 56 [5] D.J Mabberley, Australian Citreae with notes on other Aurantioideae (Rutaceae), Telopea 7, 4, 333–344 (1998) [6] C Wattanapiromsakul, P.G Waterman, Flavanone, triterpene and chromene derivatives from the stems of Paramignya griffithii, Phytochem, 55, 269–273 (2000) [7] D.M.A Jayaweera, Medicinal plants (indigenous and exotic) used in Ceylon: Rutaceae – Zygophyllaceae, National Science Council of Sri Lanka 5, 31 (1982) [8] N.M Khởi, P.TN Hằng, Đ.T Phương, Nghiên cứu độc tính cấp, tác dụng bảo vệ TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T2- 2017 gan tác dụng gây độc tế bào ung thư Xáo tam phân, Tạp chí Dược liệu, 18, 1, 14– 19 (2013) [9] N.T.D Thuần, Nghiên cứu thành phần hóa học khảo sát hoạt tính sinh học loài xáo leo (Paramignya scandens (Griff.) Craib.) Lâm Đồng, Luận án Tiến sỹ khoa học, Viện Hóa Sinh Biển, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, 1–120 (2015) [10] V.T Nguyen, M.C Bowyer, Q.V Vuong, I.A.V Altena, C.J Scarlett, Phytochemicals and antioxidant capacity of Xao tam phan (Paramignya trimera) root as affected by various solvents and extraction methods, Ind Crop Prod., 67, 192–200 (2015) [11] J.T Ling, M Iwamasa,Plant regeneration from embryogenic calli of six Citrus related genera, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 49, 145–148 (1997) [12] D.T Nhut, J.A.T da Silva, B.V Le, K.T.T Van, Thin cell layer (TCL) morphogenesis as a powerful tool in woody plant and fruit crop micropropagation and biotechnology, floral genetics and genetic transformation In Micropropagation of Woody Trees and Fruits, Springer, Netherlands, 783–814 (2003) [13] M Dutt, M Vasconcellos, K.J Song, F.G Gmitter Jr, J.W Grosser, In vitro production of autotetraploid Ponkan mandarin (Citrus reticulata Blanco) using cell suspension cultures, Euphytica 173, 2, 235–242 (2010) [14] G.L Sita, B.V.R Swamy, Regeneration of plantlets from leaf disc cultures of rosewood: control of leaf abscission and shoot tip necrosis Plant Sci 88, 1, 107–112 (1993) [15] E.E.P Lemos, J Blake, Micropropagation of juvenile and adult Annona squamosa., Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 46, 77–79 (1996) [16] N.A.A Shukor, J.E Jainol, A.M Yusoff, MA Kadir, Defoliation of in vitro shootlets of Azadirachta excelsa (Jack) M Jacobs – a possible solution, Malaysian Forester 71, 1, 37–44 (2008) [17] H.T.K Yến Nhân giống in vitro Cây Na (Annona squamosa L.) Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TP HCM, trang 32–43 (2015) [18] E.C Pua, G.L Chi, De novo shoot morphogenesis and plant growth of mustard (Brassica juncea) in vitro in relation to ethylene, Physiol Plant 88, 467–474 (1993) [19] A Ptak, A.E Tahchy, G Wyżgolik, M Henry, D Laurain-Mattar, Effects of ethylene on somatic embryogenesis and galanthamine content in Leucojum aestivum L cultures, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 102, 1, 61–67 (2010) [20] H Telgen, V Elagöz , A.V Mil, A Paffen, G Klerk, Role of plant hormones in lateral bud growth of rose and apple in vitro In International Symposium on Transplant Production Systems 319, 137–142 (1992) [21] M.H.C de Carvalho, B Van Le, Y ZuilyFodil, A.T.P Thi, K.T.T Van, Efficient whole plant regeneration of common bean (Phaseolus vulgaris L.) using thin-cell-layer culture and silver nitrate Plant Sci, 159, 2, 223–232 (2000) [22] V Kumar, G Parvatam, G.A Ravishankar, AgNO3: a potential regulator of ethylene activity and plant growth modulator Electron J Biotechnol., 12, 2, 8–9 (2009) [23] N.L Biddington, The influence of ethylene in plant tissue culture, Plant Growth Regul., 11, 2, 173–178 (1992) [24] S.J Sree, N Vijayakumar, K.S Gomathi, Effect of plant growth regulators on callus induction in Atalantia monophylla and Pamburus missionis, Int J Curr Res Biosci Plant Biol., 3, 3, 21–25 (2016) Trang 57 ... sinh chồi báo cáo [24] A) B) C) D) E) F) G) H) I) Hình Sự thành lập mô sẹo từ trưởng thành (A, mũi tên mô sẹo) Sự tái sinh mô sẹo trắng xốp từ bó mạch gân (B) hai đầu gân (C), mô sẹo tăng sinh... Chí Minh (ĐHQGHCM) khuôn khổ Đề tài mã số C2015-1824 Trang 55 Science & Technology Development, Vol 20, No.T2-2017 In vitro propagation of Xao tam phan (Paramignya trimera (Oliv. ) Guill .) ... cao chồi (mm) 90 100 120 100 80 150 B) Hình Cụm chồi (4 tháng tuổi) (A) tháng tuổi (B) tăng trưởng điều kiện ex vitro KẾT LUẬN Quy trình nhân giống in vitro Xáo tam phân (P trimera) thiết lập