Study on the in vitro growth of lily sorbonne bulblet

Untitled TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 20, SOÁ T1 2017 Trang 35 Tìm hiểu sự tăng trưởng hành in vitro ở Lily Sorbonne  Trần Thanh Thắng  Trần Thanh Hƣơng Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG H[.]

TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T1 - 2017 Tìm hiểu tăng trưởng hành in vitro Lily Sorbonne  Trần Thanh Thắng  Trần Thanh Hƣơng Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM ( Bài nhận ngày 12 tháng 12 năm 2016, nhận đăng ngày 10 tháng 04 năm 2017) TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng điều kiện sáng tối, nồng độ sucrose chất điều hòa tăng trưởng thực vật thay đổi tăng trưởng hành (còn gọi “củ”) từ chồi Lily điều kiện nuôi cấy in vitro khảo sát Các biến đổi hình thái, sinh lý sinh hóa q trình tăng trưởng hành phân tích Điều kiện sáng giúp chồi phát triển thành điều kiện tối giúp tạo hành Sucrose (90 g/L) giúp tế bào vảy hành gia tăng kích thước tích lũy tinh bột 6-Benzylaminopurine (BA 1,5 mg/L) kích thích phân chia tế bào, giúp gia tăng số lớp tế bào nhu mô số vảy hành Sự phối hợp sucrose 90 g/L BA 1,5 mg/L điều kiện tối cảm ứng mạnh phân chia, tăng rộng tích lũy tinh bột tế bào nhu mơ, từ giúp gia tăng kích thước số lượng vảy hành, kích thước trọng lượng hành Trong tăng trưởng hành có gia tăng cường độ hơ hấp, hoạt tính zeatin tích lũy tinh bột Mối liên hệ điều kiện sáng tối, nồng độ sucrose, chất điều hòa tăng trưởng thực vật, cường độ hơ hấp, tích lũy tinh bột tăng trưởng hành thảo luận Mơi trường MS có phối hợp sucrose 90 g/L, BA 1,5 mg/L zeatin 0,5 mg/L thích hợp cho tăng trưởng in vitro cho hành Lily, đặc biệt gia tăng số vảy hành (chiều rộng 2,5 cm, chiều dài 2,7 cm; 16-17 số vảy) Từ khóa: chất điều hịa tăng trưởng thực vật, điều kiện tối, Lily, sucrose, tăng trưởng in vitro củ hành MỞ ĐẦU Lily loài hoa đẹp, ưa chuộng có giá trị kinh tế cao Trong tự nhiên, Lily phát triển từ hột hành (còn gọi “củ”) Tuy nhiên, nảy mầm hột Lily cần thời gian dài (khoảng tháng) Bên cạnh đó, tỉ lệ nảy mầm hột thấp sau nảy mầm tăng trưởng chậm dẫn đến thời gian cần để hoa bị kéo dài Do đó, sản xuất, hành Lily thường sử dụng làm giống giúp rút ngắn thời gian để thu hoạch hoa [1] Sự tạo hành giống thực nhờ phương pháp giâm vảy hành vườn ươm hay in vitro Việc sử dụng kỹ thuật ni cấy in vitro có khả cung cấp số lượng lớn hành giống Do vậy, bên cạnh tạo in vitro, tạo hành giống phương pháp đặc biệt ý Vấn đề đặt hành thu nhờ kỹ thuật nuôi cấy in vitro thường có kích thước nhỏ (1–1,3 cm), số lượng vảy hành (5–7 vảy) [2] Khi chuyển vườn ươm, hành tăng trưởng chậm Sự tăng trưởng hành có nguồn gốc in vitro chủ yếu gia tăng kích thước vảy hành có sẵn, tạo vảy hành Trong sản xuất hoa Lily cắt cành, kích thước số vảy hành giống yếu tố định chất lượng thời gian thu hoạch hoa [3] Chính vậy, nghiên cứu tập trung vào tìm hiểu biến đổi hình thái trình tăng trưởng in vitro hành Lily, phân tích vài yếu tố sinh lý sinh hóa ảnh hưởng đến q trình này, đặc biệt gia tăng kích Trang 35 Science & Technology Development, Vol 20, No.T1- 2017 thước số vảy hành, làm sở khoa học cho việc cải thiện chất lượng hành giống VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Vật liệu Chồi Lily in vitro tuần tuổi có chiều rộng chiều cao khoảng 0,8-1 cm (có nguồn gốc từ ni cấy vảy hành in vitro), tăng trưởng môi trường Murashige