Đang tải... (xem toàn văn)
Untitled Science & Technology Development, Vol 19, No T4 2016 Trang 32 Ảnh hưởng của benzyl adenine lên sự nuôi cấy in vitro hoa cái Sa Kê non (Artocarpus altilis (Park ) Fosberg) Hà Thị Tuyết Sương[.]
Science & Technology Development, Vol 19, No.T4- 2016 Ảnh hưởng benzyl adenine lên nuôi cấy in vitro hoa Sa Kê non (Artocarpus altilis (Park.) Fosberg) Hà Thị Tuyết Sương Võ Thị Bạch Mai Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM ( Bài nhận ngày 29 tháng 09 năm 2015, nhận đăng ngày 30 tháng 08 năm 2016) TÓM TẮT Sa Kê (Artocarpus altilis (Park.) Fosberg) đầu nuôi cấy, BA nồng độ mg/L kích thân gỗ nhiệt đới Ngồi giá trị dinh thích gia tăng kích thước hoa cái, đặc dưỡng, Sa Kê nguồn dược liệu quý giá biệt phù to phần bao hoa Sự gia tăng phận chứa nhiều hợp chất tự nồng độ 10 mg/L BA giai đoạn sau kích nhiên có hoạt tính sinh học Với mục đích cung thích hình thành mơ sẹo phần bao hoa cấp nguồn dược liệu thực phẩm với hoa Kết đo hô hấp hoạt tính chất suất cao, thời gian thu hoạch ngắn, chúng điều hòa tăng trưởng thực vật thảo tiến hành khảo sát ảnh hưởng nồng độ luận để làm rõ thay đổi sinh lý q trình ni cấy chuỗi hoa Sa Kê non benzyl adenine (BA) lên nuôi cấy in vitro hoa Sa Kê non Kết cho thấy giai đoạn Từ khóa: Artocarpus altilis (Park.) Fosberg, benzyl adenine, Sa Kê, mô sẹo, nuôi cấy in vitro MỞ ĐẦU Sa Kê (Artocarpus altilis (Park.) Fosberg) thuộc họ Dâu tằm (Moraceae), thân gỗ nhiệt đới [7, 9], 35 lồi thực vật xác định có Hiệp ước quốc tế tài nguyên di truyền thực vật cho lương thực nơng nghiệp [3] Ngồi giá trị dinh dưỡng, Sa Kê nguồn dược liệu q giá phận chứa nhiều hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học (terpenoid, flavonoid, chalcone, stilben, acid béo, ), hợp chất sử dụng dược phẩm với nhiều chức kháng lao, kháng khuẩn, vi rút, kháng nấm, kìm hãm hoạt động số enzyme tyrosinase, α-amylase α-glucosidase, chống ung thư, [10] Hiện nay, giới có nhiều nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc ly trích, phân tích thành phần hóa học khảo sát hoạt tính sinh học Trang 32 hợp chất thứ cấp từ phận Sa Kê Bên cạnh đó, việc vi nhân giống Sa Kê từ chồi đỉnh trưởng thành cho hiệu thấp, nguyên nhân tỉ lệ nhiễm khuẩn cao (do vi khuẩn nội cộng sinh chồi đỉnh ); mẫu bị hóa nâu hoại tử q trình ni cấy in vitro [4, 8] Mặt khác, Việt Nam việc nhân giống chủ yếu giâm, chiết cành từ mẹ với thời gian kéo dài thường làm ảnh hưởng đến đời sống suất mẹ Vì vậy, tiến hành khảo sát ảnh hưởng benzyl adenine (BA) lên nuôi cấy in vitro hoa Sa Kê non benzyl adenin (BA) nhằm mở hướng cho vi nhân giống Sa Kê tương lai TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T4 - 2016 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Chuỗi hoa Sa Kê non có chiều dài khoảng 1,5 – cm đường kính khoảng 0,5 cm thu hái huyện Chợ Lách – Bến Tre (Hình 1) Khử trùng mẫu vật Mẫu vật rửa xà phòng nước vơ trùng Sau lắc