Skoog với sucrose 30 g/L (MS) [4] Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện chiếu sáng tăng trƣởng hành Lily in vitro Các chồi Lily in vitro tuần tuổi cô lập cấy vào erlen 250 mL chứa 30 mL môi trường MS Các mẫu cấy đặt nuôi tối điều kiện ánh sáng 2000±200 lux (12/24 giờ), nhiệt độ 22±2 oC ẩm độ 58±3 % Thí nghiệm lặp lại lần, lần erlen, erlen gồm mẫu cấy Sau tuần nuôi cấy, số lá, chiều dài lá, chiều rộng chiều cao hành, số vảy/hành, số rễ, trọng lượng tươi khô hành xác định Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ sucrose tăng trƣởng hành Lily in vitro Các chồi tuần tuổi cô lập cấy vào bình ni cấy 100 mL chứa 30 mL môi trường MS với sucrose nồng độ 30, 60, 90 hay 120 g/L Các mẫu cấy đặt nuôi tối, 22±2 oC ẩm độ 58±3 % Thí nghiệm lặp lại lần, lần 15 bình ni cấy, bình ni cấy gồm mẫu cấy Sau tuần nuôi cấy, chiều rộng chiều cao hành, số vảy/hành, trọng lượng tươi khô hành xác định Khảo sát ảnh hƣởng chất điều hòa tăng trƣởng thực vật tăng trƣởng hành Lily in vitro Các chồi tuần tuổi lập cấy vào bình ni cấy 100 mL chứa 30 mL môi trường MS hay MS có bổ sung indole-3-acetic acid (IAA) hay 6Benzylaminopurine (BA) nồng độ 0,5; 1,0; 1,5 hay 2,0 mg/L Các mẫu cấy đặt nuôi tối, Trang 36 nhiệt độ 22±2 oC ẩm độ 58±3 % Thí nghiệm lặp lại lần, lần 15 bình ni cấy, bình ni cấy gồm mẫu cấy Sau tuần nuôi cấy, chiều rộng chiều cao hành, số vảy/hành, trọng lượng tươi khô hành xác định Khảo sát ảnh hƣởng phối hợp sucrose BA tăng trƣởng hành Lily in vitro Các chồi tuần tuổi lập cấy vào bình ni cấy 100 mL chứa 30 mL môi trường MS hay MS với sucrose 90 g/L BA 1,5 mg/L, riêng lẻ hay phối hợp Các mẫu cấy đặt nuôi tối, nhiệt độ 22±2 oC ẩm độ 58±3 % Thí nghiệm lặp lại lần, lần 15 bình ni cấy, bình ni cấy gồm mẫu cấy Sau tuần nuôi cấy, chiều rộng chiều cao hành, số vảy/hành, trọng lượng tươi khô hành, tỉ lệ mẫu tạo rễ xác định Xác định trọng lƣợng tƣơi trọng lƣợng khô hành Lily in vitro Trọng lượng tươi trọng lượng khô mẫu cấy xác định cân phân tích (PA213, Ohaus, USA) Trọng lượng tươi xác định cách cân trực tiếp Trọng lượng khô xác định sau mẫu sấy liên lục 110 oC phút 70 oC trọng lượng khơng đổi [5] Quan sát biến đổi hình thái Sự tăng trưởng vảy hành xác định sau cắt tay qua vị trí vảy hành nhuộm với phẩm nhuộm hai màu đỏ carminxanh idod Dưới kính hiển vi quang học (CKX41, Olympus, Japan), xác định bề dày vảy hành, số lớp tế bào nhu mơ, bề rộng trung bình tế bào nhu mô Sự diện hạt tinh bột tế bào quan sát nhờ nhuộm với dung dịch I2KI Phân tích biến đổi sinh hóa sinh lý Xác định hàm lượng đường tổng số tinh bột hành Lily in vitro Đường tổng số tinh bột có hành ly trích nhờ dung dịch ethanol, thực phản ứng màu với H2SO4, phenol xác định hàm lượng nhờ so TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T1 - 2017 sánh với đường chuẩn sucrose (hàm lượng đường tổng số) hay glucose (hàm lượng tinh bột) máy đo quang phổ (UV-2602, USA) bước sóng 490 nm [6] Kết giá trị trung bình lần lặp lại Đo cƣờng độ hô hấp Cường độ hô hấp (µmol O2/g trọng lượng tươi/giờ) mẫu cấy xác định điện cực oxygen dựa giảm tỉ lệ oxygen buồng đo (LeafLab2, Hansetech) theo thời gian, nhiệt độ 22oC, tối Kết giá trị trung bình lần lặp lại Ly trích đo hoạt tính chất điều hịa tăng trƣởng thực vật Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật: auxin (IAA), cytokinin (zeatin), gibberellin abcisic acid (ABA) có mẫu cấy ly trích lập cách sử dụng dung mơi