nhẹ với cồn 70 % khoảng phút Ngâm mẫu vật dung dịch vitamine C 25 mg/L citric acid 150 mg/L khoảng 10 phút, sau rửa nước cất vơ trùng Xử lý mẫu vật dung dịch HgCl2 0,1 % dung dịch Javel thương phẩm (NaOCl %) giọt Tween 20 Sau rửa nhiều lần nước cất vơ trùng Hình Chuỗi hoa Sa Kê non Ảnh hưởng BA lên nuôi cấy hoa Sa Kê non Chuỗi hoa sau khử trùng, cắt thành lát mỏng theo chiều ngang khoảng – mm đĩa petri có chứa khoảng 20 mL nước cất vô trùng Các lát cắt chuyển sang petri khác để khơ, sau ni mơi trường MS ½ có bổ sung BA từ 0,5 mg/L đến mg/L Sau 10 tuần nuôi cấy, tiếp tục tách lát cắt hoa thành cụm nhỏ (khoảng – 10 hoa) cấy chuyền sang môi trường MS ½ có bổ sung BA nồng độ 7,5 mg/L; 10 mg/L 12 mg/L Các mẫu cấy đặt nuôi nhiệt độ 28 oC ± oC, độ ẩm 55 % ± 10 %, ánh sáng 2000 lux ± 200 lux Quan sát biến đổi hình thái hình thành mơ sẹo mẫu hoa non qua thời gian nuôi cấy Quan sát hình thái giải phẫu Hoa Sa Kê tuần (đối chứng chưa cấy vào môi trường) qua tuần ni cấy mơi trường MS ½ có bổ sung BA mg/L BA 10 mg/L cắt theo hướng: dọc ngang; nhuộm hai màu đỏ carmin – xanh iod; quan sát kính hiển vi chụp ảnh Đo cường độ hô hấp Cường độ hô hấp mẫu hoa Sa Kê non ni cấy mơi trường MS ½ có bổ sung BA xác định thời điểm nuôi cấy khác máy đo trao đổi khí (Hansatech) 28 °C, tối Kết thể lượng oxygen thoát ra/gam trọng lượng tươi/phút Ly trích xác định hoạt tính chất điều hịa tăng trưởng thực vật nội sinh Trang 33 Science & Technology Development, Vol 19, No.T4- 2016 Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh mẫu hoa thời điểm nuôi cấy khác môi trường MS ½ có bổ sung BA mg/L chiết xuất phân tích mỏng silica gel, hệ dung môi methanol: chloroform theo tỉ lệ : (v/v), sau 100 mL hỗn hợp dung môi thêm vào ml dung dịch acetic acid, nhiệt độ 30 oC Hoạt tính IAA, Zeatin, GA3 ABA xác định sinh trắc nghiệm Hoạt tính IAA ABA đo sinh trắc nghiệm với diệp tiêu lúa Oryza sativa L Sự gia tăng chiều dài diệp tiêu lúa đo sau 24 giờ, tối Hoạt tính IAA tỉ lệ thuận với sai biệt chiều dài khúc cắt diệp tiêu so với chuẩn (dung dịch IAA mg/L) Hoạt tính ABA tỉ lệ nghịch với sai biệt chiều dài khúc cắt diệp tiêu so với chuẩn (dung dịch ABA mg/L) Hoạt tính zeatin đo sinh trắc nghiệm với tử diệp dưa chuột Cucumis sativus L Hoạt tính zeatin tỉ lệ thuận với sai biệt trọng lượng tươi tử diệp so với chuẩn (dung dịch zeatin mg/L) sau 48 chiếu sáng Hoạt tính GA3 đo sinh trắc nghiệm với mầm xà lách Lactuca sativa L Hoạt tính GA3 tỉ lệ thuận với sai biệt chiều dài trụ hạ diệp so với chuẩn (dung dịch GA3 mg/L) sau 72 chiếu sáng [2] Xử lý số liệu Các số liệu ghi nhận xử lý thống kê phần mềm Statistical Program Scientific System (SPSS), phiên 16.0 dành cho Windows Sự sai biệt có ý nghĩa mức p = 0,05 KẾT QUẢ Khử trùng mẫu vật Các chuỗi hoa non khử trùng dung dịch Javel thương phẩm (NaOCl %) dung dịch HgCl2 0,1 % thời gian khác Kết cho thấy, dung dịch HgCl2 0,1 %, với thời gian khử trùng phút, cho tỉ lệ mẫu sống không bị nhiễm cao (92,67 %) tất nghiệm thức (Bảng 1) Bảng Tỉ lệ mẫu sống không bị nhiễm sau tuần nuôi cấy môi trường MS ½ Thời gian khử trùng (phút) Tỉ lệ mẫu sống không bị nhiễm (%) Javel thương phẩm (NaOCl %) d HgCl2 0,1 % 0,00 ± 0,00 1,99 ± 0,58d 10,00 ± 1,15c 30,33 ± 3,48c 37,00 ± 2,08a 92,67 ± 3,71a 12 24,67 ± 2,03b 50,67 ±4,09b Các số cột mang chữ khác khác biệt có ý nghĩa p=0,05 Bảng Tỉ lệ gia tăng kích thước hoa sau tuần nuôi cấy mơi trường MS ½ có bổ sung BA nồng độ khác Môi trường nuôi cấy Tỉ lệ hoa gia tăng kích thước (%) MS ½ + BA 0,5 mg/L 1,40 ± 0,02d MS ½ + BA mg/L 19,77 ± 1,63c MS ½ + BA 2,5 mg/L 28,13 ± 2,75b MS ½ + BA mg/L 100,00 ± 0,00a Các số cột mang chữ khác khác biệt có ý nghĩa p=0,05 Trang 34 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SOÁ T4 - 2016 Ảnh hưởng BA lên nuôi cấy hoa Sa Kê non Sau tuần ni cấy mơi trường MS ½ có bổ sung BA nồng độ mg/L, 100 % mẫu hoa gia tăng kích thước (tỉ lệ mẫu gia tăng kích thước % số lát cắt ngang qua chuỗi hoa có gia tăng kích thước so với tổng số mẫu cấy môi trường) (Bảng 2, Hình 2) Sự gia tăng kích thước tiếp tục xảy tuần thứ tuần thứ 10 với xuất nhiều nốt nhỏ bề mặt bao hoa Hình Sự gia tăng kích thước hoa Sa Kê mơi trường MS ½ có bổ sung BA mg/L Trang 35 Science & Technology Development, Vol 19, No.T4- 2016 Tiếp tục tách lát cắt hoa môi trường BA mg/L tuần thứ 10 thành cụm nhỏ (khoảng - 10 hoa) cấy chuyền sang môi trường MS ½ có bổ sung BA nồng độ 7,5 mg/L; 10 mg/L 12 mg/L Sau tuần ni cấy, kích thước bao hoa tiếp tục gia tăng (Hình 3A), đồng thời nốt sần bề mặt bao hoa lớn dần màu xanh bao hoa giảm dần Đến tuần thứ 6, mơ sẹo hình thành vị trí nốt bao hoa (Hình 3B), nhiên mơi trường có bổ sung BA 10 mg/L cho tỉ lệ tạo sẹo cao (Bảng 3) Hình Hoa Sa Kê sau tuần (A) mơ sẹo hình thành bao hoa sau tuần (B) môi trường BA 10 mg/L Bảng Tỉ lệ tạo sẹo hoa Sa Kê môi trường bổ sung BA nồng độ khác Môi trường nuôi cấy Tỉ lệ hoa tạo sẹo phần bao hoa (%) MS ½ + BA mg/L 8,43 ± 0,43d MS ½ + BA 7,5 mg/L 20,46 ± 0,73c MS ½ + BA 10 mg/L 100,00 ± 0,00a MS ½ + BA 12 mg/L 53,16 ± 1,30b Các số cột mang chữ khác khác biệt có ý nghĩa p=0,05 Sự thay đổi hình thái giải phẫu Lát cắt dọc qua hoa tuần thứ cho thấy rõ gia tăng kích thước hoa so với tuần (Hình 4A, 4B) Bên cạnh đó, phẫu thức cắt Trang 36 dọc qua phần bao hoa tuần thứ cho thấy kích thước tế bào lớn gấp nhiều lần so với tế bào bao hoa tuần (Hình 4A, 4C) TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T4 - 2016 Hình Phẫu thức cắt dọc qua hoa Sa Kê tuần (A), tuần (B), gia tăng kích thước phần bao hoa sau tuần (C) mơi trường MS ½ bổ sung BA mg/L (1): Phần bao hoa; (2): bầu noãn hoa Sa Kê Tại nốt bao hoa, tuần thứ đến tuần 10, có số tế bào phân chia, dạng trịn chứa nhiều tinh bột (Hình 5A) Sau chuyển sang mơi trường có bổ sung BA 10 mg/L, tuần thứ 2, tế bào phía bên ngồi vị trí nốt bắt đầu tách rời có dạng hình