thích hợp thực sắc ký mỏng silica gel 60 F254 (mã số 1.05554, Merck), nhiệt độ 29 oC với dung mơi di chuyển chloroform:methanol:acetic acid (80:15:5 v/v) Vị trí hormone tăng trưởng thực vật phát nhờ quan sát trực tiếp tia UV Hoạt tính hormone tăng trưởng thực vật đo sinh trắc nghiệm: diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.) cho auxin abcisic acid, tử diệp dưa leo (Cucumis sativus L.) cho cytokinin mầm xà lách (Lactuca sativa L.) cho gibberellin [7, 8] Áp dụng chất điều hòa tăng trƣởng thực vật tăng trƣởng hành Lily in vitro Các chồi tuần tuổi có chiều rộng chiều cao khoảng 0,8-1 cm tăng trưởng môi trường MS cô lập cấy vào erlen 100 mL chứa 30 mL môi trường MS với sucrose 90 g/L BA 1,5 mg/L hay MS với sucrose 90 g/l, BA 1,5 mg/L zeatin 0,5 mg/L Các mẫu cấy đặt nuôi tối nhiệt độ 22±2 oC ẩm độ 58±3 % Thí nghiệm lặp lại lần, lần 15 bình ni cấy, bình ni cấy gồm mẫu cấy Sau tuần nuôi cấy, chiều rộng chiều cao hành, số vảy/hành, trọng lượng tươi khô hành xác định Chuyển hành Lily in vitro vƣờn ƣơm Các in vitro tuần tuổi cao 5–6 cm mang 2-3 lá, có 5–6 rễ với chiều dài 2-3 cm hành in vitro tuần tuổi có bề rộng 2,5, chiều cao 2,7 cm, trọng lượng 2,5 g, gồm 15–16 vảy hành chuyển sang phòng tăng trưởng với ánh sáng 2000±200 lux (12/24h), nhiệt độ 30 ± oC ẩm độ 77 ± % Sau tuần, hành trồng túi chứa tro trấu, đất phân chuồng (tỉ lệ 1:1:1) đặt vườn ươm với ánh sáng 19000 ± 500 lux, nhiệt độ 30 ± oC ẩm độ 77± % Phần trăm mẫu sống phát triển xác định sau tuần Xử lý thống kê Kết thí nghiệm phân tích chương trình thống kê SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) sử dụng cho Windows phiên 15.0 Sự khác biệt có ý nghĩa mức 95 % giá trị thể mẫu tự chữ số kèm theo KẾT QUẢ Ảnh hƣởng điều kiện chiếu sáng nồng độ sucrose chất điều hòa tăng trƣởng tăng trƣởng hành Lily in vitro Sau tuần nuôi cấy môi trường MS điều kiện sáng, chồi phát triển theo hướng tạo với hình thành thật; điều kiện tối chồi phát triển theo hướng tạo hành (Bảng 1, Hình 3A-B) Trong tối, chiều rộng chiều cao hành, số vảy/hành, trọng lượng tươi khô hành cao so với mẫu cấy đặt điều kiện có ánh sáng Số rễ khơng có khác biệt hai điều kiện nuôi cấy Trang 37 Science & Technology Development, Vol 20, No.T1- 2017 Bảng Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng tăng trưởng hành môi trường MS sau tuần nuôi cấy Điều kiện chiếu sáng T-Test Sáng Tối Chiều rộng hành (cm) 1,00 ± 0,00 1,78 ± 0,02 + Chiều cao hành (cm) 1,17 ± 0,17 2,37 ± 0,03 + Số lá/cây 2,33 ± 0,33 Chiều dài (cm) 5,43 ± 0,17 Số vảy/hành 5,33 ± 0,33 6,05 ± 0,12 + Số rễ/mẫu cấy 5,67 ± 1,67 6,00 ± 1,00 Trọng lượng tươi hành (mg) 442,67 ± 8,19 1229,51 ± 77,90 + Trọng lượng khô hành (mg) 111,33 ± 6,45 1163,56 ± 37,03 + (+), Các số trung bình hàng khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 (T-Test) (-), Khơng có tạo Chỉ tiêu theo dõi Sau tuần nuôi cấy môi trường có nồng độ sucrose khác nhau, chiều rộng hành, số vảy/hành, trọng lượng tươi khô hành đạt cao hành tăng trưởng môi trường với sucrose 90 g/L Chiều cao hành cao mẫu cấy tăng trưởng môi trường với sucrose 60 g/L hay 90 g/L (Bảng 2, Hình 3B-D) Bảng Ảnh hưởng sucrose nồng độ thay đổi tăng trưởng hành sau tuần nuôi cấy tối Nồng độ sucrose môi trường MS (g/L) 30 60 90 120 Chiều rộng hành (cm) 1,78 ± 0,02b 1,86 ± 0,03b 2,22 ± 0,03a 1,07 ± 0,07c Chiều cao hành (cm) 2,37 ± 0,03b 2,84 ± 0,04a 2,92 ± 0,03a 1,11 ± 