bầu dục (Hình 5B) Đến tuần thứ 6, mơ sẹo hình thành với nhóm tế bào bên ngồi tách rời (Hình 6A), nhóm tế bào tiếp tục trì phân chia kéo dài tuần thứ (Hình 6B) Ngồi ra, quan sát hình thái giải phẫu cho thấy mơ sẹo hình thành phần bao hoa, phần bầu nỗn giữ ngun (Hình 7) Trang 37 Science & Technology Development, Vol 19, No.T4- 2016 Hình Phẫu thức cắt ngang qua nốt bao hoa tuần môi trường BA mg/L (A); tách rời tế bào bên nốt bao hoa tuần mơi trường BA 10 mg/L (B) Hình Mơ sẹo hình thành từ nốt bao hoa tuần (A); phân chia kéo dài tế bào mô sẹo tuần môi trường BA 10 mg/L (B) Hình Phẫu thức cắt dọc qua hoa Sa Kê sau tuần ni cấy mơi trường MS ½ có bổ sung BA 10 mg/L Trang 38 TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T4 - 2016 Bảng Cường độ hô hấp hoa sau 0, 4, 10 tuần ni cấy mơi trường MS ½ có bổ sung BA mg/L Cường độ hơ hấp (µmol O2/g trọng lượng Thời gian (tuần) tươi/phút) 0,20 ± 0,02c 0,28 ± 0,02bc 0,44 ± 0,07b 0,78 ± 0,06a 10 Các số cột mang chữ khác khác biệt có ý nghĩa p=0,05 Bảng Hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh hoa non mơi trường MS ½ có bổ sung BA mg/L sau 0, 4, 10 tuần nuôi cấy Hoạt tính (mg/L) Thời gian (tuần) 10 IAA 0,32 ±0,02d 1,17 ± 0,01c 1,92 ± 0,03b 2,57 ± 0,05a Zeatin 0,53 ± 0,02d 1,14 ±0,06c 1,70 ± 0,01b 2,14 ± 0,09a ABA 0,09 ± 0,05c 0,40 ± 0,22bc 0,84 ± 0,16b 1,44 ± 0,22a GA3 3,37 ± 0,07a 2,30 ± 0,05b 1,46 ± 0,03c 1,05 ± 0,01d Các số cột mang chữ khác khác biệt có ý nghĩa p=0,05 Sự thay đổi cường độ hô hấp Dưới tác động BA mg/L, cường độ hô hấp hoa bắt đầu tăng tuần tăng mạnh tuần 10 (Bảng 4) Sự thay đổi hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh Sau tuần nuôi cấy, môi trường BA 5mg/L, hoạt tính zeatin IAA nội sinh mẫu hoa bắt đầu tăng song song với nhau, tăng mạnh tuần 10 Hoạt tính ABA tăng nhẹ tuần đầu nuôi cấy tiếp tục tăng đến tuần 10, hoạt tính GA3 giảm dần qua tuần (Bảng 5) THẢO LUẬN Trong nghiên cứu chúng tôi, giai đoạn đầu nuôi cấy, tác động BA mg/L, tất hoa gia tăng kích thước đặc biệt phù to nhanh chóng phần bao hoa qua tuần nuôi cấy Auxin tác động lên tăng trưởng theo đường kính, cytokinin giúp gia tăng kích thước tế bào có diện auxin; cytokinin kích thích gia tăng kích thước tế bào trưởng thành [1] Hoạt tính zeatin IAA hoa tăng song song với từ tuần đến tuần 10, gia tăng đồng thời kích thích gia tăng kích thước tế bào phần bao hoa cách làm giảm pH vách tế bào (Hình 2, Hình 4) Ngoài ra, gia tăng zeatin nội sinh cộng với diện BA môi trường nuôi cấy kích thích mạnh gia tăng kích thước tế bào bao hoa phân chia mạnh vài nhóm tế bào dẫn đến hình thành nốt nhỏ bề mặt bao hoa (Hình 5A) Ngồi hoạt động tăng trưởng, kéo dài tế bào, kéo dài lóng, GA3 cịn có vai trị phát triển bầu nỗn, tạo trái,… [1] Tuy nhiên, điều kiện nuôi cấy in vitro, có lẽ hoa khơng thụ tinh, khơng cần có mặt GA3 để tham gia vào tạo trái Chính thí nghiệm chúng tơi, hoạt tính GA3 giảm dần qua tuần nuôi cấy giảm