0,06c Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 Sau tuần ni cấy mơi trường MS có bổ sung IAA hay BA nồng độ thay đổi (0,5–2,0 mg/L), chiều rộng, chiều cao, trọng lượng tươi khô Trang 38 Số vảy/hành 6,05 ± 0,12c 6,92 ± 0,16b 8,85 ± 0,14a 5,20 ± 0,14d Trọng lượng tươi hành (mg) 1229,51 ± 77,90c 2160,56 ± 62,54b 2487,45 ± 51,54a 449,85 ± 33,29d Trọng lượng khô hành (mg) 463,36 ± 31,89b 556,91 ± 63,79b 763,56 ± 37,03a 131,29 ± 34,64c hành khơng có gia tăng so với đối chứng Tất xử lý với BA giúp hành gia tăng số vảy Số vảy hành cao xử lý BA 1,5 mg/L (Bảng 3, Hình 3E) TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T1 - 2017 Bảng Ảnh hưởng IAA BA nồng độ thay đổi tăng trưởng hành sau tuần nuôi cấy tối Chất điều Nồng Chiều rộng Chiều cao hòa tăng độ hành (cm) hành (cm) trưởng (mg/L) thực vật Đối chứng (MS) 1,78 ± 0,02a 2,37 ± 0,03a b 0,5 1,22 ± 0,01 1,45 ± 0,03d b 1,0 1,22 ± 0,02 1,52 ± 0,04d IAA b 1,5 1,19 ± 0,01 1,71 ± 0,02cd b 2,0 1,18 ± 0,07 1,70 ± 0,33cd a 0,5 1,76 ± 0,03 2,13 ± 0,05ab a 1,0 1,72 ± 0,07 2,17 ± 0,03ab BA a 1,5 1,74 ± 0,03 2,16 ± 0,10ab a 2,0 1,75 ± 0,01 2,03 ± 0,05abc Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 Sau tuần nuôi cấy, phối hợp sucrose 90 g/L BA 1,5 mg/L giúp gia tăng số vảy/hành, trọng lượng tươi khô hành Chiều rộng chiều cao hành thay đổi (Bảng 4, Hình 3F) Bề dày vảy hành, số lớp kích thước trung bình tế bào nhu mơ vảy hành ngồi gia Số vảy/hành Trọng lượng tươi hành (mg) Trọng lượng khô hành (mg) 6,05 ± 0,12e 1229,51 ± 77,90a 463,36 ± 31,89a e 6,03 ± 0,27 721,27 ± 14,44cd 145,75 ± 33,71c e d 5,99 ± 0,13 666,46 ± 20,64 148,36 ± 30,83c d d 7,00 ± 0,07 672,17 ± 26,60 162,65 ± 28,36c e d 6,27 ± 0,10 686,23 ± 8,44 159,46 ± 33,44c c cd 11,68 ± 0,24 734,48 ± 15,18 157,91 ± 33,93c bc c 12,14 ± 0,14 783,34 ± 3,61 231,97 ± 35,56bc a b 13,84 ± 0,26 960,67 ± 7,28 282,04 ± 34,19b b c 12,56 ± 0,3 809,39 ± 9,89 209,12 ± 58,19bc tăng so với thời điểm bắt đầu nuôi cấy Bề dày vảy hành bề rộng trung bình tế bào nhu mô cao hành tăng trưởng môi trường MS với sucrose 90 g/L Số lớp tế bào nhu mô cao hành tăng trưởng mơi trường MS có bổ sung BA 1,5 mg/L riêng lẻ hay phối hợp với sucrose 90 g/L (Bảng 5, Hình 4) Bảng Ảnh hưởng phối hợp sucrose BA tăng trưởng hành sau tuần nuôi cấy tối Xử lý Chiều rộng hành (cm) 2,22 ± 0,03 Chiều cao hành (cm) 2,22 ± 0,03 Số vảy/hành Trọng lượng hành (mg) Tươi Khô 2487,45 ± 51,54 763,56 ± 37,03 Sucrose 90 g/L 8,85 ± 0,14 Sucrose 90 g/L 2,12 ± 0,23 2,81 ± 0,13 14,04 ± 0,68 2651,18 ± 69,61 878,91 ± 64,87 BA 1,5 mg/L T-Test + + + (+), Các số trung bình cột khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 (T-Test) Bảng Ảnh hưởng sucrose BA tăng trưởng vảy hành ngồi ni cấy tối Thời gian (tuần) Môi trường nuôi cấy Bề dày vảy (µm) Số lớp tế bào nhu mơ MS với sucrose 30 g/L MS với sucrose 90 g/L MS với sucrose 30 g/L BA 1,5 mg/L MS với sucrose 90 g/L BA 1,5 mg/L 1767,82 ± 32,45c 2536,32 ± 46,72b 2956,41 ± 55,22a 2708,46 ± 73,35b 2784,05 ± 48,12b 16,67 ± 0,67c 19,30 ± 1,42b 20,00 ± 1,52b 23,30 ± 1,63a 23,00 ± 1,33a Bề rộng trung bình tế bào nhu mơ (µm) 67,67 ± 5,67c 95,54 ± 10,89b 125,15 ± 11,48a 88,04 ± 9,58b 98,86 ± 13,13b Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 Trang 39 Science & Technology Development, Vol 20, No.T1- 2017 Bảng Ảnh hưởng phối hợp sucrose, BA zeatin tăng trưởng hành sau tuần nuôi cấy tối Xử lý Đối chứng * Zeatin 0,5 mg/L T-Test Chiều rộng hành (cm) 2,12 ± 0,23 2,51 ± 0,05 + Chiều cao hành (cm) 2,81 ± 0,13 2,78 ± 0,08 Số vảy/hành 14,04 ± 0,68 16,50 ± 0,65 + Trọng lượng hành (mg) Tươi Khô 2651,18 ± 69,61 878,91 ± 64,87 2580,26 ± 58,42 825,00 ± 54,52 (+), Các số trung bình cột khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 (T-Test) (*), MS với sucrose 90 g/L BA 1,5 mg/L Sự bổ sung zeatin 0,5 mg/L vào môi trường MS với sucrose 90 g/L BA 1,5 mg/L giúp gia tăng chiều rộng số vảy hành Chiều cao hành, trọng lượng tươi khơ hành khơng có thay đổi (Bảng 7, Hình 3G) phối hợp bổ sung sucrose 90 g/L BA 1,5 mg/L, giảm dần hành tăng trưởng môi trường với sucrose 90 g/L hay sucrose 30 g/l BA 1,5 mg/l, thấp hành tăng trưởng mơi trường với sucrose 30 g/L (Hình 1) Các biến đổi sinh hóa, sinh lý hành lily Sau tuần nuôi cấy, cường độ hô hấp đạt cao mẫu cấy tăng trưởng môi trường có phối hợp sucrose 90 g/L BA 1,5 mg/L, thấp mẫu cấy tăng trưởng môi trường với sucrose 90 g/L, sucrose 30 g/L BA 1,5 mg/L, thấp mẫu cấy tăng trưởng mơi trường với sucrose 30 g/L (Hình 2) Hàm lượng đường tổng số đạt cao hành tăng trưởng môi trường với sucrose 30 g/L, giảm dần hành tăng trưởng môi trường với sucrose 90 g/L hay sucrose 30 g/L BA 1,5 mg/L, thấp mơi trường MS có phối hợp bổ sung sucrose 90 g/L với BA 1,5 mg/L Hàm lượng tinh bột cao hành tăng trưởng mơi trường có Trang 40 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T1 - 2017 Sau tuần ni cấy, hoạt tính IAA mẫu cấy tăng trưởng mơi trường khác khơng có khác biệt Hoạt tính zeatin đạt cao mẫu cấy tăng trưởng môi trường với sucrose 90 g/L BA 1,5 mg/L, thấp mẫu cấy tăng trưởng môi trường với sucrose 30 g/L BA 1,5 mg/L thấp mẫu cấy tăng trưởng môi trường với sucrose 30 hay 90 g/L Hoạt tính gibberellin đạt cao mẫu cấy tăng trưởng mơi trường với sucrose 30 g/L Hoạt tính ABA đạt cao mẫu cấy tăng trưởng môi trường với sucrose 90 g/L (Bảng 7) Bảng Hoạt tính chất điều hịa tăng trưởng thực vật hành tăng trưởng môi trường khác sau tuần nuôi cấy tối Môi trường nuôi cấy MS với sucrose 30 g/L MS với sucrose 90 g/L MS với sucrose 30 g/L BA 1,5 mg/L MS với sucrose 90 g/L BA 1,5 mg/L Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh (mg/L) IAA Zeatin Gibberellin ABA 0,63 ± 0,02a 0,19 ± 0,02c 1,51 ± 0,01a 0,48 ± 0,01b 0,64 ± 0,01a 0,17 ± 0,02c 1,14 ± 0,02b 0,60 ± 0,01a 0,61 ± 0,02a 0,42 ± 0,02b 1,14 ± 0,01b 0,43 ± 0,01c a a c 0,65 ± 0,02 0,69 ± 0,01 0,08 ± 0,01 0,45 ± 0,01c Các số trung bình cột với mẫu tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 Sự phát triển hành Lily sau chuyển vƣờn ƣơm Sau tuần chuyển hành in vitro vườn ươm, số sống đạt 70 %, số hành sống đạt 100 % Các có chiều cao 10–12 cm với 5–6 (Hình 4A); Mỗi hành gồm 15-16 vảy, chiều rộng chiều cao hành đạt 2,7–3 cm (Hình 4B) THẢO LUẬN Khi đặt điều kiện có ánh sáng, chồi Lily tăng trưởng theo hướng tạo với hình thành có màu xanh diệp lục tố Ngược lại, đặt tối, chồi khơng hình thành dạng mà chủ yếu tăng trưởng dạng vảy hành, dẫn đến gia tăng kích thước trọng lượng hành (Bảng 1, Hình 3A-B) Có lẽ, ánh sáng hoạt hóa phytochrome làm kích thích biểu gene sinh tổng hợp gibberellin [9] Gibberellin có vai trị hoạt hóa enzyme thủy giải tinh bột dự trữ thành đường, nguồn chất cho hô hấp tế bào, cung cấp lượng cho hoạt động phân chia tế bào để tạo Trong đó, điều kiện tối, phytochrome khơng hoạt hóa, chồi tiếp tục tăng trưởng, hấp thu sucrose từ môi trường nuôi cấy dự trữ vảy dạng