mạnh tuần thứ 10 môi trường BA mg/L Ngồi ra, gia tăng hoạt tính ABA tuần thứ 10 môi trường BA mg/L liên quan đến chuyển dần sang nâu nhạt hoa môi trường BA 10 mg/L sậm màu mơ sẹo (Hình 3) Trang 39 Science & Technology Development, Vol 19, No.T4- 2016 Quá trình hơ hấp cung cấp lượng tiền chất cho trình sinh tổng hợp, hoạt động tăng trưởng tế bào [5] Do đó, cường độ hô hấp mẫu hoa bắt đầu tăng mạnh tuần thứ tăng mạnh tuần thứ 10, tương ứng với gia tăng kích thước phân chia số nhóm tế bào để hình thành nốt bao hoa Ngồi ra, cường độ hô hấp thể nhu cầu lượng trình phân chia tế bào, tế bào phân chia có cường độ hơ hấp cao tế bào phân hóa [6] Chính vậy, mà gia tăng hô hấp tuần 10 tiền đề cho phân chia mạnh mẽ nhóm tế bào nốt cuối phân chia để hình thành mơ sẹo vị trí Mặt khác, gia tăng nồng độ BA môi trường nuôi cấy mức độ định thúc đẩy mạnh mẽ phân chia nhóm tế bào vị trí nốt bao hoa Chính vậy, nhóm tế bào tiếp tục phân chia để hình thành mơ sẹo vào tuần thứ mơi trường có bổ sung BA 10 mg/L (Hình 3B, 6A) Trên môi trường BA 7,5 mg/L BA 12 mg/L, tỉ lệ tạo sẹo thấp (Bảng 3), nồng độ thấp BA khơng đủ kích thích phân chia mạnh mẽ tế bào nồng độ cao làm ức chế phân chia tế bào Mơ sẹo hình thành dạng khối lớn có màu nâu nhạt, mơ sẹo tiếp tục tăng sinh, tế bào lớp mô sẹo Trang 40 tách rời trình phân chia Do tế bào có khuynh hướng tách rời nên mơ sẹo có dạng nhầy bề mặt bên ngồi (Hình 3A) Lúc này, tế bào sẹo bên ngồi có dạng hình sợi bầu dục, kéo dài tuần thứ (Hình 6B) Một kết khác đáng lưu ý cần tìm hiểu sâu nghiên cứu chúng tơi vị trí hình thành sẹo hoa Sa Kê non Tất mơ sẹo hình thành phần bao hoa, phần bầu nỗn giữ ngun (Hình 7) Có thể phần bao hoa nằm bên nên dễ dàng tiếp xúc với mơi trường ni cấy phần bầu nỗn bao bọc kín bên Hoặc bao hoa hoa Sa Kê non quan sinh dưỡng bình thường nên dễ dàng cảm ứng hình thành sẹo bầu nỗn KẾT LUẬN BA nồng độ mg/L kích thích mạnh gia tăng kích thước hoa Sa Kê, đặc biệt phù to phần bao hoa BA nồng độ cao (7,5 mg/L; 10 mg/L 12 mg/L) kích thích hình thành mơ sẹo hoa Sa Kê non Tuy nhiên, mơi trường ni cấy có bổ sung BA 10 mg/L cho tỉ lệ tạo sẹo cao Có điểm cần lưu ý sẹo hình thành từ phần bao hoa hoa Sa Kê non TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T4 - 2016 Effect of benzyl adenine on the in vitro culture of young female flowers of Breadfruit (Artocarpus altilis (Park.) Fosberg) Ha Thi Tuyet Suong Vo Thi Bach Mai University of Science, VNU-HCM ABSTRACT Breadfruit (Artocarpus altilis (Park.) Fosberg) is a woody tropical tree In addition to the nutritious value, breadfruit is also a precious medicinal source, because every part of it contains many natural compounds with biological activity With the aim of providing a pharmaceutical source cond food with high yield, as well as the short harvert time, we examined the effects of the concentration of benzyl adenine (BA) on the in vitro culture of young female