tinh bột [10] Như vậy, để tăng trưởng hành, chồi Lily in vitro cần nuôi cấy điều kiện tối Sự tăng trưởng hành gia tăng số lượng kích thước vảy hành (Bảng 4, Hình 1) Sự gia tăng kích thước vảy hành phân chia, gia tăng bề rộng tế bào tổng hợp tinh bột (Bảng 5, Hình 4, 5A) Quá trình cần lượng cung cấp hoạt động hô hấp tế bào Kết phân tích hàm lượng đường tổng số tinh bột cho thấy tinh bột đường có tương quan nghịch Trên môi trường nuôi cấy, hàm lượng tinh bột hành cao hàm lượng đường tổng số thấp (Hình 1) Sự tương quan nghịch nhu cầu sử dụng sucrose tế bào cho mục đích dự trữ dạng tinh bột vảy hành (Hình 5B) Theo Hans cộng (2011), tích lũy tinh bột cần nhiều lượng để hoạt hóa enzyme gắn đơn vị glucose vào chuỗi polyglucan [11] Do đó, hành tích lũy nhiều tinh bột ln có cường độ hơ hấp cao (Hình 2) Sucrose nguồn ngun liệu cho hoạt động biến dưỡng, cung cấp lượng Trang 41 Science & Technology Development, Vol 20, No.T1- 2017 chất cần thiết cho việc xây dựng cấu trúc tế bào tổng hợp tinh bột Theo Bùi Trang Việt (2016), hấp thu sucrose giúp tế bào gia tăng áp suất thẩm thấu, hấp thu nước tăng trưởng [5] Do đó, tăng nồng độ sucrose (từ 30 g/L – 90 g/L) giúp tăng bề rộng trung bình tế bào nhu mơ dẫn đến tăng bề dày vảy hành kích thước hành (bảng 5) Đồng thời với tăng kích thước tăng trọng lượng tươi khô hành (Bảng 2, Hình 3B-C) Tuy nhiên, nồng độ sucrose cao (120 g/L), nước từ tế bào di chuyển dẫn đến khả biến dưỡng mô cấy giảm, hành ngừng tăng trưởng (Bảng 2, Hình 3D) Tác động sucrose nồng độ cao dẫn đến giảm hoạt động biến dưỡng tế bào ghi nhận Yoshiji Tsuyoshi (1979) [10] Ngồi ra, hành tăng trưởng mơi trường có nồng độ sucrose cao có gia tăng hoạt tính ABA đồng thời với giảm hoạt tính gibberellin (Bảng 6) Sự tương quan thuận ABA nội sinh gia tăng tích lũy tinh bột ghi nhận quan thực vật hành hay củ vào trạng thái ngủ [5] Ngược với ABA, gibberellin nồng độ cao có vai trị cản dịng dinh dưỡng di chuyển quan dự trữ hoạt hóa enzyme thủy giải tinh bột thành đường dẫn đến ức chế tăng trưởng hành [12] Điều ghi nhận giống trồng Lily L amabile, L bulbiferum, L callosum [13] Như vậy, trường hợp hành Lily Sorbonne, gia tăng hoạt tính ABA chưa đủ mà cần phải có giảm hoạt tính giberellin hay nói cách khác tăng tỉ lệ ABA/gibberellin Trong tạo hành nhiều giống trồng Lily, dùng auxin cytokinin riêng lẻ có vai trị kích thích gia tăng kích thước trọng lượng của hành [14 – 15] Tuy nhiên, nghiên cứu này, việc bổ sung IAA riêng lẻ vào môi trường nuôi cấy không giúp gia tăng kích thước trọng lượng hành (Bảng 3) Kết phân tích hoạt tính IAA nội sinh không cho thấy khác biệt hành tăng trưởng môi trường nuôi cấy khác Điều Trang 42 khác biệt kiểu gene giống trồng Khác với IAA, bổ sung BA giúp gia tăng số lớp tế bào nhu mô đồng thời với gia tăng số vảy hành (Bảng 5-6, Hình 3E) Theo Bùi Trang Việt (2016), cytokinin có vai trị kích thích phân chia tế bào, hoạt hóa enzyme tổng hợp tinh bột đồng thời ức chế enzyme thủy giải tinh bột Ngồi ra, cytokinin cịn cảm ứng huy động dịng dinh dưỡng vào quan dự trữ, khởi phát liên hệ nguồn-bể giúp dòng dinh dưỡng theo libe để di chuyển tới nơi nhập cách kích thích biến dưỡng bể [5] Do đó, bổ sung BA 1,5 mg/L vào môi trường MS với sucrose 90 g/L kích thích mạnh gia tăng số lớp tế bào nhu mô, số vảy hành, trọng lượng tươi khô hành (Bảng 4-5) BA tác động lên tăng trưởng hành thơng qua tích lũy N6-2-isopentenyl adenine (cytokinin nội sinh dạng tự do) N6-2isopentenyl adenosine (cytokinin dạng liên kết) [16] Có lẽ, tạo cytokinin nội sinh kích thích phân chia tế bào vùng nhu mô vảy hành đồng thời với vùng bên mô phân sinh chồi dẫn đến gia tăng số lớp tế bào nhu mơ số vảy hành Chính vậy, phối hợp sucrose, BA zeatin (một cytokinin tự nhiên) cho kích thước, số vảy hành, trọng lượng tươi khô hành cao (Bảng 6, Hình 3G) Trên mơi trường này, hành đạt kích thước 2,5-2,7 cm với 14–16 vảy hành (Bảng 6), cao so với kích thước (1–1,3 cm) số vảy hành (5-7 vảy) (Kumar cs, 2007) [2] Khi chuyển sang điều kiện nhà lưới, tiếp tục hình thành hành tiếp tục gia tăng kích thước mà khơng có gia tăng số vảy tương tự ghi nhận Mei-Lan cs (2003) giống trồng Casablanca [3] KẾT LUẬN Chồi in vitro Lily Sorbonne phát triển thành với thật nuôi cấy điều kiện sáng tạo hành điều kiện tối Sucrose 90 g/L giúp tế bào vảy hành gia tăng kích thước tích lũy tinh bột BA 1,5 mg/L kích thích phân chia tế bào, giúp gia tăng số lớp tế bào nhu mô số vảy hành Sự gia tăng cường độ TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T1 - 2017 hơ hấp, hoạt tính zeatin tích lũy tinh bột cần thiết cho q trình tăng trưởng hành Mơi trường MS có phối hợp sucrose 90 g/L, BA 1,5 mg/L zeatin 0,5 mg/L thích hợp cho tăng trưởng hành Study on the in vitro growth of Lily Sorbonne bulblet  Tran Thanh Thang  Tran Thanh Huong University of Science, VNU-HCM ABTRACT stimulated the division and size of the parenchyma In this study, the effects of light and dark cells, which increase the number and size of scales condition, sucrose concentration, and plant growth and size and weight of the bulblet Respiratory rate, regulators on the in vitro growth of bulblet from Lily zeatin content and starch accumulation were Sorbonne shoot were studied Morphological, increased in the bulblet growth The correlation of physiological and biochemical changes in the bulblet light condition, sucrose concentration, plant growth were analyzed Shoots in the light condition hormone, respiration rate, starch accumulation, and developed into plant while shoots in continuous bulblet growth were discussed The combination of 90 darkness formed bulblet Sucrose (90 g/L) increased g/L sucrose, 1.5 mg/L BA and 0.5 zeatin mg/L in dark the size of scale and starch accumulation of bulb 6strongly induced the growth of in vitro Lily bulblet, Benzylaminopurine (BA 1,5 mg/L) stimulated the especially the number of scale divison of parenchyma cell The combination of 90 g/L sucrose and 1,5 mg/L BA in dark condition Key words: Dark condition, in vitro bulblet growth, Lily, sucrose, plant growth regulators TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] T.T Vân, V.T Đông, Cơ sở khoa học kỹ thuật sản xuất hoa Lily cắt cành, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội (2005) [2] S Kumar, V Awasthi, J.K Kanwar J.K, Influence of growth regulators and nitrogenous compounds on in vitro bulblet formation and growth in oriental Lily, Hort Sci., 34, 2, 77–83 (2007) [3] L Mei-Lan, D Chakrabarty, K.Y Paek, Growth of Lilium Oriental hybrid „Casablanca‟ bulblet using bioreator culture, Scientia Horticulturae, 97, 41–48 (2003) [4] T Murashige, F Skoog, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Plant Physiol, 15, 3, 473-497 (1962) [5] B.T Việt, Sinh lý thực vật đại cương, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh (tài liệu