breadfruit flowers The results showed that in the first phase of the culture, the concentration of mg/L BA stimulated an increase in size of each female flowers, especially in the calyx The increasing concentration of 10 mg/L BA stimulated the formation of callus in the calyx of each female flowers Roles of respiration rate and endogenus hormones were discussed to understand the physiological changes in the in vitro culture of young female breadfruit flowers Key words: Artocarpus altilis (Park.) Fosberg, benzyl adenine, callus, in vitro culture, breadfruit TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] B.T Việt, Sinh lý thực vật đại cương, phần II: Phát triển, Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hố Chí Minh (2000) [2] B.T Việt, Tìm hiểu hoạt động chất điều hòa tăng trưởng thực vật thiên nhiên tượng rụng trái non Tiêu (Piper nigrum L.) Tập san khoa học ĐHTH TPHCM, 1, 155–165 (1992) [3] FAO, The International Treaty on Plant Genetic Resources for Food and Agriculture Food and Agricultural Organization of the United Nations, Rome, Italy (2009) [4] J.E Duncan, J Rouse-Miller, In vitro propagation of Artocarpus altilis (Park.) Fosberg (breadfruit) from mature plant material In vitro Cell Dev Biol Plant, 36, 115–117 (2000) [5] L Tait, E Zeiger, Plant physiology, 3th edition, Sinauer Associates (2002) [6] M.T.N Tiếng, Thực vật cấp cao, Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh (2001) [7] S Deivanai, S.J Bhore, Breadfruit (Artocarpus altilis Fosb.) An underultilized and neglected fruit plant species Middle-east Journal of Scientific Research, 6, 5, 418–428 (2010) [8] S.J Murch, D Ragone, W L Shi, A.P Alan, P.K Saxena, In vitro conservation and sustained production of breadfruit (Artocarpus altilis, Moraceae): modern technologies for a traditional tropical crop Naturwissenschaften, 95, 99–107 (2008) Trang 41 Science & Technology Development, Vol 19, No.T4- 2016 [9] S.S Mukesh, J.H Boey, S Kumutha, D.V Bavani, K.Y Ling, B Kaveti, A Review on Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg (breadfruit) Journal of Applied Pharmaceutical Science, 4, 8, 091–097 (2014) Trang 42 [10] U.B Jagtap, V.A Bapat, Artocarpus: A review of its traditional use, phytochemistry and pharmacology, Journal of Ethnopharmacology, 12, 9, 143–-144 (2014) ... in vitro culture of young female breadfruit flowers The results showed that in the first phase of the culture, the concentration of mg/L BA stimulated an increase in size of each female flowers, ... With the aim of providing a pharmaceutical source cond food with high yield, as well as the short harvert time, we examined the effects of the concentration of benzyl adenine (BA) on the in vitro. .. 2016 Effect of benzyl adenine on the in vitro culture of young female flowers of Breadfruit (Artocarpus altilis (Park.) Fosberg) Ha Thi Tuyet Suong Vo Thi Bach Mai University of Science,