lưu hành nội bộ) (2016) [6] J Coombs, G Hind, R.C Leegood, L.L Tieszen, A Vonshak, Techniques in bioproductivity and Trang 43 Science & Technology Development, Vol 20, No.T1- 2017 photosynthesis, In: Measurement of starch and sucrose in leaves, Pergamon press (1987) [7] H Meidner, Class experiments in Plant Physiology, George Allen and Unwin, London, (1984) [8] B.T Việt, Tìm hiểu hoạt động chất điều hòa sinh trưởng thực vật thiên nhiên tượng rụng "bông" "trái non" Tiêu (Piper nigrum L.), Tập san khoa học ĐHTH TPHCM 1, 155–165, (1992) [9] K Carina, R Quirin, D Julia, B Emmanouil, R René, S Claus, LLM-domain B-GATA transcription factors promote stomata development downstream from light signaling in Arabidopsis thaliana hypocotyls, The Plant Cell, 25, 8, (2016) [10] N Yoshiji, O Tsuyoshi, In vitro bulblet formation from leaf segments of Lilies, especially Lilium rubellum Baker, Sci Horticulture, 11, 379–389 (1979) [11] W.H Hans, P Birgit, H Fiona, Plant Biochemistry, Elsevier, London, (2011) Trang 44 [12] P.J Davies, Plant hormones, Kluwer Academic Pulisher (1995) [13] J.C Antonio, C Christoph, Sucrose and starch catabolism in the anther of Lilium during its development: a comparative study among the anther wall, locular xuid and microspore/pollen fractions, Planta, 225, 1573–1582 (2007) [14] L Bacchetta, P.C Remotti, C Bernardini, F Saccardo, Adventitious shoot regeneration from leaf explants and stem nodes of Lilium, Plant Cell Tissue Organ Cult, 74, 37–44, (2003) [15] X LingFei, M FengWang, L Dong, Plant regeneration from in vitro cultured leaves of Lanzhou lily (Lilium davidii var unicolor), Sci Hortic, 119, 458-461 (2009) [16] A Carol, M Václav, B Alena, K Miroslav, Endogenous cytokinin accumulation and cytokinin oxidase activity during shoot organogenesis of Petunia hybrida, Physiologia Plantarum, 105, 1, 141–147 (1999) TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SOÁ T1 - 2017 C B A D F E G Hình Các hành Lily tăng trưởng môi trường khác sau tuần nuôi cấy điều kiện sáng hay tối (A) Sucrose 30 g/L, sáng (B) Sucrose 30 g/L, tối ( C) Sucrose 90 g/L, tối (D) Sucrose 120 g/L, tối (E) BA 1,5 mg/L, tối (F) Sucrose 90 g/L; BA 1,5 mg/L; tối (G) Sucrose 90 g/L; BA 1,5 mg/L; zeatin 0,5 mg/l, tối Trang 45 Science & Technology Development, Vol 20, No.T1- 2017 A B Hình Sự tăng trưởng (A) hành (B) Lily sau tuần vườn ươm A C B D Hình Ảnh hưởng sucrose BA tăng trưởng vảy hành sau tuần nuôi cấy (A) MS với sucrose 30 g/L; (C) MS với sucrose 30 g/L BA 1,5 mg/L (B) MS với sucrose 90 g/L; (D) MS với sucrose 90 g/L BA 1,5 mg/4 Trang 46 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T1 - 2017 Hình Sự phân chia tế bào nhu mô (A) diện hạt tinh bột (B) vảy hành sau tuần ni cấy mơi trường MS có bổ sung sucrose 90 g/L BA 1,5 mg/L Trang 47 ... bulb 6strongly induced the growth of in vitro Lily bulblet, Benzylaminopurine (BA 1,5 mg/L) stimulated the especially the number of scale divison of parenchyma cell The combination of 90 g/L... light condition, sucrose concentration, plant growth were analyzed Shoots in the light condition hormone, respiration rate, starch accumulation, and developed into plant while shoots in continuous... cells, which increase the number and size of scales condition, sucrose concentration, and plant growth and size and weight of the bulblet Respiratory rate, regulators on the in vitro growth of bulblet